文摘

聚合物被用于不同的领域。最近,聚合物材料被看好在分析区域由于其高性能和高一致性、样品预处理在这研究中使用。甲苯噻嗪中毒往往是在体液样本来自各种事故或者自杀。然而,甲苯噻嗪的内容难以精确检测由于基体效应测试实践。本文方法应用磷脂吸附高分子材料来确定甲苯噻嗪在血液和尿液样本,提出了开发和验证。与现有方法相比,该方法使用聚合物预处理有更广泛的线性范围2.0 - -2000.0 ng / mL甲苯噻嗪及其代谢物2,6-dimethylaniline血液和尿液和降低检测极限为2 0.3 ng / mL, 6-dimethylaniline和甲苯噻嗪血2和0.2 ng / mL, 6-dimethylaniline和甲苯噻嗪尿液。因此,该方法应用于测试实践的建议学术团体和商业组织。

1。介绍

各种聚合物给不同研究领域的机会来实现不同的功能。在最近的几十年里,天然聚合物通过嫁接征服他们的出生缺陷被修改,包括穷人溶解度和机械性能差1- - - - - -4]。同时,合成聚合物已经被设计来实现新的功能,如长期抗菌聚合物(5]。更重要的是,聚合物已被视为对强复合材料中最重要的组成部分,智能材料(6- - - - - -9和更精确的和更敏感的提取材料10,11]。特别是在分析领域,聚合物中扮演重要角色分离和净化处理新材料(12,13)和复杂的biosamples (14]。血液是一个复杂的示例,其中包含等离子,蛋白质,和其他跟踪干扰物,往往导致基体效应当使用电喷雾电离(ESI)技术。因此,血液样品制备分析过程是一个非常重要的一步。近年来,一些新的方法已经被开发和应用于血液样品制备,例如,蛋白质和磷脂去除板;它已经被用于目标移除血液样本的磷脂。协议可以尽可能地去除血液中干扰物,尤其是蛋白质和磷脂,导致降低基体效应和增强的复苏。协议的操作简单、方便,只需要进行板内的蛋白质沉淀,然后推动样品流经吸收器。由此产生的滤液质检测中可以直接使用。

甲苯噻嗪建议使用在各种各样的动物,包括狗、猫、马、鹿、抗焦虑、镇静、止痛的目的(2]。甲苯噻嗪的化学结构类似于吩噻嗪类,三环类抗抑郁药,可乐定。甲苯噻嗪是一种非常有效的α2肾上腺素兴奋剂,它可以刺激α2受体在中枢神经系统。当这些α2受体受到刺激,中枢神经系统降低去甲肾上腺素和多巴胺的释放,导致镇定剂的影响,止痛药,和肌肉松弛剂。甲苯噻嗪还会影响胆碱能神经系统,α1肾上腺素能受体和组胺系统[15]。据报道,甲苯噻嗪已经滥用了其麻醉效果故意或不小心中毒和刑事案件16,17]。人类的身体将显示中枢神经系统症状,如抑郁,抑郁的呼吸系统、心动过缓、低血压时甲苯噻嗪中毒。主要的甲苯噻嗪生物转化途径很可能噻嗪环故障,主要产品是最有可能2,6-dimethylaniline [15,18];甲苯噻嗪的结构和2,6-dimethylaniline是显示在图1。由于定性检测能力,色谱-光谱法已广泛应用于生物样品(19- - - - - -22]。清理和目标提取的血液和尿液样本已通过不同的样品制备方法,如液液萃取(米歇尔)和固相萃取(SPE) [11,22,23]。目前,甲苯噻嗪色谱、色谱/质谱法检测通常是方法。样品通常是蜂蜜和牛奶等动物食品(24,25]。对人类中毒,血液中检测目标是甲苯噻嗪(26,27]。

验证这种方法和创建一个可靠的样品制备方法定量确定甲苯噻嗪及其代谢物在体液,本文除磷脂技术应用于检测甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline体液样本。同时,通过比较结果验证了米歇尔和SPE。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

