文摘
本研究的目的是制备壳聚糖/聚(乙烯醇)/ Ag纳米颗粒(CPA)凝胶对皮肤microwave-assistance应用程序。微波辐射来减少银纳米颗粒和银离子交联壳聚糖(CS)和聚乙烯醇(PVA)。银纳米粒子的存在在CPA凝胶矩阵研究了使用紫外可见光谱、透射电子显微镜和x射线衍射。CS和PVA的交互是通过傅里叶变换红外光谱学分析。银离子的释放是由原子吸收光谱法。注册会计师的抗菌性凝胶铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌用琼脂扩散法进行调查。最后,研究了凝胶的生物相容性和自愈能力使用成纤维细胞(在体外)和小鼠模型(在活的有机体内)。总之,结果表明,注册会计师凝胶被成功使用微波辐射方法制作的。这些凝胶可用于治愈一个开放的伤口由于其抗菌活性和生物相容性。
1。介绍
抗菌材料抗菌药物包含广泛调查可能在伤口愈合应用程序中使用。最近,他们被组合使用不同的方法,如电纺的(1),水凝胶系统[2),和天然气浸出(3)为了在材料中加入抗菌药物。他们也在准备各种材料组合增加抗菌性质,消除毒性(4],缩短伤口愈合过程。良好的生物聚合物组合可以利用它的组件。例如,周等人伪造AgNPs加载明胶/羧甲基壳聚糖水凝胶。结果表明,这种组合增加了机械强度,吸水,抗菌活性比其单独组件(5]。在另一项研究中,簪等人改性聚(L-lactic酸)(丙交脂)电影AgNPs加载PVA水凝胶使用氧等离子体处理,UV-initiated接枝聚合,和化学接枝的方法。修改后的电影被报道有有效的抗菌活性和生物相容性6]。
已经很出名的抗菌特性,壳聚糖(CS)是最常见的生物材料用于组织工程。其效用来自有利的属性如无毒性,不会引起排斥的财产,和可生物降解的特性7,8]。然而,当被单独使用,CS后很容易失去其机械强度吸收伤口渗出物和减少其降解时间。因此,CS是经常与其它合成交联聚合物如聚(乙烯醇)9和聚已酸内酯10)来提高其机械强度。
旁边CS,使用银纳米粒子在医学治疗也增加了由于其高和持久的抗菌活性的细菌具有广谱杀菌(11,12)和低毒性对人类细胞(13- - - - - -21]。AgNPs的抗菌活性,提供一个机会来做出更好的消毒伤口敷料,与银离子的释放有关。因此,许多研究已经进行调查AgNPs加载聚合物矩阵与集中控制的释放AgNPs延长他们的抗菌性能在愈合过程和使用抗生素替代品(22,23]。
尽管CS和AgNPs有广泛的抗菌谱对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌,其抗菌机制是不同的。CS, CS结构,正电荷,负电荷相互作用的微生物细胞膜(24),AgNPs和细菌之间的交互是基于电Ag)生成的+离子。这些属性表明CS能杀死细菌,如果他们进入CS矩阵而AgNPs可以分散和消除相邻的细菌25]。因此,结合CS和AgNPs已经包括在许多科学家的研究趋势26- - - - - -28]。
此外,CS / AgNPs复合材料被广泛研究和结合应用PVA对许多不同的应用程序来说,尤其是对皮肤伤口敷料(29日]。旁边的生物降解性、生物相容性、亲水属性和凝胶化能力(3],PVA可以改善伤口渗出物吸收的水凝胶基质,CS和AgNPs可以很容易地目标和杀死细菌。此外,-哦PVA组可能涉及Ag)的减少+对Ag)0不使用任何减少代理(29日,30.]。许多混合水凝胶结合PVA, CS或它们的混合物与AgNPs已经开发使用各种技术来提高他们的抗菌活性,提高愈合过程9,28,31日]。然而,最好的我们的文学研究,使用微波辐照对AgNPs形成和CS与PVA交联不使用减速机没有在别的地方进行。
本研究的目的是使用微波方法制造CS / PVA-AgNPs水凝胶。AgNPs浓度的影响,研究了水凝胶的抗菌特性。微波辐照CS / PVA-AgNPs水凝胶与各种AgNPs浓度特征使用紫外可见光谱、透射电子显微镜(TEM)、x射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外(ir)光谱,原子吸收光谱法(AAS)。用琼脂扩散法评估他们的抗菌财产。他们的生物相容性评价成纤维细胞和小鼠模型。
