文摘
稻草(RS)是一种丰富,现成的农业废弃物,这显示了亚洲承诺作为一个潜在的原料生产乙醇。加强释放葡萄糖酶法水解,RS是使用氨水(27% w / w)在两种预处理温度:常温和60°C。统计分析显示相似的酶葡萄糖生产在为期3天的孵化后预处理温度。化学组成、红外光谱和EDX分析证实了葡聚糖和木聚糖固体预处理的保留,但显著降低木质素去除(60.7%)和二氧化硅。SEM分析显示混乱的表面和孔隙度的RS纤维进行预处理,从而提高纤维素对纤维素酶可访问性。结晶度指数从40.5上升到52.3%,说明纤维素的高曝光。有10% (w / v)固体预处理RS的载荷,同时糖化和发酵产生最终的乙醇浓度为24.6 g / L,对应于最大理论产量的98%。综上所述,氨水预处理是一种有效的方法来生成高度消化RS预处理生产生物乙醇和生物炼制行业展示了潜在的应用。
1。介绍
木质生物质乙醇生产从吸引了相当多的研究关注由于实现增长的能源危机和气候变化1,2]。稻草(RS)是一个副产品后大米谷物收藏。这个木质纤维素的废物已经提升为一个潜在的原料在乙醇生产在泰国和其它亚洲国家由于其唾手可得,丰度,它是非食品(3,4]。这种材料是一个很好的来源的糖微生物发酵的碳水化合物由于存在集中在细胞壁(5]。
RS细胞壁构成三个生物聚合物,即纤维素、半纤维素和木质素5]。纤维素的均聚物纤维二糖(葡萄糖)两个单位,联系在一起1,4-glycosidic债券。完整的纤维素水解产生葡萄糖,这是一种更可取的业界常用的发酵微生物的碳源(6]。半纤维素含有多糖的混合物的木聚糖代表一个主要部分。木聚糖是由木糖单位,联系在一起1、4-glycosidic债券形成木聚糖主链。通常,主链与一些糖(即取代。、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖)、糖酸(即。、葡萄糖醛酸)和阿魏ρ香豆酸,这取决于木聚糖的来源(6]。木质素是一个大型复杂的unrepeated酚醛聚合物单体。这大大有助于水传导和植物的防御系统。然而,疏水性和复杂结构(异质性)对生物处理和利用木质素构成挑战的6]。
从RS生产糖的酶反应的工业利益因为温和的条件和相对纯产品形成(1,5]。然而,在生物乙醇产业,木质生物质高效利用有限的顽固的性质(5- - - - - -7]。化学成分(半纤维素和木质素)和结构组织限制葡萄糖从纤维素酶的释放。僵化的、高度有序的组织使纤维素晶体和不溶性,从而防止酶和水分子进入多糖链(7]。此外,高聚合度使得纤维素微纤维长度长,这阻碍了酶法水解。此外,纤维素半纤维素覆盖;cellulose-hemicellulose复杂是与木质素进一步密封,提供了结构完整性和预防微生物攻击(酶促降解)6,7]。
氨水预处理是一个广泛研究的方法来改变结构和降低生物质对酶法水解的固执8- - - - - -13]。该方法在生物炼制产业潜力被应用,因为它分离生物质组件分为两个主要部分:碳水化合物、木质素选择性流由于脱木素。木质纤维原料的不同类型,包括纳皮尔草(8,10],黑麦秸秆[9],杨树[11),玉米秸秆(12],柳枝稷(13),与氨水进行预处理,这些报道解决化学成分变化正相关(特别是高木质素去除速率)和酶消化率。
理解化学成分和分子结构的生物质酶消化率是很重要的,因为这些数据可以给预处理效率方向发展,改善酶,酶制剂,可以克服使用衬底(7]。在这项研究中,我们与氨水进行RS,因为这个方法可以执行以相对较低的工作温度(小于100°C)和保护碳水化合物的固体进行预处理。碳水化合物的保留是一个决定因素对于一个成功的预处理方法由于糖的损失最小化。RS当时研究了预处理的超微结构显示结构改变和给原因改善酶水解和乙醇生产与生理变化有关。
2。材料和方法
