鲑鱼肌肉坚持聚合物涂料和抗生素残留反相高效液相色谱法测定耦合选择反应监测质谱、原子力显微镜和傅里叶变换红外光谱学

文摘

大马哈鱼肌肉的持久粘附食品容器壁与尿素溶液治疗后观察。这项工作评估抗生素的扩散从鲑鱼肌肉聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)涂层保护电解铬镀层钢板(ECCS)板块。新的水产养殖生产系统采用抗生素如florfenicol florfenicol胺、氧四环素,红霉素控制疾病。抗生素是一种关心的介绍关于对人类健康和生物多样性的影响。重要的是要确定对附着力的影响后期鲑鱼的肌肉可以墙壁和表面和结构变化影响多层膜的功能。这项工作特征的变化发生在多层宠物聚合物和钢容器的电子显微镜、三维原子力显微镜(3 d-afm), x射线光电子能谱(XPS)和傅里叶变换红外光谱(ir)分析。一个健壮的质谱分析方法来确定抗生素残留的存在。没有证据表明抗生素的观察之间的保护涂层在0.001和2.0 ng / mL;然而,蛋白质的存在、胆固醇和α-胡萝卜素被发现。这深入剖析matrix-level元素相关的罐头出口行业使用足够的材料。

1。介绍

水产养殖使用抗菌素在发达国家普遍限制,以避免人类病原体抵抗抗菌素的潜在选择有效的临床实践(1- - - - - -7]。最相关的负面影响抗生素是抗菌素耐药性(AMR),这威胁到日益增长的的有效的预防感染。摄入的抗菌素,大约80%进入环境后,粪便或未被吸收的形式吸收,在尿液分泌形式,和其他分泌物(8,9]。我们国家的一部分,吸收的抗生素鲑鱼肌肉扩散到宠物聚合物涂层影响其回收能力的ecomaterial鱼罐头工业和改变其微观结构和功能设计来保护食品的感官性质。大马哈鱼肌肉蛋白质组成的生物聚合物,分子由单体的构建块的线性长链串在一起通过肽债券相邻羰基和氨基(nh(羧基)₂酸残基。

salmonid肉的颜色是由于膳食类胡萝卜素,主要是虾青素和canthaxanthin,鱼不能合成新创。在野外,鳟鱼利用从他们的猎物,类胡萝卜素,在培养条件下,这些化合物添加到饮食(10]。

因为类胡萝卜素含有共轭体系的碳碳双键氧化敏感,通常会导致他们的漂白11]。在超市鱼提供有吸引力和准备去做单位,颜色的一个主要属性,影响消费者感知的质量(12]。视觉外观往往是唯一的标准,消费者购买选择的鱼。

此外,鲑鱼包装是一个重要方面的能源生产后期肌肉,肌肉组织供氧的打断,然后能源生产是受限制的。糖原(存储碳水化合物)或脂肪氧化的一系列反应最终生成二氧化碳(有限公司₂)、水和三磷酸腺苷(ATP)。这样的释放通常倾向于产生化学变化在工业分子和聚合物的结晶度密切相关;因此,如果出现极端条件下,他们可能会导致宠物聚合物的降解涂料(13- - - - - -16]。

以确保足够的保质期,罐头食品是由蒸汽热处理,steam-air混合物,水,或喷洒水。最冷的可以用作参考点来确定罐是否获得了足够的热处理。热处理应确保微生物的失活导致食物中毒和腐败。所需的加热包装食品在最冷的地方是在121°C的范围4 - 12分钟对一些典型的罐头食品(18- - - - - -20.]。由于这个热处理,一些包装产品可以部分坚持墙。最小化的产品坚持可以清空后壁是方便消费者的需求。

Bistac et al。21]发现几个因素影响鲭鱼附着漆墙。报道的效果显然表明,蛋白质是粘连的主要原因。蛋白质由氨基酸链的共价结合。四种类型的债券可以的氨基酸残基之间形成:共价,静电,氢,疏水键。这些债券负责本地的结构蛋白(22]。