2。材料和方法
2.1。材料
聚乙烯醇(PVA,水解程度的99.0 -99.8%)、壳聚糖(CS,从虾壳,脱去乙酰基≥75%),和硝酸银(AgNO3美国99.998%)从西格玛奥德里奇购买。Mueller-Hinton琼脂,正欲购买来自美国。纤维母细胞细胞系(l - 929)从写明ATCC购买。铜绿假单胞菌(写明ATCC 27853)和金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923)被用于抗菌化验。Swiss-albino老鼠(4周,年龄16 - 20 g)提供到胡志明市巴斯德研究所,越南。
2.2。制造CS / PVA-AgNPs水凝胶
制造CS / PVA-AgNPs水凝胶,CS / PVA溶液,贴上CP,准备第一次混合壳聚糖2% w / v(准备在醋酸2% w / v解决方案)与PVA 10% w / v的解决方案(准备温水)以体积比为1:1。然后,硝酸银溶液,由硝酸银溶解粉末在水中10% w / v AgNO3,添加到准备CP方案和混合AgNO的最终浓度30.5% w / w / v v和1% CP方案,分别命名为会计师0.5和注册会计师1。每个解决方案都倒到一个单独的烧杯和辐照微波炉(日立、日本)在800 W 90秒形成凝胶。凝胶是冻干使用冷冻干燥机(美国Ilshin实验室。有限公司)为特征。所有样品都是在紫外光照射下消毒在体外和在活的有机体内研究。
2.3。对CS / PVA-AgNPs水凝胶
水凝胶合成后,水凝胶的AgNPs紫外可见光谱分析了从200年到800纳米波长使用紫外可见光谱仪(热科学起源10年代,美国)。AgNPs的形态学观察凝胶矩阵用透射电子显微镜(JEOL JEM1400,日本)。获得了AgNPs结晶相的冻干水凝胶使用x射线衍射(力量x射线衍射仪)和铜Ka辐射(λ= 1.54060)和步长为0.02°−1。PVA之间的交互和壳聚糖进行傅立叶变换红外光谱分析收集到的红外光谱分析器工具(美国PerkinElmer频谱GX)在波数的4000 - 500厘米−1。
2.4。在体外研究
释放银离子。为了检查银离子的释放率,校准曲线是由测量各种银解决方案定义了一个银离子浓度用原子吸收光谱法(AAS, SpectrAA 220 fs,瓦里安,美国),然后释放率取决于测量银解决方案在不同的时间进程释放。简单地说,一个校准曲线首先由溶解完全样本(圆,直径1厘米)5毫升硝酸,和获得的解决方案是作为股票的解决方案。然后,股票和一系列的稀释溶液被原子吸收测量校准曲线。之后,其他21个样本沉浸在21管,每个管包含5毫升F12培养基。然后,管道在孵化器孵化在37°C。三个管在不同的时间点(即取出。,1,6, 12, 24, 48, 168, and 336 hours), and the release of silver ions from the membranes in the F12 medium was determined by AAS [32]。
水凝胶的抗菌活性进行评估铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌用琼脂扩散法。短暂,细菌在灭菌培养基接种使用微生物文化和保存在扶轮瓶在150 rpm, 37°C 16小时。然后,细菌是离心机、清洗和悬浮在2%磷酸盐缓冲剂。最后的细菌浓度调整到1 - 2×109使用紫外分光光度计CFU /毫升。膜的抗菌活性是由定性评价根据147年AATCC、冻干样品CP,注册会计师0.5,注册会计师1与直径1厘米的细菌被放置在草坪上的穆勒辛顿琼脂板(14]。板块在37°C孵化24小时前可视化评估和测量抑菌圈。膜的杀菌活性评价相比之下他们的抑菌圈。