我们跟着Phitsuwan等的方法。14),除非另有说明。
2.1。预处理
如前所述(执行氨水预处理14),小的修改。RS(栽培稻)收集到的稻田,在泰国,任何处理之前立即被风干。干RS是切成小块,1 - 2厘米大小使用剪刀和与机械混合搅拌机前预处理。混合RS是使用氨水浸泡在27% (w / w)氢氧化铵固体:液体的比例1:12在室温(25±3°C)为7天或60±3°C。然后使用固体从液相中检索和用水洗至中性除去抑制剂/杂质。使用固体干在60°C和地面约5毫米的颗粒大小使用咖啡研磨机。这种材料被用作酶水解和乙醇发酵生长的基质。
2.2。酶法水解
使用商业纤维素酶酶法水解(Cellic Ctec2)和木聚糖酶(Cellic Htec2)鸡尾酒(Novozyme、Bagsværd、丹麦)进行了如前所述[14]。纤维素酶和木聚糖酶剂量的15 FPU和100年徐/ g固体加载到1.5% (w / v)固体在10毫升的最后一卷50毫升猎鹰管。水解反应是使用50 mM柠檬酸缓冲在pH值为4.8,50°C,和动摇200 rpm 1 h,除非另有说明。水解反应是补充与叠氮化钠(0.2%)防止微生物的生长。玉米胚芽蛋白酶解物在适当的时间被分析葡萄糖浓度。葡萄糖浓度测定用葡萄糖测定试剂盒(Megazyme)。
2.3。成分分析
碳水化合物和木质素含量测定根据国家可再生能源实验室(NREL)分析方法15]。总之,抽提后的固体萃取受到酸水解的高压蒸汽和高压蒸汽水解介质vacuum-filtered和分析木质素和结构性碳水化合物含量。糖溶液离心和过滤0.45μm注射器过滤器。该滤液分析了使用高效液相色谱仪(高效液相色谱法;日本岛津公司、日本)配有Bio-Rad Aminex hpx - 87 p (Bio-Rad实验室、CA)和示差折光检测器(日本岛津公司RID-10A)来确定碳水化合物含量。分析柱操作在85°C使用HPLC-grade水作为流动相流速为0.6毫升分钟−1和一个运行时35分钟。木质素去除收益率计算使用以下方程(16]:
2.4。扫描电子显微镜(SEM)和能量色散x射线能谱(EDX)
扫描电子显微镜(JEOL地产- 6610 lv,东京,日本)被用来观察RS预处理前后的形态。样本金色涂布在成像之前溅射涂布机。
元素分析了利用能量色散x射线谱仪(牛津INCA350)加上SEM。
2.5。傅里叶变换红外(FTIR)光谱法
红外光谱被用来分析官能团的治疗和RS预处理样品。所有样本的红外光谱谱运行在一个优秀的UATR两个(美国沃尔瑟姆,MA)谱仪。
2.6。x射线衍射测量
未经处理的结晶度和表面性质和RS使用x射线衍射仪分析样品预处理(JEOL jdx - 3530 2千瓦,东京,日本)的扫描速率12°min−1从5°至50°和发电机在30 kV 30 mA。结晶度指数(CrI)使用以下公式计算: 在哪里我002年(2= 22°)晶体的峰值强度和峰值我001年( °)的峰值强度的非晶区色谱(17,18]。
2.7。酵母菌株,培养液的准备,和发酵条件
在这项研究中,我们采用的方法Phitsuwan et al。14)评价乙醇发酵效率。酿酒酵母Thermosac®干(Lallemand, GA)用于乙醇发酵。激活剂激活了发酵培养的酵母在50毫升中包含10 g / L酵母提取物,20 g / L胨(YP介质),和50 g / L葡萄糖在37°C和200 rpm一夜之间旋转瓶。文化在2720×g离心10分钟4°C,收集细胞,细胞和颗粒(约1.2 - -1.4 g湿重)与10毫升新鲜YP resuspended介质用于乙醇发酵。