乙腈、甲醇、乙醚、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷(LC / MS年级,费舍尔科学、美国),和甲酸(美国罗伊色谱级)作为收到。水纯化使用Milli-Q净水系统(美国Billerica的微孔,MA),绿洲MCX®(30毫克/ 1毫升;水域),Cleanert®SLE-AQ(30毫克/ 1毫升,Bonna-Agela技术,中国),Ostro®96口井(30毫克/ 1毫升;水域)、甲苯噻嗪(纯度高,98.0%,J&K化学、中国),和2,6-dimethylaniline(纯度高,98.0%,J&K化学、中国)被用作收到,空白的血液是由重庆市血液中心,和空白尿液由健康实验室的研究人员。

2.2。制备标准和QC样品

甲苯噻嗪100 mg / L股票的解决方案和2,6-dimethylaniline被准备在10毫升乙腈溶解1.0毫克的化学物质。准备后,股票的解决方案被存储在−20°C到使用。溶液是由串行工作与乙腈稀释股票的解决方案。Matrix-matched校准标准和QC样品通过强化整个血液和尿液的适当体积混合解决方案工作。matrix-matched校准标准浓度的2、5、10、50、100、500和2000 ng / mL和三个QC样品,5点50,500 ng / mL准备整个血液和尿液。

2.3。仪表

质/女士进行了用日本岛津公司20系列液相色谱仪(日本岛津制作所Corp .)配备AB2000三重四极质谱(美国AB Sciex Pte . Ltd .)。色谱分离实现水域亚特兰蒂斯dC18(150毫米×3.9毫米,5μm LC列;温度:40°C,样本大小:20μL,流量:0.5毫升/分钟。流动相是包含0.1%甲酸水溶液中。B流动相乙腈溶液含有0.1%甲酸;流动相是程序运行在下列顺序:0 - 1分钟一个内容是90%,2 - 3分钟内容从90%下降到5%,3 - 6分钟一个内容是5%,6 - 7分钟一个内容从5%上升至90%,和7 - 8分钟内容是90%。

分析物的电喷雾电离(ESI)条件如下:氮作为喷洒气体(GS 65 psi),涡轮喷射气体(GS 65 psi),和窗帘气体(20 psi)。collision-activated离解(CAD)设置为中等水平,而离子喷雾电压为4000 V。住时间被设定为0.1秒,质谱扫描在正离子模式。

同时检测所有glycerophosphocholines (GPCho)使用质谱检测是基于小et al。27]。质谱参数AB2000三重四极质谱已被优化利用declustering潜力,入口的潜力,碰撞能量,和碰撞细胞180年退出的可能性,分别为7和5 V,。大规模的转变 监控在正离子电喷射模式。

2.4。样品制备

2.4.1。SPE

固相萃取是以前的出版物中描述11,28]。一个100μ与200年L样本混合μL 2%的甲酸,然后是涡10年代和SPE。样本混合物中提取了绿洲MCX SPE墨盒。墨盒是激活随后1毫升甲醇和1毫升2%甲酸酸化水权之前使用。墨盒是筛选了2毫升2%氨在甲醇,然后干流加热氮在40°C。最后,残留于100年重组μL初始流动相的解决方案。一个20μL的解决方案是注入到质/ MS系统进行分析。

2.4.2。系统性红斑狼疮

一个100μ与200年L样本混合μL去离子水,然后加载到Cleanert SLE-AQ墨盒。最小正压应用促进样品吸收到墨盒在不到10年代。吸着剂的分析物被允许平衡后10分钟,1.5毫升的分析物被筛选了萃取溶剂每次三次。萃取剂的筛选了通过应用微正压下从顶部,然后蒸发干燥的加热氮在40°C。最后,残留于100年重组μL初始流动相的解决方案。一个20μL的解决方案是注入到质/ MS系统进行分析。

2.4.3。蛋白质和磷脂删除墨盒

一卷300μL(乙腈被转移到一个Ostro 96 - 100盒,然后μL等离子体被添加到墨盒。Ostro 96 -那盒是手动关闭,漩涡。短的适度混合后,筒应用正压和滤液收集到一根塑料管(2毫升Axygen)。此时,滤液已经准备好立即质/ MS分析,但这种方法与其他方法比较具有较高灵敏度,它集中了下干燥氮气流在40°C, 100年重建μL的初始流动相的解决方案。一个20μL的解决方案是注入到质/ MS系统进行分析。

2.5。方法验证

Matrix-matched校准曲线被绘制峰面积(构造)与标称浓度的校准标准()。校正曲线的线性度是评价由加权最小二乘线性回归拟合校正曲线的权重因子。选择性是由平均调查结果从五个空白样品。检测极限(LOD)被设置在最低浓度的至少三个信噪比()比率与一个可接受的色谱峰的形状。量化的极限(定量限)的最低浓度比大于10。