细胞毒性试验、小鼠成纤维细胞的细胞生存能力(l - 929)系列的稀释(100%,50%,25%,12.5%,0%)的提取的解决方案是使用MTT试验确定。准备的提取方案,5毫克凝胶在5毫升孵化RPMI媒体有10% (v / v)胎牛血清抗生素(青霉素、链霉素的边后卫)和1%的3天37°C,在震动条件下在孵化器的100 rpm,和提取的解决方案是通过滤膜。l - 929细胞被播种在96孔培养板1×10的浓度4细胞/ 100μL和孵化24小时37°C, 5%的公司2。稀释提取解决方案添加到梗塞部位组织培养板,只和梗塞部位井与媒体(0%提取解决方案)也准备作为一个控制。盘子被孵化3天37°C和5%股份有限公司2。然后,麻省理工的解决方案是添加到井和孵化为4小时。媒体被废弃的井,取而代之的是200年μL甲瓒DMSO溶液溶解的盐。细胞生存能力相对量化通过测量吸光度在590 nm使用ELISA读者(车工生物系统CE Promega公司、美国)。这些实验被复制和细胞生存能力的4倍计算的比例相对于控制。细胞增殖在板的照片也被抓获。
2.5。在活的有机体内研究
注册会计师的伤口愈合率0.5和注册会计师1凝胶扩散研究了凝胶的背的创伤,再次流出了老鼠。首先,老鼠被二甲醚麻醉和固定在桌子的头发被剃。接下来,聚维酮的解决方案是用来清理植入网站。两个完整的厚度与直径1厘米的伤口上创建每个鼠标的背,和0.1毫升的凝胶穿着。参与小鼠用作控制。监控皮肤伤口的愈合过程,伤口的照片被抓获后15天的时间。
在植入后15天,老鼠牺牲。样本提取与邻近的皮肤面积和v / v甲醛溶液固定在10%。样本脱水、嵌入石蜡和分段5µ米厚度使用切片机切片(325年热科学HM,美国)。片被苏木精和伊红染色(圆))在光学显微镜下组织学分析。
3所示。结果
3.1。对CS / PVA-AgNPs水凝胶
本研究的目的是准备一个壳聚糖/聚乙烯醇/ AgNPs凝胶矩阵不使用任何减速器。因此,微波辐照,交联聚合物(33),采用在这个调查。AgNPs形成是视觉上的成功证实了凝胶和紫外可见光谱的颜色。微波辐照后,水凝胶的颜色由白色变为深棕色,这表明了纳米银的存在形式(29日]。此外,在紫外可见光谱(图1),注册会计师的光谱0.5和注册会计师1在428纳米水凝胶显示一个吸收峰,这是由于局部表面等离子体共振AgNPs [30.]。提出了图1,广泛的吸收峰AgNPs AgNO低3集中在注册会计师0.5水凝胶是获得,而注册会计师1表明AgNO的浓度更高3导致更强的吸收。紫外可见结果表明AgNPs分布在注册会计师1凝胶是高于注册会计师0.5凝胶。
在注册会计师AgNPs形态和分布0.5和注册会计师1凝胶也使用TEM观察研究。AgNPs展出一个球形的样本(在图2)。的大小AgNPs基于TEM测量数据。结果表明,PCA的大小0.5范围从4 - 19 nm(数字2(一)和2(b)),而PCA1的大小范围从3 - 16 nm(数字2(c)和2(d))。结果表明,PCA AgNPs的数量1高于主成分分析0.5凝胶。
XRD的CP和注册会计师0.5凝胶是确定凝胶(图的晶体结构3)。通常情况下,注册会计师的x射线衍射模式0.5衍射峰在大约38.2°,44.2°,对应于晶体结构(111)和飞机(200),分别标准(Ag)立方阶段34,35]。高峰在大约20.9°表示CP的晶体结构36]。27°,峰值约18°28°,31°指出注册会计师的衍射峰0.5辐照后。
检查化学相互作用PVA, CS和Ag)、CP的傅立叶变换红外光谱,注册会计师0.5和注册会计师1是描述(图4)。CP的光谱显示了在893年达到顶峰,1160厘米−1对应于糖类结构。旁边的几个山峰聚类酰胺二世峰从1250到1450厘米−1,有很强的吸收峰值为1635和1541 cm−1分别对应于酰胺我和酰胺三世(37]。的强度有显著减少胺地区乐队(1250到1635厘米−1),作为CP混合的内容也从100%下降到40%左右,注册会计师0.5水凝胶和CPA的30%左右1水凝胶。减少吸光度的比值为1420厘米−1相对的存在Ag NPs表示相应的振动之间的解耦,AgNPs之间的交互和PVA -哦组链。此外,PVA和CS脱水,形成分子间醚桥,由吸光度的增加表明在1250厘米−1(30.微波辐照后)。,它可以得出的结论是,微波辐照降低Ag)+对Ag)0以及交联PVA和CS形成注册会计师水凝胶。
