文摘

我们调查的影响实际上电纺聚已酸内酯的各种等离子治疗(PCL)支架的粘附和增殖人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)。PCL支架治疗在等离子体中创建O₂,在北半球₃左右₂气体在相同的条件。表面功能化plasma-treated样品确定使用x射线光电子能谱。细胞粘附和形态进行了扫描电子显微镜和等离子体处理对细胞粘附的影响和可行性评估细胞可行性试验(MTT测定)。结果显示最高的代谢活动HUVEC的PCL样品处理O₂和NH₃等离子体。因此,反映最好的粘附和细胞形态学上O₂和NH₃plasma-treated PCL样品已经达到3 h。此外,治疗O₂和NH₃PCL表面等离子体甚至刺激内皮细胞增殖在24小时60%计算,显示出显著改善药物的材料。相反,所以₂等离子体似乎更少的承诺相比,O₂和NH₃等离子体;但是,它还是比没有任何等离子治疗。因此,我们的结果重要的是有助于改善生物相容性PCL的聚合物,通常用于组织工程支架。

1。介绍

高分子材料是现在经常用于各种医疗应用包括人工植入物、组织工程支架,伤口敷料、药物输送系统(1- - - - - -4]。许多这样的应用程序通常需要修改聚合物的表面性能来改善其生物相容性、细胞粘附和增殖,生物活性官能团的附件5- - - - - -8]。各种方法如等离子治疗,嫁接聚合物刷,或者应用不同的涂料可以用于聚合物表面改性。

在过去的几十年,纳米纤维得到重视的潜在应用领域的技术应用。许多潜在的用途nanofibrous膜相关的高孔隙度、大的表面积,和小孔隙分布。有许多方法nanofibrous膜的制备;然而,最成功的方法是电纺。电纺的可以产生连续纳米纤维直径从亚微米直径缩小到纳米尺度通过带电喷射聚合物溶液(9,10]。

实际上电纺三维聚合物支架在组织工程的应用越来越重要,特别是在骨再生(11,12)和皮肤重建(13,14]。当细胞附着在脚手架,脚手架提供最佳支持和细胞生长条件导致一个新组织的形成。组织工程支架通常是由聚合物如聚已酸内酯(PCL)和聚乳酸(PLA) (15,16]。这类聚合物支架生物相容性和生物可降解的,这意味着没有必要删除它们从人体植入后,因为在活的有机体内他们缓慢降解无毒产品(17]。然而,这样的支架要求表面改性提高细胞粘附和增殖18]。等离子治疗是最有效的技术之一,因为它允许公司不同的表面官能团的聚合物。通过适当选择的气体可以操纵这些官能团和改变自己的本性,这种方式改变其表面润湿性和表面能量,产生剧烈影响蛋白质和细胞粘附[19- - - - - -21]。

一些作家用氧气或空气等离子体表面改性PCL,发现表面亲水性增加,表面能、表面粗糙度和PCL表面的氧官能团总量(22,23]。他们也观察到更好的依恋和成骨细胞的增殖细胞(18,24,25]。沃尔夫等人用氨气等离子体表面,发现修改并不影响小鼠成纤维细胞细胞生存能力(26]。氦和氩等离子体。两种等离子体导致的氧官能团PCL。的氦、氮官能团表面被发现治疗PCL。不幸的是,生物细胞反应改性PCL不是测试(22]。

因为不同的等离子体可以以不同的方式影响细胞粘附,此外,不同的细胞可以在同一表面上的表现也不同27),更系统地研究改性聚合物表面是必要的。在目前的调查,我们调查了PCL的表面修饰聚合物引起的氧(O₂),氨(NH)₃)或二氧化硫(₂等离子体处理。NH₃等离子体被选为引入氨基,在许多生物过程是重要的。这么₂等离子体缺乏科学文献,尽管众所周知,硫酸组可以发挥重要作用在antithrombogenicity表面(28,29日),而阿₂等离子体被用作控制,因为它通常是非常有效的实现良好的药物(27]。因此,我们已经测试了这些修改的影响细胞的粘附和增殖能力的人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

2。材料和方法

2.1。实际上电纺PCL支架的制造

电纺的进行了使用PCL 15 wt聚合物浓度的解决方案。%在丙酮。明确的解决方案没有任何浊度是15毫升塑料注射器的20量度钝尖针和实际上电纺的高电压直流(DC) 18 kV,流量为1毫升/小时,小费收集器15厘米的距离。薄铝片的近似尺寸10厘米×7厘米作为收集器。在应用使用高压电源直流电压高,流体喷射从针的尖端射精。飞机加速向目标,溶剂蒸发和聚合物纳米纤维沉积在纤维膜铝表。所有的电纺的过程进行了温度28°C和60%的相对湿度。

