设计基于胶原蛋白的聚(3-hydroxybutyrate -有限公司4-hydroxybutyrate)为组织工程支架

文摘

P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物被适应双溶剂系统修改使用胶原蛋白。样本的表面性质特点是傅里叶变换红外光谱(FTIR)、扫描电镜(SEM)、有机元素分析(环境成分分析仪),和水接触角测量。胶原蛋白浓度的影响,支架厚度和4 hb摩尔分数的亲水性由田口方法进行了优化。正交阵列进行了实验获得亲水性脚手架的响应。方差分析(方差分析)是用来确定的重要参数和确定每个参数的最佳水平。结果还表明,P (3 hb -的亲水性有限公司4 hb) /胶原蛋白混合支架增加胶原蛋白的浓度增加到15 wt %的摩尔分数50摩尔%支架厚度为0.1毫米。生物相容性的P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合曲面是由纤维母细胞进行细胞(L929)文化。胶原蛋白混合支架表面显示显著的细胞粘附和增长相比P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物支架。

1。介绍

多年来,相当大的努力一直在引导开发组织工程支架使用可生物降解和生物相容性的高分子材料。理想情况下,一个脚手架应该模仿天然细胞外基质的结构和生物功能(ECM)蛋白,调节细胞活动(1]。

生物高分子无毒,noncarcinogen、nongenotoxic和生物相容性的青睐和广泛研究应用在组织工程2]。在各种各样的生物聚合物测试,聚3-hydroxybutyrate -有限公司4-hydroxybutyrate) [P (3 hb -有限公司P (3 hb - 4 hb)]有限公司4 hb)来源于微生物是生物相容性材料,得到了关注3,4]。尽管拥有理想的机械和物理性能,这些材料的表面有一个主要缺点,P (3 hb -有限公司4 hb)是疏水性对细胞没有识别网站附件,限制了组织工程领域的适用性5,6]。因此,表面修饰的研究了混合胶原蛋白进一步加强细胞粘附。

胶原蛋白被认为是作为医疗应用的生物材料展览生物降解性,低抗原性、细胞毒性可以忽略不计,和支持细胞生长的能力7]。胶原蛋白包含肽序列Arg-Gly-Asp (RGD)可以被细胞表面,并允许本地组织细胞的附件ECM,由原纤维蛋白(8]。混合胶原蛋白与其他高分子材料可能会导致更好的医学应用属性更有利。RGD肽序列中发现的胶原蛋白是最小cell-recognizable序列发现在ECM (8,9]。

在目前的工作,P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原支架是由简单混合通过混合溶剂铸造双溶剂系统适应提高P (3 hb -的亲水性有限公司4 hb)。双溶剂系统防止使用有毒溶剂,常用在聚合物共混10]。胶原蛋白浓度的影响,支架厚度和4 hb摩尔分数的亲水性是由田口方法和优化的重要参数,每个参数确定最优水平。为了分析cytocompatibility和细胞P (3 hb -的行为有限公司4 hb) /胶原支架,小鼠成纤维细胞,L929细胞被用来评估附件。将胶原蛋白P (3 hb -表面上有限公司4 hb)可能给新的和有趣的属性在组织工程中的应用。

2。实验

2.1。材料

P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物(20、35、50和82摩尔%)用于本研究合成使用野生型和转化株菌株Cupriavidussp。USM1020湖Kulim隔绝,马来西亚,20 L发酵罐如前所述[11]。从罗非鱼鱼皮胶原蛋白粉(海南中信化工有限公司,有限公司,中国)与高纯度(95%)和分子量小于3000 Da的使用。溶剂、氯仿、冰醋酸、从R&M化学品购买,联合王国。

2.2。使用氧化剂清除类毒素

失活和删除木糖醇是通过使用过氧化氢,如前所述[12]。共聚物P (3 hb -有限公司4 hb)产生溶解在氯仿2% (w / v) 60°C。3整除的55μL / g的双氧水(30%水)被添加到解决方案每隔20分钟60°C。共聚物的聚合物溶液冷却,用甲醇沉淀。使用E-TOXATE内毒素水平测试套件(Sigma-Aldrich)。

2.3。制造的P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原支架混合的混合

胶原蛋白粉不同重量的比率(5、10和15 wt %)是溶解在冰醋酸溶液(8 wt %)。0.42克或0.83克的量以前优化P (3 hb -的重量有限公司4 hb)共聚物溶解在15或20毫升氯仿和胶原蛋白的解决方案是添加在激烈的搅拌。解决方案是注入玻璃培养皿(直径5厘米)作为铸造表面。支架被风干(24小时),后来vacuum-dried 48 h使用粘合剂GmbH VD 23(德国粘合剂GmbH)来删除任何剩余溶剂。支架的厚度测量使用Teclock拨测厚仪(Teclock、日本)。支架的厚度0.1毫米(准备使用0.42 g)和0.2毫米(准备使用0.83 g)形成的。

