组合效应细胞粘附的生物分子及其固定化高分子性质增强Cell-Selective粘连

文摘

虽然表面固定的医疗设备和生物活性分子是一种最广泛使用的策略来改善生物相容性,生物材料的物理化学性质显著影响固定化分子的活动。这里我们研究的组合影响cell-selective生物分子和聚合物衬底的亲水/疏水性质的选择性内皮细胞的粘附(ECs)、成纤维细胞(的边后卫)和平滑肌细胞(smc)。控制聚合物基质,生物分子固定化在thermoresponsive聚N-isopropylacrylamide -有限公司(保利(NIPAAm - 2-carboxyisopropylacrylamide)有限公司-CIPAAm)嫁接玻璃表面。通过切换biomolecule-immobilized聚合物的分子构象,cell-selective粘附性能的评估。以防RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser) peptide-immobilized表面,所有细胞类型遵循无论表面疏水性。另一方面,表面tri-Arg-immobilized展品FB-selectivity表面是亲水的。此外,表面tri-Ile-immobilized展品EC-selective细胞粘附在表面疏水性。我们认为,拟议的概念,用于调查biomolecule-immobilized表面结合,产生新的生物材料是很重要的,这是高度要求对医用植入物材料和组织工程。

1。介绍

长期植入的医疗器械,如血管移植、细胞相容性和antithrombogenicity至关重要(1,2]。功能的实现可持续发展一直是一个挑战生物材料化学威胁生命的风险降到最低。

一个主要战略提供生物功能(例如,细胞粘附)医学应用的高分子材料是生物分子的固定使用细胞外基质(ECM)的蛋白质(3- - - - - -6),抗体(7),肽(8- - - - - -13),等等。细胞粘附是关键一步再生组织被植入手术。例如,药物可以增强血管移植提高内皮细胞的粘附(ECs)表面。更快的药物预防再狭窄的两个风险:血栓形成和血管内膜增生14- - - - - -16]。单层内皮细胞强烈的报道提供了antithrombosis效果。适当的内皮单层形成的第一步也是适当的细胞组织,抑制增长失控的平滑肌细胞和成纤维细胞,外层的侵入血管组织。

肽在细胞粘附功能聚合物显示成功。RGD (Arg-Gly-Asp),这是整合素配体序列,是一种最完善的生物分子,提供细胞粘附功能聚合物(17]。此外,从ecm展览各种肽细胞粘附性能。我们有报道说,短肽(3 mer 7 mer)提高不仅细胞粘附[18]还cell-selective粘附[19,20.]。ECM-derived 3 mer肽(CAG: Cys-Ala-Gly)增强EC粘连药物但抑制平滑肌细胞(SMC)粘附在实际上电纺血管支架组成的聚-ε己内酯在活的有机体内(21和抑制血小板粘附在材料表面22]。

通过我们的系统的细胞粘附肽的筛选,我们发现了两类粘附肽。一个展览中的一个严格的行为(RGDS和YIGSR)。其他更密切相关的主题在很大程度上取决于他们的理化性质,因此可能会接受一系列的序列变化。即不仅序列本身(cell-peptide中的交互通过(例如,RGD肽)]而且理化性质可以控制cell-selective粘附[19]。

Ile-containing肽(3 mer 7 mer)显示ECs的选择性粘附,但他们表现出负粘附效应对smc和成纤维细胞的边后卫。抗体和ECM-derived大型蛋白质相比,短肽可以自觉的合成和纯化。生产成本的保证纯度和便于构建医学材料,但类似于其他生物分子,多肽需要熟练的固定维持原来的性能。有几个可以减少生物分子性能未知因素,包括固定的副作用化学、结构/定向改变固定,固定的分子密度,或组合biomolecule-polymer兼容性的影响。理解这样的意想不到的影响的原因在生物分子固定在设计医疗设备是很重要的。

此外,聚合物本身的性质极大地影响细胞粘附。润湿性(23,弹性24),和几何25高分子材料的生物相容性影响因素至关重要。以前,我们报道了疏水性的水平polyNIPAAm同样可以改变的细胞粘附性能immobilized-RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser)肽(26- - - - - -28]。

根据这些观察,我们假设应该有一个组合效应的生物分子和聚合物固定化状态可能抑制/增强功能。调查这样一个biomolecule-polymer组合效果,我们设计了一个细胞分析平台,可以比较的总性能目标生物分子结合不同的聚合物特性运用thermoswitchable polyNIPAAm技术(图1)。由温度改变的状态biomolecule-immobilized polyNIPAAm允许相同的固定生物分子的性能试验作为聚合物的函数属性。