经济复苏和基体效应评估通过重复6分析在3 QC样品(5、50和500 ng / mL)。恢复计算分析物的平均峰面积除以飙升之前提取的平均峰面积分析物提取后飙升。矩阵效应估计的平均峰面积除以分析物上升后提取的平均峰面积来自整洁的标准。

不确定的百分比偏差的平均值的结果对应的标称值。不精确表达的相对标准偏差百分比(%相对标准偏差)。盘中精密化验测定分析质量控制样品(5、50和500 ng / mL)在同一天()。

3所示。结果与讨论

3.1。SPE方法的优化

在当前的研究中,三种不同的提取方法,SPE,系统性红斑狼疮,除蛋白质和磷脂,选择比较。SPE与绿洲MCX高分子吸附剂筒,系统性红斑狼疮Cleanert SLE-AQ筒,与蛋白质和磷脂清除盒Ostro 96孔筒在方法开发了。这三种不同提取方法的提取效率进行评估通过提取人体血液与目标增加100 ng / mL。如图2与系统性红斑狼疮,甲苯噻嗪的萃取效率明显改善当使用乙酸乙酯洗脱溶液;经济复苏从20%上升到95%。然而,所有五个洗脱方案无法提取2,6-dimethylaniline有效;经济复苏只是从7%降至75%。甲苯噻嗪的萃取效率和2,6-dimethylaniline SPE根据文献[17)分别为81%和75%。相比之下,甲苯噻嗪的萃取效率和2,6-dimethylaniline Ostro 96 -筒是106%和103%,分别。很明显得出结论,Ostro 96孔筒最高提取率基于上述的比较。因此,Ostro 96 -盒是用来治疗样本。Ostro 96 -蛋白质和磷脂去除墨盒促进蛋白质沉淀技术目标的磷脂从血浆和血清样本,这是快速,简单,耗费更少的时间和样本,可以显著降低矩阵的效果。根据获得的结果由Bruce et al。29日),乙腈蛋白质去除效率比甲醇在血液样本。添加0.1%的甲酸乙腈也有利于蛋白质的去除。需要优化的参数评价方法开发的体积比乙腈的血液。四种不同的有机溶剂比例血液测试:1:1,2:1,3:1和4:1 (v / v)。100年μL的血液被用作血液样本。当血液的乙腈比例是1:1,样品溶液增厚,但没有蛋白质沉淀。比例增加到2时:1、甲苯噻嗪蛋白质回收率分别为87%和81%,2,6-dimethylaniline,分别,这意味着该蛋白质完全没有沉淀。当血液的乙腈比例进一步增加到3:1或4:1,经济复苏对甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline接近100%。考虑到敏感性,样本的稀释系数应尽可能少。因此,使用3:1的比例。

Glycerophosphocholines (GPCho)导致液体色谱-光谱/质谱分析(质/ MS)分析血液样本矩阵电离效应。磷脂降解性能评价的三种方法,在源碰撞诱导解离(30.)是用来监测主要GPCho的导致基体效应。血液样本进行预处理,提出了三种方法及其184.2 - -184.2离子夫妇相同的信用证条件下由MRM监控方法。结果如图3。很明显,不同预处理后的磷脂概要文件显著不同。作为保留时间2 - 4分钟表示,除磷脂由Ostro墨盒比其它两种方法更有效,尽管磷脂并不完全移除。也没有磷脂峰的质谱范围6.5 - -7.5分钟Ostro盒血液样本进行预处理的方法。相比之下,血液样本进行预处理,SPE和系统性红斑狼疮方法显示明显的磷脂的山峰。因此,可以得出结论:磷脂去除效率是按照以下顺序:Ostro盒> SPE >系统性红斑狼疮。Ostro墨盒有最好的除磷脂和最低的基体效应,大大提高了目标恢复和准确性。也可以提供其他潜在的益处,比如长LC列一生由于磷脂含量降低。关于预处理时间,Ostro盒方法需要最短的时间在三个,因为它只需要过滤,而SPE需要多个步骤程序激活和冲洗的萃取柱和系统性红斑狼疮需要等待时间5 - 10分钟到达平衡。换句话说,Ostro盒方法是最佳的三个高通量样品处理。