2.4。傅里叶变换红外(FTIR)光谱

基多(珀金埃尔默频谱GX)被用来分析官能团在P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物、胶原蛋白和支架。每个样本的光谱得到的4000 - 500厘米⁻¹4厘米的决议⁻¹。在透射光谱输出记录波数的函数。

2.5。用茚三酮测定氨基酸组

胶原蛋白在P (3 hb -密度有限公司4 hb) /胶原支架决心用茚三酮。茚三酮作为一项指标定性、定量检测NH的存在₂在P (3 hb -团体有限公司4 hb) /胶原支架。支架制作被切成10毫米×10毫米,沉浸在1.0 mol / L茚三酮/乙醇溶液。支架的部分后来被放置在玻璃管和使用Memmert水浴锅加热在80°C(德国Memmert GmbH)加速反应10分钟茚三酮与氨基酸组。后,5毫升氯仿很快就被添加到管溶解支架。当支架显示紫色,丙胺(5毫升)添加到稳定的蓝色化合物。OD以560海里。使用已知浓度的校准曲线6-hexanediamine在氯仿/丙胺(1/1,v / v)。

2.6。有机元素分析(中文)

有机元素分析进行测量C, H,使用中文的支架捏造和N含量元素分析仪2400系列二世与AD-6自动平衡(美国PerkinElmer)。元素分析仪的操作与恒载气氦流。加热温度保持恒定在925燃烧列和减少640°C的列。大约2毫克的示例用于每个测量。样品是使用自动AD-6天平称重(美国PerkinElmer)。胱氨酸作为标准。

2.7。水接触角测定

装配式脚手架的接触角测量使用KSV凸轮下降101系列形状分析接触角测量仪。支架放置持平和蒸馏水的液滴被按下滴管放在支架上。下在电脑屏幕上观察和接触角的值计算使用电脑。

2.8。扫描电子显微镜(SEM)

电影和支架的形态也使用扫描电子显微镜(SEM)观察(Leo上50副总裁领域任务SEM, Carl-Ziess SMT,从,德国)。干样品安装在铝树桩涂上金在溅射设备扫描电镜下观察。

2.9。在体外细胞毒性评价

各种各样的P (3 hb -合作4 hb) /胶原蛋白混合支架被削减的大小(直径6毫米)配件96 -平底培养板和下消毒杀菌剂紫外线消毒器(CA-MI、意大利)1小时。支架被放置在96 -平底培养板。细胞被播种在5×10⁴细胞/毫升和孵化有限公司5%₂孵化器在37°C 24和72 h。细胞生存和增殖与MTS化验(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium) / PMS(吩嗪methosulfate)。

3所示。结果与讨论

3.1。除热原质

需要热原质去除自PHA聚合物由革兰氏阴性细菌被展览木糖醇的存在(12]。共聚物的内毒素水平前后热原质删除表所示1。氯仿萃取法记录的共聚物中内毒素水平在欧盟范围内至少需要补充16至32 / g。后迅速减少内毒素值被热原质去除(0.5 1欧盟/ g)。根据美国食品和药物管理局的指导方针,在PHA内毒素允许的范围用于医学应用应具备欧盟/ g (4 - 513]。因此,P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物是适合生产在活的有机体内应用程序后内毒素去除。

3.2。制造的P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合通过简单的混合

P (3 hb -的制造有限公司4 hb) /胶原支架是由混合的混合结合两种不同的溶剂。该方法从以前的工作进行了修改14]。相反,在另一项研究中,一个常见的溶剂是用来溶解P (3 hb -有限公司4 hb)和胶原蛋白使用1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP)制作P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合通过简单的混合技术(12]。在制造混合,这些溶剂完全删除带来了挑战,从支架就可以形成强烈的氢键与混合。此外,最近的研究表明,胶原纤维从HFIP缺乏本地超微结构15]。因此,明智的选择使用这两种不同的溶剂可以模仿有毒溶剂的性质如HFIP使用。

在这里,两种不同的溶剂相结合的解决方案处理制作P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合。P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物是溶解在氯仿而胶原蛋白溶于酸性溶剂溶解在冰醋酸(3毫升)。由于使用有机溶剂氯仿溶解P (3 hb -有限公司4 hb),水的存在是预防避免混合相分离。的体积氯仿乙酸是维持在2:13所有的混合过程中为了获得一个同质的解决方案。混合支架的胶原蛋白含量只剩下15 wt %作为进一步增加大孔支架上。这可能是由于快速蒸发率P (3 hb -有限公司4 hb)在氯仿中的胶原蛋白相比,醋酸留下大孔支架的胶原蛋白量增加。