3.2。在体外研究
图5从CPA显示了银的释放率0.5和注册会计师1凝胶在F12培养基中关于时间以原子吸收光谱法。如果注册会计师0.5凝胶的银离子释放量是5.9µ在第一个小时g / mL,快速增加到12.8µg / mL在接下来的5个小时。从六到十二小时,释放率从12.8增加µ16.3 g / mLµ克/毫升。然后,释放率略有增加第一次12小时后,18.9的价值µ在336小时之后g / mL。如果注册会计师1凝胶,银释放的数量相比,注册会计师的数据的两倍0.5凝胶。短暂,银离子的释放率是13.5,25.4,32.3,33.2,34.2,35.5,38.4,1、6、12、24、48、168、和338小时。
为了测试样品的抗菌活性,琼脂扩散法。图6表明,注册会计师0.5和注册会计师1有类似的抗菌活性对吗铜绿假单胞菌作为他们的抑制带外约0.29厘米的样品。为金黄色葡萄球菌,注册会计师的抑制区1和注册会计师0.5凝胶是0.23厘米和0.29厘米,分别。因此,结果显示,随着AgNPs的数量增加,抑制区域扩大。相比之下,CP样品的抑菌圈没有观察到这两种革兰氏阴性细菌(铜绿假单胞菌)和革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌)。
图7显示了图的l - 929细胞的细胞生存能力的百分比检测与提取的解决方案的CP,注册会计师0.5,注册会计师1。结果表明,水凝胶Ag-NPs数量的增加导致水凝胶的细胞的生存能力下降。具体来说,在同一浓度的100%提取方案,CP 92%细胞生存能力而注册会计师0.5和注册会计师1有大约80%和76%的细胞生存能力。然而,细胞生存能力的样品仍高于70%,这是细胞毒性和noncytotoxicity之间的阈值,这样他们就可以被认为是noncytotoxic。此外,捕获的图像的成纤维细胞数量激增100%提取的溶液凝胶表明成纤维细胞的数量激增的提取方案CP大于注册会计师0.5和注册会计师1。然而,成纤维细胞的数量在CP的凝胶小于细胞培养板(TCP)。相比之下的会计师0.5和注册会计师1,视觉上的细胞量相等。
3.3。在活的有机体内研究
伤口的形态后15天时间均植入图所示9。这一系列照片说明伤口愈合过程的三个不同阶段,炎症、增生和改造。从第0天到第七天,炎症和增殖阶段发生,结果表明,愈合率相似的控制,注册会计师0.5,注册会计师1样本,表明形成厚痂的伤口,然而是薄的CP水凝胶。11天,厚厚的痂被移除和伤口大小的样本相对于初始大小适当减少80%。此外,伤口被CPA1治疗显示没有痂。在15天,当伤口愈合搬到改造阶段,不再痂尘世间的伤口,postimplantations被提取并观察其组织学结构,如图10。根据组织学检查,新合成纤维组织和稀疏的炎症细胞在真皮和皮下组织形成的控制和CP样本。然而,治疗伤口满是新形成的纤维组织和完全reepithelialized表皮。与注册会计师相比0.5、组织染色CPA的图像1表明,这种凝胶可以减少皮肤的炎症,诱发skin-healing过程比注册会计师0.5所做的事。
4所示。讨论