3.2。优化色谱分离

流动相组成和添加会影响目标分离和电离效率。两个有机溶剂,甲醇和乙腈,移动阶段的影响进行了调查移动阶段保留时间和峰的形状。甲醇作为流动相时,显示一个明显的高峰尾巴和其基础扩大。它也保留时间较长。相比之下,峰形状改进,保留时间短乙腈作为流动相时,牺牲基线噪音。甲苯噻嗪胺组和2,6-dimethylaniline在酸性条件下可以促进电离。0.05%、0.10%和0.15%甲酸加入流动相研究目标化合物在不同酸度的敏感性。结果(图中未显示)建议最高灵敏度0.10%甲酸。时没有显著改善灵敏度提高甲酸浓度从0.10%降至0.15%。添加甲酸为乙腈流动相的灵敏度大大提高甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline,足以抵消基线噪音。 Thus, the mobile phase composition was selected to be 0.10% formic acid in acetonitrile and water. Such mobile phase, with gradient elution, could be helpful to improve the peak shape and enhance ionization efficiencies.

3.3。优化检测女士

两个目标上的胺官能团化合物很容易质子化了的pH值较低的环境中,使这两个目标化合物适合正离子模式下进行分析。2、6-Dimethylaniline和甲苯噻嗪分子质子化了的观察在积极模式下的全光谱女士扫描吗122年和221年,分别调谐时一个标准的解决方案。前体离子的肯定后,应选择两个以上的产品,使用质分析。

然后执行MS / MS扫描每个前体离子;的主要碎片2,6-dimethylaniline在105年和77年被选来构造MRM转换与前体离子122(图4(一))。五大片段的甲苯噻嗪被观察到164年,147年,121年,105年,89(图4 (b))[25]。最后但并非最不重要,MRM过渡164年和89年211年被选来监控甲苯噻嗪的决心。甲酸为流动相的加入能提高离子化效率,目标反应和敏感性。优化的参数,包括DP、CE和级,表中列出1。

3.4。方法验证

在MRM模式下,高选择性测定甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline血液和尿液样本中被发现。典型的MS / MS谱的血液和尿液样品和空白的血液和尿液样本是描绘在图5。没有额外的山峰由于内源性物质会干扰检测甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline被观察到。钟表是0.3和0.2 ng / mL甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline在血液和尿液。的定量限分别为1.0和0.6 ng / mL甲苯噻嗪和2,在血液和尿液6-dimethylaniline表2。标准校准曲线在曲线线性范围2 - 2000 ng / mL的血液和尿液对甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline;线性回归方程在桌子上2。

恢复精度和基体效应(我)为每个QC样品6次重复分析。QC样品的解决方案包含5、50和500 ng / mL的目标化合物。结果总结在表2。提取回收率是一致的和大于93.8%,这表明,蛋白质和磷脂去除墨盒是甲苯噻嗪和2的最优,6-dimethylaniline。精度,评估的相对标准偏差(RSD)复制分析,通常小于9%。

自选择性HPLC-MS / MS方法可能会受到基体效应的影响的样本矩阵和干扰化合物代谢产物,研究了基体效应发展一个更具体的和可靠的方法。基体效应的分析物的范围从101.1到108.2%。这一结果表明,离子抑制或增强血液和尿液矩阵是微不足道的在当前的治疗方法。低的基体效应和一致的和可再生的恢复,这对生物分析法测定已被证明是可靠的。

3.5。应用到实际样品

一个36岁的女人摄取一定量的甲苯噻嗪与她的丈夫争吵后,成为无意识的。她立即被送到医院时,家人发现并被发现死在抵达医院。心脏血液样本收集主题的毒理学分析;甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline被确认和量化267 ng / mL 451 ng / mL整个血液样本。

4所示。结论

在这项研究中,一个HPLC-MS / MS方法量化的甲苯噻嗪和2,6-dimethylaniline血液和尿液样本的开发和验证。快速、敏感、特定、选择性和可再生的试验。同时,所需的试验样本量小和简单的蛋白质和磷脂清除盒提取没有额外的程序。敏感的方法成功地申请了甲苯噻嗪和2的检测,6-dimethylaniline在临床诊断和法医毒理学的血液样本。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的开放重庆工商大学的基础。