乙醇发酵糖化和发酵(SSF)的方法(14)是在200毫升的总量。RS加载到一个预处理血清瓶500毫升的浓度10% (w / v)坚实的载荷。暂停1.2克酵母细胞在10毫升YP中型和纤维素酶和木聚糖酶酶的用量15 FPU和100年徐/ g固体被添加到反应介质。200毫升的最终反应体积与YP调整介质。瓶子配有橡胶塞,密封铝帽,和多孔气体释放的注射器针头。社保基金进行了37°C和200 rpm震动速度为96 h。文化的上层清液定期被确定葡萄糖和乙醇浓度。乙醇的浓度,分析了使用气相色谱法(gc - 2014模型:岛津制作所),火焰离子化检测器(FID)。
与prehydrolysis是由社保基金进行了酶法水解在50°C 3、6和16 h。之后,介质温度下降到37°C和酵母的悬架是补充道。酵母添加的时候被认为是0。发酵条件进行如上所述。
发酵效率计算使用以下方程: 在乙醇浓度测定是指总体数量的乙醇(g),分别是理论中葡萄糖生物质和0.51是乙醇葡萄糖的转换因子。
2.8。统计分析
使用JMP13统计软件进行统计分析(SAS研究所Inc .)。单向方差分析(方差分析)进行了95%的显著水平( )。为多个比较,单向方差分析其次是图基的测试( )进行检查治疗手段的区别。
3所示。结果与讨论
3.1。氨水预处理和酶水解
在先前的研究中,我们发现,氨水的RS在室温下是有效的预处理去除木质素和增强生物消化率(14]。对于工业应用程序,一个大容量可以构造预处理柜和站没有保护和温度控制。因此,温度的变化可能发生在白天,这变异可能影响预处理效率。
在泰国,温度昼夜时期通常范围从25到35°C。然而,在白天,预处理反应器内的温度可以达到60°C。因此,预处理温度的影响在室温(25°C)和60°C和培养时间进行了研究和评估对葡萄糖产生的影响。葡萄糖浓度的方法在室温和60°C 3到7天范围从1.43到1.72 g / L和1.24 ~ 1.65 g / L,分别(图1)。有趣的是,预处理温度和孵化时间的影响并没有导致显著不同葡萄糖生产( 为期3天的孵化后),表示图基的测试。此外,课程整体水解时间,到达高原屈服后3天,不同的基片预处理类似,糖产量从不同的基片预处理是类似的(大约3 g / L)(没有显示)。发生这种现象可能是由于高浓度的氨水使用。在室温或相似的葡萄糖产量60°C预处理后3天的可能意味着生物属性的同质性。进一步研究结构变化引起的氨水预处理,使用RS 60°C 7天被选中和指定为aRS之后,进行进一步的地形特征。
3.2。成分和扫描电镜分析
在这项研究中,我们关注成分变化的碳水化合物和木质素,因为它们表示为RS。表中的主要组件1展示了未经处理的RS和aRS之间的成分。未经处理的RS包含纤维素32.2%。预处理后,纤维素含量增加了12.1%。木聚糖含量可能保持不变,增加从12.4到13.3%。木质素含量从21.1下降到12.2%。木质素的减少是由于酯碳水化合物之间的联系和木质素的乳沟,导致木质素溶解(8,11,12]。木质素的主要损失导致增加碳水化合物的克aRS固体。
碳水化合物和木质素的实际变化决定的基础上未经处理的初始值。在这项研究中,不溶性固体预处理后的恢复了68.0%。葡聚糖和木聚糖的复苏产生了基于最初的葡聚糖和木聚糖含量93.6%和72.9%,分别。木质素的去除是60.7%。这些值与以前的报告(包括19]。
我们下一个试图使用扫描电镜观察aRS的形态学改变。图2(一个)显示了组织良好和完整的表面未经处理的RS。光滑的表面表示木质素纤维覆盖。预处理后,aRS的表面变得粗糙,紊乱(图2 (b))。高度扭曲的结构可以轻松hydrolysable木质纤维素部分。孔隙度的创建和加入纤维矩阵的分解发生由于木质素溶解。这个修改结构增加外部表面增强aRS的酶法水解。
(一)
(b)
3.3。红外光谱分析