的扫描电子显微镜(SEM)图像伪造实际上电纺膜PCL图所示1。

2.2。等离子体处理

PCL样本处理派热克斯玻璃制成的放电管,长80厘米,直径4厘米。管与旋转泵泵操作的名义抽速80米³h⁻¹。6把的线圈安装在管子的中心。等离子体是由一个射频发生器通过匹配网络耦合线圈。发电机运行在标准频率为13.56 MHz,标称功率设置为150 W。等离子体点燃在电容模式(E-mode)。样本在等离子体中创建不同的气体:氧气(O₂),氨(NH)₃)或二氧化硫(₂)。压力设置为50。样本处理的余辉20厘米远离线圈。治疗时间是10秒。

2.3。表面特征

表面功能化plasma-treated样本是由x射线光电子能谱(XPS)。XPS表征了用XPS(组织XPS、物理电子学、慕尼黑,德国)。样本兴奋与单色Al Kα_1、2辐射在1486.6 eV /面积直径400μm。光电子与半球形分析仪检测定位在一个45°角对样品表面的正常。XPS测量光谱测量的传递能量187电动汽车使用的能源一步0.4 eV,而高分辨率光谱测量,通过能源23.5 eV使用一个步骤0.1 eV。额外的电子枪用于表面中和在XPS测量。所有光谱被引用的主要c1峰碳原子,这是赋值284.8 eV。实测光谱进行了分析使用MultiPak v8.1c软件(Ulvac-Phi Inc .,神奈川,日本,2006)从物理电子、谱仪提供的。

2.4。细胞粘附和形态学研究

人类脐静脉内皮细胞(HUVEC, ATTC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)在MEM培养基培养(美国Sigma-Aldrich)补充10%胎牛血清(的边后卫;美国Sigma-Aldrich), 100 U青霉素,1000 U链霉素,2毫米谷酰胺和镀在3000个细胞密度/厘米²。细胞粘附和形态学调查,细胞被播种密度的2×10⁴细胞在100年μL的介质上的聚合物(浓度:2.55×10⁴细胞/厘米²)和左3 h和24小时附加在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。细胞被播种在每个时间和等离子体改性聚合物在重复治疗条件。细胞被播种plasma-treated聚合物样品在30分钟内,等离子体处理后。

细胞粘附和形态学评估3和孵化24小时后才发现粘附细胞的差异后的头几个小时孵化,因为24小时后细胞通常已经适应不同表面条件和差异不明显了。

细胞粘附和形态进行了扫描电镜(SEM)。短暂,聚合物样品附带的细胞被固定在2%戊二醛(美国Sigma-Aldrich)磷酸缓冲溶液5分钟,其次是通过增加梯度乙醇脱水,然后vacuum-dried临界点的方法。最后的样本覆盖了一层薄薄的金和SEM分析了。对黄金蒸发佩奇仪器(682)从Gatan GmbH是一家(德国慕尼黑)使用。SEM分析使用JEOL地产- 840扫描电子显微镜(JEOL、东京、日本)。

2.4.1。MTT试验

HUVEC被播种和相同的方式培养的细胞粘附并通过扫描电镜形态调查。MTT-related的比色测定(EZ4U;基于奥地利)被用来确定细胞生长和生存能力,根据制造商的指示。方法是基于事实,少活细胞能够减少彩色四唑盐强烈彩色甲瓒衍生品。这种还原过程需要线粒体功能,后几分钟内灭活细胞死亡。短暂,经过3和24小时的HUVEC文化在不同改性聚合物表面中移除,聚合物样本与磷酸盐缓冲盐水冲洗,去除所有nonattached细胞。200μL新鲜汉克斯平衡盐溶液(hbs)与四唑混合剂添加到每个24-well的聚合物样品板。3和24小时孵化后,上层清液转移到96孔板和吸光度测量OD 570/690 nm和协同作用™HT标仪(美国生物科技仪器有限公司)。

2.5。统计分析

上述所有实验进行复制和独立至少重复三次,除非另有说明。获得的结果显示为均值±SE副本的文化。学生的以及用于测试效果不同等离子体修饰的PCL对HUVEC的附着力和代谢活动和价值被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

