文摘

聚氨酯(PU)和聚乙二醇(PEG)被用来准备一个多孔stent-covering材料控制的小干扰RNA (siRNA)。微孔聚合物电影准备使用聚氨酯和水溶性的聚乙二醇溶液浇铸方法;挂钩组件提取水膜微孔。这部电影蘸2%聚(甲基methacrylate-co-methacrylic酸)解决外套与阴离子聚电解质聚合物薄膜。膜表面的化学成分是由傅里叶变换红外(FTIR)光谱特征及其结构形态由扫描电子显微镜(SEM)研究了。表面带负电荷的影响后的附件异硫氰酸荧光素(FITC)——标记siRNA-polyethyleneimine复杂到微孔聚氨酯膜和复杂的控释膜被荧光显微法调查。荧光显微镜显示PU表面强烈荧光的骨料FITC-labeled-siRNA-PEI复杂(测量到几个微米大小);此外,带负电荷的PU表面显示广泛而分散荧光。这些结果表明,带负电的微孔聚氨酯薄膜的建设是可行的,可以申请提高效率的siRNA交付通过一个stent-covering聚氨酯薄膜。

1。介绍

支架是小网格管用于治疗动脉变窄或nonvascular胃肠腔,上、下呼吸道和尿路狭窄造成的缓解症状(1- - - - - -11]。然而,支架植入手术是侵入性动脉周围的组织或nonvascular内部,和组织增生引起的,因为这侵犯性的过程。防止过度的组织增生和支架内腔的结果reobstruction,局部给药已经尝试通过支架,和许多抗增殖药物,包括西罗莫司和紫杉醇,被证明有效的降低过程的再狭窄率。除了抗增殖药物,一些小型干扰rna (siRNAs)有效地用来抑制组织增生后支架(12- - - - - -15]。siRNAs可以纳入stent-covering本地化siRNA交付组织支架。各种方法阻止合并到支架表面已经开发出来,因为核是一个带负电荷的聚合物,可以绑定到阳离子聚合物或阳离子化的表面通过库仑相互作用[16- - - - - -18]。带负电荷的siRNA可纳入阳离子聚合物如poly-L-lysine、聚乙烯亚胺(PEI),或壳聚糖形成一个复杂的,促进核细胞吸收。据报道Akt1 siRNA-PEI复合物固定化在透明质acid-coated支架表面,并与这些复合物治疗后大鼠VSMC线,抑制Akt1蛋白和下游信号蛋白调节细胞增殖是观察到的17,18]。

小干扰rna通过支架能够达到有效的交付,如果stent-covering聚合物薄膜微孔与一个更大的表面积,允许更多的附件siRNA-cationic聚电解质复合物在stent-covering。在这项研究中,我们开发了一个微孔聚氨酯涂料为负表面电荷调查是否增加聚合物薄膜表面积和带负电荷的聚合物薄膜的表面可以提高siRNA-cationic聚电解质复合物的吸附到stent-covering聚氨酯薄膜。

2。实验

2.1。材料

聚碳酸酯聚氨酯(PU), Chronoflex 85,购买从Advansource生物医学,Inc .(马、美国)。聚乙二醇(PEG) weight-averaged分子量(Mw)的8000年,聚乙烯亚胺(PEI)和一个25000兆瓦,和聚(甲基methacrylate-co-methacrylic酸)(P (MMA-co-MAA))与MAA含量14%,锰的15000和34000兆瓦的从奥尔德里奇在韩国购买(龙仁市、韩国)。荧光素isothiocyanate-labeled核(FITC-siRNA)从Bioneer有限公司购买(大田、韩国)。聚氨酯被肿胀净化/消溶胀过程;挂钩被透析纯化(分子量截止:3500年,光谱实验室Inc .)对蒸馏水一天,和P (MMA-co-MAA)被溶解在丙酮随后再沉淀纯化蒸馏水。试剂级二甲基乙酰胺(DMAC)和四氢呋喃(四氢呋喃)从奥尔德里奇获得。从Dharmacon Fluorescein-labeled siRNA得到(芝加哥,IL)。

2.2。PEG-PU薄膜制备

PEG-PU电影含有适量的挂钩是由溶解的聚合物组成的四氢呋喃和DMAC的助溶剂系统。挂钩是溶解在四氢呋喃浓度10% w / v,聚氨酯是溶解在DMAC的浓度10% w / v磁搅拌3 h在40°C。挂钩和聚氨酯的解决方案是混合的比例3:7准备30 PEG-PU电影和5:5比50 PEG-PU电影做准备。上面的解决方案(100μL)转移和扩散到盖玻片,紧随其后的是干燥的化学罩1 h,在对流烤箱在70°C 24 h,去除可能残留溶剂。