对皮肤愈合过程,伤口敷料是必要的,以防止感染。一个理想的伤口敷料必须包含一个抗菌剂。一个包含AgNPs抗菌材料可以由固定或诱骗AgNPs在生物聚合物矩阵。这个矩阵不仅是控制释放银离子,还增加和延长AgNPs的抗菌活性。除了抗菌性质,生物聚合物矩阵必须具备其他条件如生物相容性,生物降解,机械强度和吸水率。因此,天然和合成聚合物的组合几十年来一直在研究采取优势的来源。其中,CS和PVA的结合已经开发作为减速器和AgNPs的固定的模板。有几种方法可以应用于AgNPs加载到CS / PVA矩阵。例如,李等人开发了PVA /因为/ AgNPs实际上电纺膜显示优良的抗菌性能和生物相容性34]。Agnihotri等人伪造的PVA / CS加载AgNPs由两个分离步骤,交联PVA和CS紧随其后的固定AgNPs [9]。Abdelgawad等人实际上电纺的多组分(壳聚糖/ silver-NPs /聚乙烯醇)伤口敷料的应用程序。然而,微波照射到目前为止还没有被调查。
在这项研究中,采用微波辐照交联PVA与CS和减少Ag)+对Ag)0。AgNPs在水凝胶的均匀分布矩阵可以实现由于复杂的形成和共价Ag)离子之间的相互作用和水凝胶网络的官能团如-哦,nh2和- c = O (38- - - - - -40]。PVA -哦官能团和CS可以作为减速器导致减少离子Ag)+对粒子Ag)0(27]。此外,微波辐照交联过程中支持的聚合物链包含-哦组如壳聚糖和聚乙烯醇(13,41]。这种方法的优点是CPA凝胶捏造不使用任何减速机;因此,没有必要进一步去除残留的交联剂和还原剂。确认AgNPs形成CP水凝胶的成功,紫外可见光谱,TEM观察,x射线衍射,红外光谱分析,并进行了银离子的释放。结果表明,注册会计师凝胶成功的通过使用microwave-assistance,由吸收峰表明在紫外可见光谱(图428海里1)。此外,1420厘米的比率下降−1在傅立叶变换红外光谱(图4在CP)证实了AgNPs形成矩阵。此外,AgNPs的存在也证实了TEM观察。结果表明,大小的AgNPs分布式从4 - 19 nm(图2)。另外,晶体结构(111)和飞机(200)在XRD概要文件(图3)表示AgNPs的存在。医疗应用程序时,注册会计师凝胶的生物相容性是另一个重要因素,需要确认。啤酒等人透露,银释放的数量决定了水凝胶的细胞生存能力。从啤酒的研究结果也表明,细胞生存能力高于80%样本中含有银的比例低于2% (42]。因此,银的金额是固定的百分比低于2%在总量和银离子的释放进行,如图5。结果表明,从注册会计师Ag)离子的释放率0.5和注册会计师1大约是15µg / mL和32µg / mL,分别了近24小时。24小时后观察无显著变化。此外,凝胶的抗菌性能和生物相容性评估研究。图6表明,CP样本没有创造革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌抑菌圈。注册会计师0.5和注册会计师1凝胶显示抗菌性质类似的反对铜绿假单胞菌,虽然抗菌活性的增加金黄色葡萄球菌观察随着AgNPs的浓度增加(图6),表明样本注册会计师1有抗菌活性的反对金黄色葡萄球菌比注册会计师0.5。数据7和8显示两个会计师0.5和注册会计师1在细胞培养中不产生毒性测试。此外,在在活的有机体内测试,观察到两个注册会计师0.5和注册会计师1可以减少皮肤的炎症和支持新的纤维组织和表皮完全reepithelialized(图10)。
5。结论
在这项研究中,抗菌CPA microwave-irradiated援助下凝胶形成。结果表明,微波不仅交联壳聚糖和聚乙烯醇也减少了Ag)+对Ag)0。CPA凝胶成功伪造和紫外可见光谱、TEM观察,傅立叶变换红外光谱、XRD概要文件。银离子的释放率增加了如果AgNPs的浓度增加。抗菌测试表明注册会计师0.5和注册会计师1可以对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。然而,抗菌活性金黄色葡萄球菌是受到释放银离子的浓度的影响。在体外和在活的有机体内研究表明,注册会计师0.5和注册会计师1有良好的生物相容性和安全性应用程序用于伤口。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由越南国立大学的基金,胡志明市,在批准号b2013 - 76 - 03和批准号1161 / QĐ-ĐHQG-KHCN。