抗生素发挥重要作用在大型商业鱼类养殖和鲑鱼养殖成功的一个关键原因。制药公司已经进行了大量的研究鱼类疫苗;然而,有限的信息可以在科学出版物(23]。抗生素应用药物可能影响鲑鱼粘附到墙壁。目前还不清楚他们的过度使用会导致他们被宠物吸收聚合物或者留在鱼肌肉。因此,沙石的使用技术来确定和描述鲑鱼粘附到容器壁,以及抗生素的可能扩散到宠物涂料及其对性能的影响,是本研究的主要目标。因此,一个创新的方法组成的反相高效液相色谱法(HPLC)耦合的选择反应监测(SRM)质谱。根据抗生素,探测距离之间的解决方案是0.001和2.0 ng / L值远低于允许的极限在养殖鱼类,氯霉素少于0.3毫克/公斤(24]。

此外,人们越来越关注生态系统保护的大量菊抗生素物质传递到水生环境在鲑鱼养殖系统中,水和泥沙浓度的氯霉素已经发现112.3 ng / L和0.1957毫克/公斤,分别为(25,26]。

上面的分析与表征技术,如电子显微镜和补充3 d-afm和评估潜在的保护宠物聚合物通过红外光谱的变化。

接触开始抗菌聚合物的浓度可能导致负面影响他们的表现。因此,鲑鱼产业需要的支持知识和足够的表征技术的使用使其产品满足高标准的质量涉及到多层高分子复合材料的就业17,27- - - - - -29日]。

2。材料和方法

容器在这项研究是由多层复合总共不超过200微米的厚度。它由低碳钢基保护的200 nm厚铬(Cr⁰)和氧化铬(Cr₂O₃)层增加耐蚀性和表面聚合物聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)涂层,以防止物理化学食品和金属基质之间的相互作用(14]。

这种材料是一个过程,对环境友好,铬VI-free (non-carcinogenic)高分子。这薄,多层电解铬镀层钢板(ECCS)强化保护的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)涂料是缺乏或化学污染物迁移等物质中双酚a(环氧树脂、聚碳酸酯),邻苯二甲酸酯烷基(塑化剂)和双酚a缩水甘油醚。此外,这些复合材料帮助减少燃煤排放到大气中,由于缺乏有限公司₂版本,不同的涂料在固化阶段(30.,31日]。

一组48个随机选择的大马哈鱼罐头、存储1 - 16个月,来自antibiotic-treated农业的笼子里,分析了在联合设计工作我们的研究实验室和出口罐头公司。

标准制造协议是用来生产罐和来确定宠物的鲑鱼粘附涂层容器壁,以及形态学和化学变化的多层膜。食品罐头生产采用50毫升的2.5%氯化钠溶液,在120°C为60分钟消毒,沉浸在温暖的浴缸在50 - 80°C消毒之前,前20°C和存储为一个星期。样品展示肌肉粘连的证据,即使强震空能,被选中。

后,切除大马哈鱼肌肉坚持可以用6米墙进行尿素溶液形成氢键和展开的蛋白质。

2.1。描述的鲑鱼肌肉粘连

鲑鱼粘附在宠物的表面表征聚合物是由扫描电子显微镜(SEM)使用一个狮子座400系列扫描电子显微镜和3 d-afm Nanoworld Pyrex-Nitride调查。前10 nm PET表面的接触分析了大马哈鱼肌肉通过XPS PerkinElmer物理电子学部门(φ)5100分光计和一个标准的x射线源为了比较控制材料之间的性能在时间和存储罐展示鲑鱼粘附和检测保护聚合物的疏水性有机硅烷的存在。收集样本1×2厘米大小从PET-coated ECCS板之前与蒸馏水清洗,消除肌肉仍然存在。样品被提前24小时在一个高真空室,以防止杂质和污染物影响设备,避免工作压力变化在这些高度敏感分析。一般在所有标本分析与测量之间的1200和0电动车检测不受欢迎的金属痕迹的存在。

2.2。反相高效液相色谱法测定抗生素

多残留的识别是一个健壮的方法实现的反相高效液相色谱法耦合热科学TSQ有利的三极四极质谱仪(TSQ)来执行选择反应监测,通常被称为SRM,所选的前体离子化合物的相关兴趣是collision-induced分离分析其碎片如图1。