3.3。表面化学成分测定P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合

元素分析的C、H、N用于进一步确定存在的N元素出现在P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原支架。事实上,胶原蛋白是一种蛋白质包含N个元素,而P (3 hb -有限公司4 hb)不自然地包含n .因此,混合与P (3 hb -胶原蛋白有限公司4 hb)的存在将导致在P (3 hb - N有限公司4 hb) /胶原蛋白混合物。基于表2胶原蛋白的结合到P (3 hb -有限公司4 hb)通过简单的混合技术明显通过观察通过C N元素的存在,H和N分析。没有公司的共聚物的胶原蛋白没有额外的氮。分析清楚地显示了组成增强N元素P (3 hb -有限公司4 hb) / 5 wt % 63.71%的胶原蛋白混合支架相比P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物支架。除此之外,它也观察到,P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原支架混合记录的百分比的增加N元素作为胶原蛋白浓度增加到15 wt %记录增加1.15倍。相似的C、H、N元素分析进行了先前确定的存在N元素改性二氧化硅表面与mercaptopropyl[混合16]。

红外光谱研究进行了监控化学修改的P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原支架。所有的峰对应于P (3 hb -有限公司4 hb)和胶原蛋白被观察到。基于红外光谱谱图1(一),胶原蛋白被确定基于酰胺我乐队在1634厘米的存在⁻¹和二酰胺乐队在1526厘米⁻¹。3300的宽带胶原蛋白是由于h拉伸(17]。在自然P (3 hb -有限公司4 hb)聚合物(图1 (b)在1720厘米),特征吸收带⁻¹主要是由于酯羰基(18,19]。在P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合物,酰胺I和II和酯羰基被观察到。P (3 hb -的光谱有限公司4 hb) /胶原蛋白混合胶原蛋白与不同浓度的5 - 15 wt %(数字1 (c)- - - - - -1 (e))很相似但胶原蛋白含量的变化从5、10和15 wt %在光谱显示比例的胶原蛋白的变化。突出的变化是我和二酰胺酰胺的变化强度随着胶原蛋白强度增加。

3.4。亲水性的P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合使用田口方法

亲水性是使用水接触角测量仪测量。水接触角是用来描述界面润湿现象直接关系到生物材料的亲水性(20.]。研究表明,亲水性增加是由于改善生物材料支架的生物相容性的可能性(20.]。亲水性的P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原支架决心使用混合水接触角分析。许多研究工作表明,共聚单体组成(14)和胶原蛋白浓度(17作为潜在的影响因素研究支架亲水性。如表所示34 hb成分、胶原蛋白浓度和支架厚度进行调查。支架厚度也认为,因为一项研究使用collagen-chitosan多孔支架作为伤口敷料展示支架厚度作为潜在因素改善伤口愈合(21]。

田口方法是高效的设计优化参数在各种条件(22]。在这里,田口设计(正交阵列)是用于分析最优支架制造参数得到最低水接触角。因变量是水接触角表示亲水性。总共32反应(水接触角)根据设计参数如表所示4。根据方差分析结果(表5),参数4 hb摩尔分数和胶原蛋白浓度被发现在95%的置信水平显著。

然而,很明显,4 hb摩尔分数贡献最高的50.93%的水接触角支架。胶原蛋白浓度是下一个因素有36.81%的水接触角。然而,结果显示没有明显的参数之间的交互测试。

因子分析给了一个预测模型,形成一个方程通过田口方法显示为

基于使用田口方法生成结果,P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) / 15 wt %胶原蛋白与0.1毫米厚度记录最低的水接触角为44.5°。这进一步证明了SEM分析进行确定支架的表面形态。这是观察到的P (3 hb -有限公司-50年摩尔% 4 hb) / 15 wt %胶原蛋白混合曲面(图2 (d))有更多的不规则的大开孔与粗糙表面相比其他P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合曲面(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) / 5 wt % P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) / 10 wt %胶原蛋白混合表面与小波closed-pores可能导致蒸发的溶剂在支架的制造。然而,很明显,P (3 hb -有限公司4 hb)混合后支架表面变得更加多孔。粗糙表面观察到随着胶原蛋白浓度的增加从5到15 wt % P (3 hb -相比有限公司4 hb)脚手架没有胶原蛋白(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。先前的研究多孔P (3 hb -展出有限公司4 hb)支架与改善润湿性与胶原蛋白(混合后12]。因此,表面孔隙度增加,同时增加的表面积支架导致封闭表面大量的水。然而,快速蒸发的氯仿与乙酸用于制作混合离开大可见孔支架上的混合。