红外光谱分析研究RS预处理后的化学和结构变化。红外光谱的峰值对应的分配木质纤维素的组件的功能组根据文献[20.- - - - - -24是列在表中2。很明显,治疗和aRS样本之间的红外光谱谱显示明显差异的强度和形状(图3)。在3400 - 3200和信号宽带2910厘米−1已分配的地伸展氢键和碳氢键,分别。这些乐队敏感特征的纤维素23]。地的减少吸收振动(3350厘米−1)农业研究所提出了氢键的断裂纤维素结构(24]。信号约1720厘米−1对应于C = O官能团的特征峰ester-linked乙酰,feruloyl,-coumaroyl团体之间的半纤维素和木质素22]。附近没有这个峰值表明去除木质素预处理通过酯键的乳沟。信号观察到约1432厘米−1对应于CH2弯曲的纤维素22]。木质素特征峰在1320(切断syringyl)和1268(愈创木基环切断)厘米−1(12)有显著降低。信号在900厘米−1也归因于,1,4 -糖苷键显示典型的纤维素结构(25]。这些结果是一致的化学成分分析和确认减少预处理后木质素和纤维素含量的增加。
3.4。XRD分析
CrI水晶木质生物质材料的比例,表明晶体的一部分生物质表面的接触。未经处理的RS和aRS的x射线衍射图表现出两个主要反映在222日和16°左右,分别代表结晶纤维素和非晶态化合物(17,18)(图4)。与未经处理的RS相比,峰高增加在aRS 22°显然是观察,表明更高的纤维素(曝光18]。广泛的驼峰围绕16°aRS略微增加,可能是由于无定形纤维素的存在。未经处理的RS和aRS的短剑是52.3%和40.5,分别。CrI的增加成正比的增加结晶纤维素的总固体、无定形木质素的大部分被删除。类似的结果增加的CrI早些时候报道了预处理的木质纤维素的生物碱(12,22,26]。
3.5。EDX分析
水稻占用从土壤水和营养物质和金属在其增长。金属元素,钙、镁、硅,已被证明对酶活性有正面或负面的影响。因此,金属离子在RS样本使用EDX分析生物质转换技术来提供有用的信息。EDX结果表明,未经处理的RS包含碳(41.81%)、氧(49.02%)和石英(9.15%)为主要成分(图5)。碳和氧的原子通常源于天然纤维。二氧化硅的相对较高的内容在RS常见,和9.15%的价值与其他报告是一致的(27,28]。预处理后,EDX光谱显示更高比例的碳氧比,这可能反映了纤维组件(29日]。硅含量降低了约三倍,表明预处理影响硅层。可能减少硅可能与木质素预处理去除,与木质素硅是包裹在水稻[半个28]。silica-lignin矩阵阻碍纤维素酶反应。因此,这个矩阵的减少有利于酶水解,因为更多的接触表面为多种纤维素酶水解纤维素。
(一)
(b)
3.6。乙醇发酵
分批发酵的aRS与高原料装入通过社保基金进行了研究。高固体加载是重要的糖浓度增加,反过来,乙醇产量。然而,在这项研究中,固体加载仅限于10%费用由于aRS的庞大财产和低含水量增加粘度和减少酶的系统效率。虽然酵母酿酒酵母Thermosac干燥用于目前的工作是一个nonxylose利用压力,过度的木聚糖酶Cellic Htec2结合纤维素酶Cellic Ctec2为了降低木聚糖的物理屏障纤维素可访问性纤维素酶和避免限制纤维素降解酶的活动。
纤维素酶和木聚糖酶用量15 FPU和100年徐/ g固体,社保基金发酵使用酿酒酵母产生最终的乙醇浓度的24.6 g / L 48 h后,对应于最大理论产量的98%基于葡聚糖(图的内容6:nonprehydrolysis)。理论的价值乙醇产量在这项研究与以前的报告在社保基金酿酒酵母(30.,31日]。
几个因素,包括底物特性、预处理方法、属性的酵母,酒精发酵和发酵过程参数,影响产量。在这项研究中,可能的解释的理论产量高乙醇处理如下。