这个方法被用来量化一个感兴趣的分子数,因为它允许代谢物的检测非常少量的皮克甚至毫微微克秩序的;因此,它可以被视为一种极其敏感技术监测分子生物的兴趣。因此,在量化的鲑鱼产业中的应用抗生素是一种实用的微量分析方法值得关注。

2.2.1。样本提取

从样本收集的板块孵化24 h−20°C 5毫升甲醇液相色谱-光谱法(质)的成绩。然后,盘子从容器中删除和存储;上层清液是干在SpeedVac离心蒸发器后重建于300年μL甲醇和甲酸0.1% (v / v)。

2.2.2。质分析

样本提交反相色谱使用高效液相色谱柱Syncronis C18,粒径1.7μ米,50×2.1毫米,梯度从0到100%的0.1%的甲酸水(v / v) 0.1%的甲酸甲醇(v / v) 10分钟Dionex 3000 UHPLC色谱仪配有热Finnigan TSQ有利的三极四极(TSQ) MS / MS探测器SRM的量化。

前体离子的细节,以及这些产品的离子,和审判的条件详细表1。

样品的电离条件的毛细管温度由4000 V 380°C,氮压60 L / min,辅助气体流量35 L / min。

检测极限的细节为每个抗生素应用于养殖三文鱼罐头用途表2。

florfenicol胺,florfenicol氧四环素,红霉素标准准备从原液1毫克/毫升连续稀释工作解决方案从50 ng / mL到10个pg / mL florfenicol florfenicol胺和甲醇从500 ng / mL - 100 pg / mL甲醇对红霉素、氧四环素和氯霉素。

2.2.3。质谱数据分析

反相在三极四极质谱进行分析柱与质谱扫描从200年到1500年哒,分辨率0.04 RFHM,数据收集速度0.5 s。

电喷雾电离(ESI)的气溶胶包括毛细管载有大约4000 V的电位差380°C, 60 L / min,氮气压力和离子转移加热到350°C。

此外,12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)是用来变性的蛋白质残留PET表面后坚持尿素溶液治疗打算删除它们。

2.2.4。在变性条件下电泳(sds - page)

样本中的蛋白质变性有12.5%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page) [32]。凝胶与以下成分有效地用于分离蛋白质:12.5%聚丙烯酰胺(w / v), 0.375 tris-HCl, pH值8.8缓冲区;SDS 0.1% (w / v);过硫酸铵0.03% (w / v);tem和0.1% (v / v)。

一旦分离凝胶聚合,一套垫片凝胶上有以下成分:聚丙烯酰胺4% (w / v), 0.125 tris-HCl, pH值6.8缓冲区,SDS 0.1% (w / v),过硫酸铵0.03% (w / v)、tem和0.1% (v / v)。在样品可溶性蛋白质缓冲与以下配方:62.5毫米tris-HCl, pH值6.8,1% SDS (w / v), 10%甘油(v / v) 5%β巯基乙醇(v / v), 0.05%溴酚蓝(如离子方面的标志)。

促进变性过程中,样本为5分钟加热到95°C。然后,样本迁移运用25马的恒定电流,直到离子达到凝胶底部的前面。电极缓冲区包含25毫米tris-HCl,甘氨酸0.19米,和0.1% SDS (w / v)。经过电泳,凝胶固定轨道振动的25%异丙醇溶液(v / v)和10%醋酸(v / v)为1小时,然后沾0.3% Coomassie蓝色r - 250解决方案(w / v), 30%甲醇(v / v), 10%乙酸(v / v)为1小时。鄙视的解决方案,包括30%甲醇的混合物(v / v)和10%的醋酸,是用来变色凝胶到乐队的出现。

2.3。傅立叶变换红外振动光谱

多层膜的特点是振动光谱的变化PerkinElmer谱100红外光谱提供一个通用的ATR抽样配件使用DiComp水晶,这是由钻石ATR的硒化锌(奈米)集中元素的直接接触钻石。光谱数据是4厘米的一项决议⁻¹和积累的数量是8。分析样本,在垂直于PET表面的许多地方鲑鱼肌肉坚持后来删除了尿素溶液治疗;100%的权力是用来记录光谱。