数据3(一个)- - - - - -3 (d)显示静态接触角对水滴P (3 hb - 0.1毫米厚有限公司-50摩尔% 4 hb), P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) / 5 wt %胶原蛋白,P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) / 10 wt %胶原蛋白,和P (3 hb -有限公司-50年摩尔% 4 hb) / 15 wt %胶原蛋白混合物。静态水接触角为各种底物测定各样品的位置。接触角的减小P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 P (3 hb - hb)有限公司-50摩尔% 4 hb) / 15 wt %胶原蛋白是显而易见的。接触角是量化的角度交叉形成的液固界面。图3 (d)显示了最小的接触角(44.5°)由于利差的水滴在表面比大接触角观察图3(一个)(73.2°),当水滴珠表面上。可以看出,随着胶原蛋白浓度的增加,水接触角降低。

3.5。生物相容性和细胞毒性的P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原支架通过混合在体外细胞增殖

能够支持附件和促进培养细胞的增殖是功能性生物支架的先决条件。为了评估细胞行为或细胞生长,L929成纤维细胞细胞被播种到各种P (3 hb -有限公司4 hb)/胶原蛋白支架捏造。一般L929细胞数量增加在所有支架在3天的时间比最初的播种。将进一步提高cytocompatibility胶原蛋白被发现。细胞计数在胶原蛋白混合与那些没有胶原蛋白(图相比大大提高4)。这也是明显增加胶原蛋白浓度最高记录与支架的细胞增殖率的混合15 wt %胶原蛋白。这可以归因于这样一个事实:胶原蛋白水亲和力高,低抗原性、细胞外基质(ECM)的一个关键因素,有助于良好的细胞相容性(23]。这进一步支持先前的研究报道胶原蛋白来刺激软骨组织的分化(24]。P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) /胶原支架混合显示增殖率各种胶原蛋白浓度显著高于其他支架混合。在15 wt %胶原蛋白浓度,厚0.1毫米和0.2毫米P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) /胶原支架混合测量数量明显高于细胞(> > 1.38倍和1.62倍,分别地。)比初始L929播种。

扩散PHA支架上的细胞增加的顺序P (3 hb -有限公司-20摩尔% 4 hb) < P (3 hb -有限公司-35% < P (3 hb - 4 hb)有限公司-82摩尔% 4 hb) < P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) 0.1和0.2毫米支架厚度。结果与类似的模式增加亲水性。最高的44.5°亲水性(图3 (d))是记录的P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) / 15毫克胶原支架。有趣的是,成纤维细胞细胞增殖也发现了支架的厚度的影响。它可以观察到,P (3 hb - 0.1毫米厚有限公司4 hb) /胶原支架混合显示增殖率增加0.2毫米相比胶原支架对L929成纤维细胞(数字4(一)和4 (b))。结果表明,优化膜厚度可以产生显著增强初始粘附和随后的L929细胞的生长。类似的观察早些时候报道,增长率的人类主动脉内皮细胞(HAEC)聚(vinylacetic酸)脚手架是依赖于膜厚度和细胞增殖增加随着膜厚度减少到0.2×10⁻³毫米(25]。据报道,粗糙程度可以增加蛋白吸附和细胞连接,因此提供锚固以及细胞生长的空间26]。值得注意的是,表面粗糙度大大影响了细胞之间的相互作用和材料(27]。表面形貌观察和SEM分析还表明粗糙多孔表面P (3 hb -有限公司-50摩尔% 4 hb) / 15毫克胶原蛋白支架(图2 (d)),解释了最高的亲水性,从而导致增殖率最高的胶原蛋白混合支架(图5)。

4所示。结论

胶原蛋白被合并到P (3 hb -有限公司4 hb)共聚物的亲水性提高在组织工程中的应用。双溶剂系统是适应减少使用有毒溶剂。环境成分分析仪,红外光谱和扫描电镜分析进行进一步确认修改的过程。各种参数,如胶原蛋白浓度,支架的厚度,和4 hb摩尔分数进行调查在编造一个支架与亲水性的增加是一种理想的组织工程支架材料。使用田口方法的参数进行了优化。它可以推断这个P (3 hb -有限公司4 hb) /胶原蛋白混合支架与胶原蛋白的浓度增加到15 wt %,以50摩尔%的摩尔分数和0.1毫米的厚度,亲水性增加,从而增加了表面L929细胞增殖。这项研究表明,由混合《生物高分子表面改性可以提高聚合物材料的生物相容性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

作者感谢科学,技术和创新(MOSTI)项目基金资助(批准号02-05-23-SF0003)。

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