在这项工作中,我们应用聚(NIPAAm -细胞分析平台有限公司-CIPAAm) [26- - - - - -29日比较细胞粘附性能。具体来说,细胞粘附性能的变化和三种不同的细胞类型之间的偏好(ECs的边后卫,smc),我们称之为“cell-selective粘连”(图1),评估。结果表明,固定化生物分子表现取决于聚合物的结合状态和适当选择固定聚合物可能维持甚至提高cell-selective附着生物分子的性能。

2。材料和方法

2.1。保利(NIPAAm -的准备有限公司-CIPAAm)细胞分析平台

保利(NIPAAm -有限公司-CIPAAm)细胞分析平台准备使用表面原子转移自由基聚合(ATRP)技术(29日)(图2)。防水打印幻灯片眼镜和普通眼镜(10毫米×25毫米)(Matsunami玻璃工业、东京、日本)暴露在紫外线臭氧10分钟清洗。然后清洁玻璃平台将被放置在一个玻璃容器(chloromethyl) phenylethyl-trimethoxysilane(凝胶,Inc ., Morrisville, PA,美国)的硅烷化反应在90°C,随后3 h烤1 h在110°C。NIPAAm (Kohjin、东京、日本)的再结晶纯化n和光纯化学工业己烷(kouichi,大阪,日本)。

(2)- Benzyloxycarbonyl isopropylacrylamide (CIPAAmBz)是根据之前报道的合成和纯化协议(30.]。表面的玻璃平台,使硅烷化聚(NIPAAm -有限公司-CIPAAmBz)层是嫁接在丙胺(关东大化工、东京、日本)摩尔比为100:1 (NIPAAm: CIPAAmBz)免费ATPR引发剂在室温下17 h。在一个典型的程序,17.924 g NIPAAm(2摩尔/升),401毫克(CIPAAmBz 20更易/ L), 72毫克(8.99更易/ L)的铜(I) Cl(关东大化学)和10毫克(1.00更易/ L)的铜(II) Cl₂和光纯化学工业(kouichi)溶解在80毫升的脱气溶剂手套箱在氮气氛。使硅烷化的眼镜,200毫克(10.8更易/ L)的我₆TREN(日本东京三菱化学控股)和133毫克(10.7 mol / L)的4-ethylbenzyl氯(东京化工、日本东京),上面被添加到解决方案。反应被终止暴露空气解决方案。聚合物层状平台与丙胺和甲醇冲洗(Kishida化工、日本大阪)和真空下干燥。去的CIPAAmBz聚合物层是由酸性水解与甲磺酸和光纯化学工业(kouichi)。在一个典型的程序,37.5毫升(15卷%)的甲基磺酸溶解在212.5毫升的二氯甲烷(关东大化学)。polymer-grafted细胞分析平台是由酸性水解deprotected 15卷%甲磺酸二氯甲烷室温17 h。激活平台表面然后用二氯甲烷和甲醇冲洗的生物分子固定化的一步。

检查质量的合成聚合物,自由聚合物的分子量是由凝胶渗透色谱法(GPC)系统(TOSOH TSK-GELαTosoh, -2500年日本东京)配备了示差折光检测器(ri - 2031)在40°C。第一次透析聚合物溶液和纯水,然后应用到GPC。GPC测定证实,分子量()是6.95×10³克/摩尔(表1)。

2.2。保利(NIPAAm -生物分子固定化有限公司-CIPAAm)细胞分析平台

生物分子(di -或四肽)被固定到CIPAAm通过羧基组相同摩尔量的1-ethyl-3 -盐酸(3-dimethylaminopropyl)碳化二亚胺(EDC) (Dojindo实验室、熊本、日本)在室温下纯水在潮湿大气中17 h。然后下平台与纯水冲洗和干燥真空,直到细胞化验使用。Gly-Arg (mono-Arg) Gly-Ile (mono-Ile) Gly-Arg-Arg-Arg (tri-Arg)和Gly-Ile-Ile-Ile (tri-Ile)(纯度> 90%)合成了Biomatik(剑桥,加拿大)和RGDS(纯度> 98%)购买的肽研究所(日本大阪)被用作固定生物分子。

2.3。Biomolecule-Immobilized保利(NIPAAm -的特性有限公司-CIPAAm)细胞分析平台

描述细胞分析平台,x射线反射率(XRR)进行Rigaku ATX-G (Rigaku、东京、日本)操作与铜Kα辐射(0.154海里)。接枝聚合物密度,(链/纳米²制造聚合物层的),使用方程计算,在那里是聚合物层厚度(nm),是聚合物层密度(克/厘米吗³),阿伏伽德罗常数,是自由的相对分子量聚合物链(29日]。