3所示。结果与讨论

鲑鱼的结果担心肌肉粘连种可以墙后清空容器和涉及这些领域的自然附着,后来与尿素变性解决方案。

图2(SEM)显示了鲑鱼粘附在样品的形态,没有尿素治疗。大马哈鱼肌肉坚持聚合物涂层,仍然附着在墙上。鲑鱼组件可能产生形态变化可以混淆与微观结构的蛋白质或氨基酸坚持宠物涂层;图2(一个)显示的部分肽多层不规则形态。聚合物表面显示毛孔和路德的乐队,在拉深过程中制造业的支持大马哈鱼肌肉的附着力。另一方面,数字2 (b)显示了鲑鱼的残留肌肉展示一个更常规肌肉形态(左)和强烈坚持蛋白质纤维的孔隙边缘后尿素治疗。旁边,还可以看到变性蛋白质内部的孔隙,尿素后仍坚持聚合物表面应用的解决方案。18个微米的孔隙大小的顺序,是生产过程中容器。

粘连主要表现为两个方面:首先,羰基之间的化学键的宠物涂层和大马哈鱼肌肉蛋白质的氨基酸组;其次,保护聚合物的表面状况,通过45度的钢层取向的顺序或气孔等缺陷的存在,微裂隙产生的机械形成高分子的容器。

孤立的存在缺陷和轴向变形的控制发生在机械成形过程中减少粘连(33),因为肌肉的依从性是一个条件,遵循保护涂层的物理化学相互作用由于抗生素和残留的最终持久性改变宠物的功能聚合物。聚合物的表征通过低维AFM观察相变和表面形貌的影响聚合物的鲑鱼肌肉粘连明显。图的三维图像3显示肌肉坚持表面;它还显示了明显的粗糙度和组织坚持宠物表面结构的体积。

这些表面不连续忙粘附的鲑鱼肌肉SEM观测所显示在图2。AFM分析显示8中的相变μm区,有或没有鲑鱼附着力检测在nanometric层面,从而改变原保护聚合物的表面状况。

3 d-afm宠物聚合物显示了纳米尺度的区域的图像鲑鱼表面粘附(突出)。这张照片代表了不同的材料之间的密切关系,并解释了存在的债券以SEM对尿素。在一段8μ米宽可以检测样品表面的附着力大马哈鱼肌肉残留高度达到135海里;这些残留物生成形态或结构的变化在聚合物上的某些点,促进物理化学相互作用可能由于保留材料的容器壁。

图4描绘一个宠物聚合物表面的XPS评价在microzones肌肉附着生物聚合物的聚合物,后来删除(肌肉)发生,表明宠物如上所述的特征光谱NTIS [34]。的元素,主要是氧气和二氧化碳,可以看到在控制和存储样本,显示小的差异在各自的峰值。没有证据表明氨基酸或蛋白质的氮坚持宠物表面检测到,鉴于其位置的外层聚合物需要进一步建模研究其光谱检测。另一方面,不存在污染物或元素的其他层聚合物表面的观察,一个方面的重要性因为organosilane-like保护层。

没有检测到的有机硅烷的光谱分析。这种化合物是包含在容器的制造和提供了一层,把它们疏水的添加剂(如以ODS-CH₃(CH₂)₁₇硅氮₃),作为一个保护屏障,防止残留的吸收在宠物聚合物解决方案的结构35]。从上面,我们可以推断,这将损害的功能涂层,如果聚合物成为退化,它还可以限制其回收作为ecomaterial的潜力。因为这些现象发生在存储的容器建议监测的技术更高的空间分辨率。

下的反相高效液相色谱方法用于这项研究显示存在结晶或半透明的材料样品的冻干后(图5),表明一些化合物的隔离(或化合物)从宠物表面;SEM表征表明,这种化合物可以从鲑鱼与淀粉样蛋白相关的肌肉。