2.3。选择性溶解的挂钩多孔聚氨酯薄膜

多孔聚氨酯薄膜是由浸在水在37°C PEG-PU电影8 h。电影被转移到一个对流烤箱和干24小时的70°C。干多孔聚氨酯膜小心翼翼地存储在一个真空干燥器,以供将来使用。每个测量干膜的厚度和质量通过卡尺(日本三丰公司)和一个分析天平。

2.4。P (MMA-co-MAA)共聚物涂层

P (MMA-co-MAA)溶解在混合溶剂中乙醇/丙酮(1:3,v / v)准备0.1和2 w / v % P (MMA-co-MAA)解决方案。微孔聚氨酯膜浸泡在P (MMA-co-MAA)解决方案在40°C 3 s,其次是在烤箱干燥24小时70°C。

2.5。整合siRNA-PEI复合物在多孔聚氨酯薄膜

FITC-siRNA-PEI复杂的(10μ米)是RPMI媒体准备的。聚氨酯薄膜涂有0.1 w / v % P (MMA-co-MAA) FITC-siRNA-PEI吸附在核糖核酸酶溶液清洗,用磷酸盐缓冲盐水洗净,并转移到培养板。Opti-MEM中等(100μL)被加入到培养板的井,紧随其后的是200μL (5μM FITC-siRNA-PEI复杂。板上覆盖着一个铝箔在室温下和孵化2 h。电影被转移到新鲜的盘子和洗与500年的两倍μL Opti-MEM。

2.6。描述

聚氨酯电影准备在各种条件下被ATR-FTIR评估(Bio-Rad FTS 3000 MX)。水接触角对微孔聚氨酯膜前后涂层与P (MMA-co-MAA)是衡量Phoenix-10(表面电光学有限公司、水、韩国)。

表面形态(顶部和底部)和横截面的检查准备的影片是由扫描电子显微镜(SEM、日立- 4700、日本)。FITC-siRNA-PEI整合到多孔聚氨酯薄膜是由荧光显微镜评估(BX-51、奥林巴斯、日本),并从微孔聚氨酯释放FITC-siRNA-PEI电影是监控荧光谱仪(美国热科学Fluoroskan提升FL)的激发波长555 nm和发射波长565 nm)。

3所示。结果

3.1。PEG-PU薄膜制备

图1显示30 PEG-PU膜的扫描电镜图像(包含30%的PEG)之前和之后提取工艺挂钩。盯住提取过程之前,没有观察到孔隙表面上方的电影(一个);然而,微裂隙存在面临的底面上盖玻片(b),和横截面显示没有毛孔但规模下结构(c)的存在。挂钩提取后,微孔隙可以看到顶部表面(d)、微孔隙和较低的表面上的分层结构(e)和相互关联的作用观察横截面(f)。结构层观察到封面上面临的下表面玻璃可能是由于水的容易渗透,吸引的亲水性玻璃和水性聚氨酯膜之间的层的形成和盖玻片。

的扫描电镜图像50 PEG-PU电影(包含50%的PEG)之前和之后提取过程如图挂钩2。挂钩提取之前,总量是观察到顶部(a),底部(b),减少表面。提取工艺挂钩后,聚合和微孔隙是观察而不是消失。因此,聚集在50 PEG-PU电影,观察数据2(一)-2(c),应由挂钩,这是经过从PEG-PU溶液中溶剂蒸发过程。盯住萃取、膜厚度降低了(数字2(c)和2(f)),这部电影出现stent-covering应用程序太弱。因此,我们决定调查只有30 PEG-PU膜的微孔膜制备支架的应用潜力。

图3显示的红外光谱光谱纯PU膜(a)和30 PEG-PU膜之前(b)和之后提取(c)挂钩。纯聚氨酯薄膜的红外光谱谱显示吸收乐队在3480厘米⁻¹仲胺,1725厘米⁻¹酰胺羰基(C = O),和1258厘米⁻¹醚C-O-C集团(19,20.]。至于30 PEG-PU复合膜,1110厘米的吸收带⁻¹是由于切断伸展的特征吸收挂钩(20.]。挂钩后提取、特征吸收带的挂钩不再存在,见图3(c),表明挂钩的完全删除。

3.2。多孔膜涂以P (MMA-co-MAA)