3.1。表面表征Plasma-Treated PCL

表面组成的各种plasma-treated样本推断XPS测量光谱表所示1。每个气体用于等离子治疗引起的聚合物不同的表面改性。氧等离子体处理的PCL表面氧化造成的,氧气的浓度,从22个原子%增加到32个原子%。相反,NH₃等离子治疗PCL样品减少氧气量引起的氧浓度下降到只有15原子%。这是由于北半球的离解₃在氢等离子体原子与氧气反应的聚合物。NH₃等离子治疗也引起的近4原子%的氮聚合物表面。

表面氧浓度plasma-treated PCL样本也在增加₂等离子体处理。此外,4原子%的硫被发现包含PCL表面。发现表面的氧₂plasma-treated PCL样本绑定到硫组而不是碳原子在文本后面解释。此外,小浓度的氮被发现表面的₂plasma-treated PCL样本。这不是不寻常的,因为许多作者发现少量的氮₂plasma-treated表面和它的存在解释了痕迹残留的氮气氛(30.,31日]。Collaud科恩等人提出了稳定的新成立的硫集团通过氢键与胺组,可以形成等离子体(30.],而荷兰人和Kropke提议(失活)表面自由基的反应没有也形成的等离子体(31日]。

得到更多的细节关于各种处理过程引起的表面官能团,我们进行了高分辨率的反褶积碳峰(图2)。不同浓度化学组如表所示2。为治疗PCL聚合物(图2(一个)我们可以发现碳碳(284.8 eV)以及切断(286.3 eV), O =切断组(288.8 eV)。这些含氧官能团的浓度增加后O₂等离子体处理和一个新的峰值为287.3 eV由于C = O组出现,而碳碳峰值下降(图2 (b))。

NH的情况₃等离子体处理(图2 (c))碳碳峰的强度增加,而其他峰的强度与氧气减少,这是在相关性很低氧浓度见表1。此外,一个新的峰值为287.7 eV出现,这是由于酰胺组O =碳氮;然而C = O组也可以存在。碳氮组接近切断出现峰值;因此,峰值约286.3 eV归因于切断和碳氮官能团。

所以₂等离子体处理(图2 (d))引发了一个新的c峰值约285.5 eV。由于碳氧官能团的浓度没有变化或甚至略有下降(表2),很明显,增加氧浓度观察表1是由于富氧硫的形成等组织c₃或c₄。即硫S2p峰值出现在大约168.6电动汽车,这是典型的高度氧化的硫组(28]。

因为等离子治疗和相关的表面改性可以显著影响表面润湿性能,我们测量水接触角在不同plasma-treated PCL聚合物。未经处理的样品的接触角是大约110°。NH的接触角略有增加₃等离子体,而在氧气等₂等离子体明显减少,达到了大约20°。这意味着,表面在氧气治疗₂等离子体是非常亲水,NH治疗₃等离子体非常疏水。

3.2。细胞粘附的研究

HUVEC的形态和粘附在不同plasma-treated PCL聚合物与SEM研究了两个时间间隔:后(图3和24小时3)。孵化的SEM图像3小时后被捕获的初始外观表面细胞得到遵循和适应。图3已经表明,3小时后,HUVEC的最好坚持NH₃-和O₂-plasma-treated PCL样本,而未经处理的,所以几乎没有区别₂plasma-treated PCL样本。24小时后,细胞已经完全坚持表面和实质性的区别之间的贴壁细胞数量的未经处理的样品和plasma-treated样本观察。再一次,最多的HUVEC在场的PCL表面上已经NH处理₃和O₂等离子体,既允许显著增加细胞粘附和可能引发不同的细胞信号通路,从而导致改善代谢活动和HUVEC的增长。

此外,类似形态的PCL样品处理O₂和NH₃等离子体,组成的多孔纤维结构很薄纤维纵横交错,由扫描电镜观察。众所周知,聚合物样品形态在细胞表面粘附过程中扮演着关键角色(32]。另一个重要影响细胞粘附表面的化学成分和表面官能团,由等离子体处理(33]。SEM和XPS分析的基础上,创造了条件₂和NH₃PCL表面等离子体是细胞粘附和增殖的最佳条件。细胞表现出长突起,传播在纤维表面覆盖的最大表面积足够的附件,然后将信号来进行扩散,形成组织。因此,大粘附后O₂和NH₃等离子体处理。药物的完整性取决于cell-matrix粘连和跨膜蛋白称为整合蛋白在这一过程中发挥着至关重要的作用[34]。

在所以₂plasma-treated PCL样本,等离子体处理后表面形态发生明显变化。纤维密度和厚,PCL样品的表面多孔少出现。这可能是潜在的整合蛋白的锚定受损的原因,随后减少细胞的粘附₂治疗PCL表面。