(1)酵母文化。酵母酿酒酵母被激活的指数增长阶段之前,社保基金和相对较高的酵母细胞,从而导致没有迟滞期超过96 h社保基金(图6),提高乙醇产量30.,32]。此外,酵母菌株报道容忍对发酵抑制剂和高效发酵葡萄糖乙醇(33]。
(2)衬底预处理和衬底加载。纤维素的预处理方法生成一个高度消化的分数明显在当下研究(理化壁垒较低,即。,减少木质素和lignin-silica层和纤维素的接触)。使用基质用于社保基金是用水洗几次预处理后,从而降低抑制剂的浓度,从而降低酵母性能。衬底的加载,10%载荷的衬底预处理使传质,降低系统的粘性(32]。因此,这种基质加载使酶和水解产物的扩散,不得减少酵母的发酵能力。
(3)酶制剂。酶的选择用于社保基金是纤维素酶鸡尾酒Cellic CTec2,在结合半纤维素酶Cellic Htec2。这些酶的鸡尾酒是咄咄逼人的高级混合了多种纤维素酶,β-glucosidases,木聚糖酶为工业开发的使用(34]。酶鸡尾酒了高活动对木质纤维素的基板(34]。因此,协同交互的预处理、基质特性,酶和酵母文化可以提高乙醇产量用于社保基金体系。
Prehydrolysis指社保基金前一段时间内的酶法水解。这一步是提供最佳条件酶反应生成糖供给酵母接种在社保基金体系。这一步预计将增加系统中的液体体积,从而提高乙醇产量由酵母(35,36]。在这项研究中,prehydrolysis乘以3,6和16 h接种酵母测试来找到合适的时间,和他们的乙醇产量与社保基金(图6)。初始葡萄糖浓度增加增加prehydrolysis时间。酵母接种后,葡萄糖浓度大幅下降的初始值:42.0,49.7,和54.1 g / L为3、6和16 h prehydrolysis,分别出现零发酵后24 h。另一方面,葡萄糖浓度没有观察到传统的社保基金。这可能是因为酵母发酵率高于酶水解率在这些条件下。
乙醇浓度迅速增加在24 h和保持稳定之后在任何模式下测试。乙醇表示充足供应的突然增加葡萄糖的指数增长阶段的酵母。48 h后的最终乙醇浓度分别为24.6,25.1,24.7,和24.5 g / L为社保基金和社保基金prehydrolysis 3、6和16 h(图6)。有趣的是,乙醇产量和乙醇浓度从传统社保基金和社保基金与不同prehydrolysis时间具有可比性。这种现象是与先前的报告相一致的prehydrolysis大麦和玉米秸秆预处理在10%固体载荷之前社保基金并不影响最终的乙醇产量(35,36]。然而,这显然是观察到prehydrolysis明显液化不溶性固体,从而减少固体体积和粘度在反应器(图7)。这展示了潜在的增加社保基金的最终乙醇浓度增加可发酵糖(固体载荷)通过馈料式模式系统。
4所示。结论
RS的准备与氨水预处理在室温和乙醇生产60°C给类似的葡萄糖产量。结果扫描电镜、红外光谱、x射线衍射和EDX表示减少木质素预处理后和二氧化硅层,从而增加对酶法水解纤维素表面的接触。乙醇产量由社保基金10% (w / v)固体载荷产生最终的乙醇浓度为24.6 g / L,对应于98%的效率。尽管之前prehydrolysis社保基金并未提高乙醇产率和整体乙醇产量条件下研究,它明显增加反应堆的自由体积,从而允许增加更多的原料。因此,对于进一步发展,可以结合prehydrolysis馈料式操作社保基金以增加最终乙醇的浓度,从而使乙醇过程更加经济。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
作者想表达他们的感谢泰国国家研究委员会,蒙国王科技大学吞武里(KMUTT),泰国,在高等教育研究推广和泰国国家研究型大学项目,高等教育委员会办公室(2017),和泰国研究基金会(基金会)的金融支持。Chutidet Permsriburasuk KMUTT研究支持援助计划的本科学生。