细胞的接触角(CA)试验以水来模拟实际的平台在体外的情况。在细胞分析平台在一个透明的容器装满面临下行磷酸缓冲盐(PBS)和光纯化学工业(kouichi),捕获的气泡的CA是衡量脸CA-XP (Kyowa界面科学、埼玉县、日本)根据之前报道协议(31日]。然后测量气泡的CA是减去从180°描述CA在这工作。PBS的温度是调节温控循环器(RE104,劳达,神奈川,日本)。CA的结果被表示为三个度量值的平均值与标准偏差(SD)。中科院的意义37°C和20°C之间被学生的测试t以及。测量样本之间的CA的意义由单向方差分析评估(方差分析)。

2.4。细胞和细胞培养

正常的人类脐静脉ECs (Kurabo,大阪,日本)中维护HuMedia-EG2 (Kurabo)。人类主动脉smc (Kurabo)中维护一个完整的媒介工具与血清CultureBoost(细胞系统,柯克兰,佤邦,美国)。正常成人真皮的边后卫(Kurabo)是维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和光纯化学工业(kouichi)与10%胎牛血清(Nichirei生物科学、东京、日本)和1%青霉素链霉素和光纯化学工业(kouichi)。细胞被维持在37°C和5%的公司₂五个段落中使用。

2.5。细胞粘附试验

细胞粘附试验与前面描述的协议进行了一些修改(29日]。可行的细胞沾Calcein-AM (Dojindo实验室)为1.5 h与液滴被播种在细胞分析平台(1.56×10⁴细胞/厘米²)。更换疏水/亲水聚(NIPAAm -的性质有限公司-CIPAAm),播种平台首先是培养在37°C。细胞粘附1 h后,细胞由荧光显微镜是在这个平台上获得的图像(X71,奥林巴斯公司、东京、日本)使用MetaMorph(分子器件、LLC桑尼维尔,美国)的控制电阶段。荧光细胞图像()加工使用MetaMorph计数细胞数量。随后,该平台为财产被转移到一个20°C气氛从疏水状态切换到亲水状态。改变聚合物的状态时,细胞培养的细胞粘附的1 h。他们的细胞图像以同样的方式获得的。细胞粘附的结果表示为六个细胞图像的均值与标准差(SD)。两个条件之间的数据的重要性被学生的测试t以及,和数据的重要性以及其他条件由单向方差分析测试。

3所示。结果

3.1。保利(NIPAAm -的特性有限公司-CIPAAm)细胞分析平台

研究生物分子的组合效应及其固定化高分子性质,我们构造一个保利(NIPAAm -有限公司-CIPAAm)嫁接试验平台。通过使用thermoresponsive保利(NIPAAm -有限公司-CIPAAm),该平台可以改变聚合物的状态相同的固定生物分子。

通过测量XRR在试验平台上,接枝层的厚度和密度估计纳米和克/厘米³分别为(表1)。制造聚合物移植物的接枝密度为0.30 /纳米链²再现了前面的数据(29日,32]。与温度有关的透射率变化的测量也证实,低临界溶解温度(LCST) 20°C和37°C(支持信息图在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/2090985)。这个结果表明,接枝聚合物可以切换的亲水/疏水性热刺激(20°C或37°C)。

作为一个属性描述符,CA是测量来描述这个平台的润湿性;它措施40.0°(SD = 0.8°) 20°C和44.6°(SD = 1.7°) 37°C(图3)。虽然中科院这两个温度之间的差异是显著的所有样品(20°C和37°C空白(没有生物分子)(),mono-Arg (),mono-Ile (),tri-Arg ()和tri-Ile ()的t以及,固定化生物分子之间的区别在相同的温度是微不足道的(在37°C和在20°C)由单向方差分析。因此,我们的聚(NIPAAm -有限公司-CIPAAm)表面提供了一个更大的财产效应的热刺激独立生物分子固定化。

3.2。细胞粘附Biomolecule-Immobilized保利(NIPAAm -有限公司-CIPAAm)平台

在细胞分析平台,建立细胞粘附在37°C或化验20°C。由于生物分子组成和biomolecule-polymer固定在两种情况下是相同的,不同的生物分子功能的影响聚合物性质的组合效果可以与之相比。图4(一)显示了三种细胞类型的细胞粘附结果可视化。图像(通过图像分析(图)被量化4 (b))。