有这么₂介绍了等离子体处理硫官能团的表面。在文献中报道由不同的作者(28,29日),硫官能团显示antithrombogenic效应通过减少血小板的粘附和激活。这是极其重要的生产的假体植入人造血管移植等,总是在与血液直接接触。然而,细胞粘附聚合物表面含硫官能团没有出现有前途,因为SEM图像显示贫穷和受损细胞的粘附,虽然看来,一旦细胞附着在表面生长正常。这是支持的相对较高的MTT试验获得的信号₂plasma-treated PCL样品,稍后解释文本。

在未经处理的聚合物的大部分HUVEC出现萎缩,圆形,对HUVEC形态不典型。此外,很少在细胞治疗PCL表面观察到显示表面的附着力问题,这对细胞本身可能是不利的环境。细胞治疗PCL表面没有牢牢地附着在表面;由于PLC纤维形态发生明显变化,在它们之间被扭曲或捕获。

获得额外的数据对粘附细胞的代谢活动及其扩散对plasma-treated PCL样本,MTT测定(图4)。HUVEC播种后三个小时没有区别在观察他们的代谢活动₂plasma-treated PCL比未经处理的样品。然而,3小时后的代谢活动已经观察到显著增加O₂和NH₃plasma-treated PCL表面,而控制()。24小时后,HUVEC增殖这两个表面增加了逾60%的未经处理的样品相比,()。有趣的是,聚合物处理₂等离子体显示细胞生存能力增加40%未经处理的样品相比,尽管SEM图像显示HUVEC这些表面的粘附力差。

此外,24小时后细胞生存能力的显著差异也可以观察到在不同plasma-treated样本。可以观察细胞生存能力下降在PCL表面处理₂血浆,NH相比₃和O₂plasma-treated表面()。

总而言之,我们的研究结果清楚地表明,等离子体处理对细胞粘附和生存能力具有重要的影响,以及细胞形态。NH₃和O₂治疗导致HUVEC附着力强,生存能力。HUVEC也坚持这样₂等离子体treated-surface;然而,他们的粘附是贫穷和加重。然而,一旦细胞表面设法坚持他们通常进一步生长和增殖的能力。相反,治疗PCL样本代表最适合HUVEC粘附和生长的环境。增强细胞增殖在NH的情况下₃和O₂等离子体处理解释了官能团的存在有利于细胞增殖和由不同的表面形态。

4所示。结论

PLC聚合物与NH治疗₃阿,₂,所以₂等离子体以改变表面性质的样本(即。、形态、化学、和粗糙度)。我们正在寻找的最佳改性PCL表面允许最好的细胞粘附和增殖。等离子体处理使表面化学成分的变化和形态以及相关聚合物的疏水性,反映不同的聚合物表面粘附细胞的特征。根据文献,最好的细胞增殖是通常观察到温和的疏水性聚合物。我们的研究结果表明,表面形态和表面化学可以比表面疏水性更重要,因为我们没有plasma-treated适度疏水表面。使用各种等离子体表面允许合并不同的功能:各种碳氧官能团后O₂NH后氮等离子体处理,形成群体₃等离子体处理,氧化后硫组₂等离子体处理。MTT试验表明,改性的聚合物与O₂和NH₃等离子体显著增加细胞粘附和活力比未经处理的聚合物,证明NH的特点₃和O₂plasma-treated表面是最有利于细胞的粘附和增殖能力。有趣的是,增加HUVEC的可行性也观察到₂plasma-treated表面;然而,SEM图像₂plasma-treated HUVEC粘附表面显示不利的条件。较低的细胞粘附可以归因于改变纤维形态的PCL样本,所以治疗后₂等离子体。然而,一旦细胞设法坚持这个表面,他们能够正常生长和增殖进一步表明我们的MTT测定的高信号₂plasma-treated PCL的表面。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

罗宾·奥古斯汀伪造实际上电纺PCL支架,电气自动方式蕾斯尼克进行等离子体处理,尼娜Recek进行XPS分析,和尼娜Recek,海伦娜Motaln,塔玛拉Lah-Turnšek评估等离子体改性后的细胞生存能力和细胞增殖。罗宾·奥古斯汀,米兰MozetičNandakumar Kalarikkal,萨布托马斯参与讨论大纲和实施工作。尼娜Recek和米兰Mozetič写道。所有作者已阅读并做必要的修改之前提交论文的。

确认

这项研究是财务支持的斯洛文尼亚研究机构arr第十七(项目- 6782)。