演示的P (MMA-co-MAA)在多孔膜层,P (MMA-co-MAA)涂层多孔聚氨酯薄膜被ATR-FTIR调查,结果如图所示4。

ATR-FTIR频谱的多孔聚氨酯膜,准备从30 PEG-PU挂钩提取后电影如图4(c),基本上是一样的聚氨酯膜,如图3(一个)。2%的ATR-FTIR谱图P (MMA-co-MAA)电影4(b)揭示了吸收乐队在1152厘米⁻¹切断拉伸的MMA和MAA酯集团在1200 - 1300厘米⁻¹为醚C-O-C伸缩振动,在1725厘米⁻¹拉伸乐队的丙烯酸羧基(C = O) P (MMA co-MAA) [21]。ATR-FTIR多孔聚氨酯膜涂以P (MMA-co-MAA)图4(一个)显示了P的叠加在1152厘米(MMA-co-MAA)电影⁻¹在1338厘米和多孔聚氨酯⁻¹。

3.3。水接触角

不同的聚氨酯薄膜的表面性质进行评估通过测量水的接触角如图5。纯聚氨酯薄膜表面表现出高度疏水特性与水接触角为80°(±2)(a)和这个值与纯PU(独特的表面性质22]。的接触角下降至58°(±1),聚氨酯薄膜时蘸0.1% P (MMA-co-MAA)解决方案3 s和干(b)。接触角下降进一步49°(±1),当浸渍溶液P (MMA-co-MAA) (c) 2%。这表明P的程度(MMA-co-MAA)涂层和薄膜的合成亲水性可以通过操纵控制的P (MMA-co-MAA)浓度。

3.4。对聚氨酯电影整合siRNA-PEI复杂

观察siRNA-PEI复杂阴离子聚合物涂PU和原始PU电影,FITC-siRNA-PEI配合物吸附到聚氨酯电影被荧光显微法评估。如图6,FITC-siRNA-PEI PU表面吸附了骨料几微米大小的测量。聚合存在膜表面的4 P (MMA-co-MAA)和聚氨酯涂膜涂层(b)。然而,影片涂上P (MMA-co-MAA)展览广泛的荧光分布以及强烈的荧光聚合。siRNA-PEI总量平均直径先前已报告80 - 90 nm的动态光散射(23]。siRNA占用负电荷;因此,它应该是好的溶解在水里。然而,核的负电荷中和与带正电的裴当它是包裹。FITC-siRNA-PEI总量中观察到的更大的规模相比,本研究报告在上面的引用可能是因为增加的疏水性授予的FITC标记siRNA-PEI总量。

强烈的荧光观察当多形核白细胞包括FITC-labeled脂多糖聚合,观察和分散荧光背景从孤立和分散的白细胞24]。我们强烈的荧光对象解释为骨料FITC-labeled siRNA-PEI复杂和广泛的分散荧光对象孤立FITC-labeled siRNA-PEI复合物。显然,孤立的浓度FITC-labeled-siRNA-PEI复合物增加当PU表面带负电。这可能是由于FITC-labeled-siRNA-PEI稳定的复合物通过库仑相互作用赋予的PU表面负电荷P (MMA-co-MAA)涂层。

3.5。荧光光谱测定法

累积的荧光强度FITC-labeled siRNA-PEI复杂,通过荧光光谱测定法PU膜和阴离子聚合物对聚氨酯膜,如图7。FITC-siRNA-PEI复杂的荧光强度释放控制聚氨酯电影最初是300年左右,和强度几乎线性增加约500(图2周7(b))。另一方面,FITC-siRNA-PEI复杂释放的强度带负电荷的多孔聚氨酯电影最初是在700年和强度急剧增加,达到1100(图7(a))。我们认为这个初始荧光强度增加的带负电荷的PU表面浓度的增加是因为上述FITC-labeled siRNA-PEI复合物。

后的初始破裂释放,释放FITC-labeled siRNA-PEI情结是稳定,和释放过程持续2周,在带负电的稳定释放率多孔聚氨酯薄膜大约是2倍的聚氨酯薄膜涂层。

我们解释这个缓慢释放的过程FITC-labeled siRNA-PEI复合物作为骨料的缓慢分解的结果。

4所示。结论

本文与负面微孔聚氨酯stent-covering膜表面电荷和增加表面积是生产提高交付siRNA-PEI情结;由扫描电镜微孔膜为特征,涂层与带负电荷的P (MMA-co-MAA)证实了ATR-FTIR和水接触角测量。的荧光图像FITC-labeled siRNA-PEI复杂的聚氨酯薄膜显示siRNA-PEI复合物存在聚集,带负电荷的PU表面分离的实体。荧光光谱测定法研究表明,siRNA-PEI复合物分离表面的两个阶段:初始破裂阶段和晚一小时内稳态阶段2周。引入阴离子电荷在聚氨酯表面似乎增强吸附的数量FITC-labeled siRNA-PEI PU表面复合物及其释放率。对于临床应用,进一步研究siRNA-PEI合并聚氨酯膜的稳定性在支架包装和灭菌过程是必要的。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持朝鲜的贸易、工业和能源的国家标准技术改进项目(没有。10049411)。