首先,空白(没有生物分子)表面在37°C和20°C表明聚(NIPAAm -的疏水性有限公司-CIPAAm)增强细胞粘附ECs ()和smc ()。的边后卫更不敏感(亲水/疏水性变化,表现出很强的粘附在这两个条件。第二,RGDS-immobilized表面在37°C和20°C显示所有类型的细胞能够高细胞粘附性能尽管聚合物性质改变。

第三,mono-Arg——和tri-Arg-immobilized表面显示类似的模式三种类型的细胞粘附的细胞在两种温度条件。虽然smc显示普遍疲弱粘附在所有情况下,的边后卫展示一些粘附mono-Arg和tri-Arg(比RGDS肽效应较弱)(37°C和20°C:)。ECs显示弱粘附mono-Arg和tri-Arg亲水条件20°C,但它的附着力是恢复更多的疏水性聚合物时(在37°C) (37°C和20°C:)。类似mono-Ile-immobilized表面粘附模式是观察到的边后卫。然而,粘附性能极大地改变与ECs tri-Ile-immobilized表面(37°C和20°C:)。疏水性聚合物属性时,细胞粘附性能提高2.5倍以上(EC tri-Ile-immobilized表面上粘附的比率在37°C到20°C)。尽管tri-Arg的细胞粘附的整体性能和tri-Ile比RGDS弱得多,tri-Ile的EC粘附性能由于聚合物性质的变化优于致意。

3.3。Cell-Selective粘附性能和Biomolecule-Polymer组合效果

相比普遍强劲RGDS肽的细胞粘附性能,cell-selective ECs之间的附着力的偏好,smc,在其他条件(图检查的边后卫4 (b))。本机保利(NIPAAm -有限公司-CIPAAm)平台表面(空白)显示FB-selective粘附在20°C,但材料表面消极地影响EC和SMC附着力(FB对他人:)。虽然FB-selectivity稍微削弱了mono-Arg固定在20°C (),显著增强FB-selectivity在37°C ()可能是由于疏水性聚合物的组合效应在37°C(图4 (b))。相比之下,tri-Arg-immobilized表面也表现略有FB-selectivity 20°C(表面亲水时),这大大削弱了FB-selectivity在37°C(细胞粘附数量的边后卫是类似于ECs)。的另一个增强cell-selective发生与ECs tri-Ile-immobilized表面粘附性能。亲水聚合物效应使相当薄弱的粘附性能tri-Ile ECs的边后卫。然而,当聚合物的疏水性增加,ECs的粘附性能大大增强,导致选择性性能(增加14.6倍)来区分ECs和SMC (EC附着力比SMC tri-Ile-immobilized表面粘附在37°C)。这些结果表明,固定化生物分子之间有有效的组合效应及其固定化高分子。

4所示。讨论

提供一个有效的生物功能在医学上使用的聚合物,生物分子固定是一种有效的策略。由于其固定固定生物分子和聚合物强烈影响细胞粘附,本研究调查是否有组合的影响,尤其是在cell-selective附着力。比较的总细胞粘附性能biomolecule-immobilized聚合物通过切换聚合物的性质,我们设计了一个使用thermoresponsive聚合物细胞分析平台。

CA,生物材料的润湿性的指标,研究了;有些地方润湿性对细胞粘附[首选23]。此外,市场上塑料文化板块,其表面润湿性是达到一定条件控制的。例如,当我们检查一些商用组织culture-treated多井板块(6-well板)作为基本数据,空气中CA状态范围从49.3°到93.8°(板1:他一一bio-one, Cellcoat胶原蛋白I型,猫。657950年,很多13-29-02-89)47.0°(SD = 1.0°),(板2:BD生物科学,BD PureCoat胺6-well板、猫。4721年,很多3053352)49.3°(SD = 2.4°),(板3:康宁,康宁CellBIND表面聚苯乙烯无菌,猫。3335年,很多22814004)53°(SD = 2.5°),(板4:他一一bio-one 6先进TC板,猫。657960年,许多E14113SB) 70.5°(SD = 2.6°),(板5:猎鹰,多井PRIMARIA 6-well,猫。353846年,很多3269538)83.9°(SD = 1.7°),(板6:猎鹰、多井6-well猫。353046年,很多1272703)85.9°(SD = 5.6°),(板7:他一一bio-one 6细胞培养板与盖无菌,猫。657160年,许多E9070HI) 88.8°(SD = 2.2°),和(板8:热费希尔科学、Nunclon三角洲表面,猫。 140675, lot 7117287) 93.8° (SD = 0.9°). Because all of the products show a good cell culture performance, we could not find a simple correlation between CA and cell adhesion performance. The reality is that the data to explain such rules between cell adhesion performance and the polymer surface property is limited. In other words, since there are several varieties of commercially available polymers that can culture cells with different CAs, it is extremely difficult to select the appropriate culture plate to evaluate the expected performance of immobilized biomolecules on its surface. Vast combinations of plates and immobilization conditions had to be assessed to evaluate the function of immobilized screened biomolecules.

在这个工作中,我们的数据提供了一个固定生物分子的可能性,一种氨基酸或肽等,极大地影响的组合影响固定化高分子性质。虽然我们的平台显示小CA之间的差异其亲水/疏水状态,这样的组合影响很大,特别是在提高cell-selective粘连。

血清中蛋白质吸附在聚合物表面细胞粘附的总是一个有影响力的因素。我们评估两种ECM-derived蛋白质的吸附率、纤连蛋白和IV型胶原蛋白,在细胞分析平台(支持信息表S1)。我们的数据表明,蛋白质吸附的数量是微不足道的在我们的平台。此外,我们先前的研究表明,cell-selective粘附肽维持他们的影响在含血清培养基的细胞粘附试验(19]。因此,我们认为我们的细胞粘附试验数据主要反映了biomolecule-polymer组合效果。

通过本研究,我们表明,生物分子的细胞粘附功能的结合可以极大地影响了biomolecule-immobilized聚合物性质。有趣的是,cell-selective粘附性能更加强烈影响固定化高分子效应。我们已经表明,这种cell-selective粘附肽不仅能提供的序列,但也通过肽的理化性质(19]。特别是,我们的数据表明,Ile-containing肽可以展览EC-selective粘附和抑制粘附smc的边后卫(19]。因此,本研究采用物理化学特性的分子,如Arg-containing分子(带正电)和Ile-containing分子(疏水性)。提供的正电荷Arg的边后卫是首选;然而,tri-Arg的影响小于mono-Arg在聚合物条件(37°C和20°C)。Ile优先提供的疏水性和ECs的边后卫,但选择性聚合物的组合效应极大地增强了疏水性。值得注意的是EC-selectivity tri-Ile再现了我们过去的结果(19]。尽管mono-Ile之间的区别和tri-Ile在同一温度是微不足道的宏观特征(例如,CA), ECs可以识别的差异Ile残留物的数量,最好是坚持tri-Ile而不是mono-Ile (在两个温度)。

因为我们已经筛选cell-selective粘附肽和多肽微阵列(18- - - - - -21),我们的下一个挑战是选择一个更好的聚合物最大化每个肽函数用于医疗用途。我们还计划应用tri-Ile-immobilized表面label-free细胞净化。通过使用EC-selective捕获性能在37°C的EC释放性能在20°C只有2 h,它可以作为一个可行的EC凝结协议在初级文化。

在这项工作中,我们重点描述我们的平台表面的表面润湿性能,因为亲水/疏水性质的开关是保利(NIPAAm -最主要的变化有限公司-CIPAAm)。然而,其他描述符可以描述biomolecule-polymer组合效应,如表面电荷、硬度、粗糙度。我们实际测量biomolecule-immobilized表面的ζ电位DelsaNano HC粒子分析仪(贝克曼库尔特公司,沥青、钙、美国)。然而,我们没有发现明显关联的指控利率相比,我们现在的CA(支持信息图S2)的数据。自我们的数据表明,biomolecule-immobilized高分子材料的设计可以通过组合的详细检查更多的集成效应,我们的下一个目标是扩展这个组合效果调查评估其他聚合物性质特征的影响。

5。结论

设计一种改进的cell-selective粘附功能医学生物材料使用,surface-immobilized小生物分子的组合效应和固定聚合物性质进行了研究。通过建立聚(NIPAAm -有限公司-CIPAAm)平台,改变了聚合物性质相同的biomolecule-polymer成分对细胞粘附试验,我们发现cell-selective粘附性能很大程度上受聚合物的疏水性的影响。这些结果表明,适当选择使职能化固定化生物分子聚合物是非常重要的。因此,这项工作应该是先进的再生疗法的重要设计功能化生物材料。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由纳米技术平台项目的一部分(分子和材料合成)的教育,文化,体育,科学和技术(下边了),日本。力拓Kurimoto承认技术支持t .竹岛和r . Oguri(名古屋大学)。

补充材料

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