那么这些样本resuspended在200年μL甲醇溶解晶体完全;其次是反相高效液相色谱法耦合热科学TSQ有利的三极四极质/女士探测器SRM量化提供最高的灵敏度确定抗生素florfenicol florfenicol胺,氯霉素,氧四环素,红霉素。没有这些抗生素检测的样本分析除了各自的生物复制(图6)。

样品是积极时,色谱图显示两个分明(24,36- - - - - -38为每个抗生素)和他们的特征保留时间。在这种特殊情况下,所有样品都显示这些特征峰的存在;面对面,对称基准没有山峰的存在是显而易见的。

必须指出的是,该技术用于量化是基于一个前体离子从抗生素的隔离;之后,这种离子collision-induced分离(CID)及其在第二个片段分析四极确认抗生素的存在通过确定至少两个产品离子,即一个确定性的高度显示数据。

水晶再次resuspended识别分子的质谱分析。为此,样本提交反相高效液相色谱法进行光谱分析考虑200年和1500年之间的质量范围达有一个更好的视角的分子。发现一些有机化合物的存在。的数据表明,一些山峰与胆固醇和α胡萝卜素。这是由比较获得的光谱质谱数据库的国家标准与技术研究院(NIST)(图7),表明100%的确定性α胡萝卜素;这些分子可以被转移到表面通过直接接触食品的内容可以和宠物涂层下的研究。

3.1。影响胆固醇和胡萝卜素的宠物

胆固醇是一种天然的有机分子(C₂₇H₄₆O)产生的细胞。时间变化的多不饱和脂肪酸的形成(欧米伽)和oxysterols在罐装产品(已报告39]。这项工作状态之间的相关性降低和增加欧米oxysterols占氧化的共同机制的存在。Oxysterols氧化胆固醇衍生品,原材料或结束时形成含有胆固醇都提交给热疗法、氧化剂或其他物理和/或化学条件。这是符合罐装鲑鱼的治疗;然而,考虑到从上述高效液相色谱测试结果,进一步分析评估肽是否坚持宠物聚合物会引起聚合物的结构保护是必需的。

此外,的存在α胡萝卜素在PET表面也可能需要进一步分析特别是考虑涂层的化学相互作用。它已被证明40]等其他类胡萝卜素虾青素,负责鲑鱼肉的颜色,是很好的抗氧化剂;也就是说,这些物质可以清除自由基。这些色素的抗氧化活性取决于很多因素,比如他们的化学结构(大小、取代基数量的顺反异构,等等),浓度、氧气分压,或与其他抗氧化剂。高分子量分子的存在,比如Da 8249.94和10836.04 Da保留时间为3.96和6.02分钟,也观察到,表明蛋白质和肽的存在,因为他们有一个特点的多个电荷(图模式8)。

由于执行12.5% sds - page检测高分子量的蛋白质;因此,10μL的每个样本加载到每个样本来验证蛋白质的存在,即每个样本及其生物复制受到电泳分离和凝胶是沾Coomassie蓝色的解决方案。肽的存在在所有车道和蛋白质中检测出车道4(图9)。蛋白质的车道乐队从100年达10 kDa图中清晰可见9。

反相高效液相色谱法具有高灵敏度检测化合物显示没有残留的抗生素;大马哈鱼肌肉的长期粘附宠物聚合物没有促进表面吸收;也没有证据表明观察ODS单层涂层,具有亲水保护功能,防止化合物的吸收(41]。然而,可以确定多肽和蛋白质的存在,它与相关的观测SEM和AFM微纳米级别,分别。

液相色谱(LC)和液相色谱-光谱法(质)被用于分析florfenicol存在的两个确定降解产物(甲砜和氯霉素)。药物显示不稳定在酸性、碱性和光解的应力条件主要以溶液形式(36]。这可能是符合罐装鲑鱼肌肉,我们已经确定,乳酸的pH值变化从3.5到5.0取决于新鲜的程度,因此促进退化或残留抗生素的不稳定性,尽管抗生素可能留在肌肉坚持宠物他们没有能力迁移或绑定到聚合物。

这种技术用于测定氧四环素在鲑鱼组织(37),显示高线性对所需的限制;然而,没有检测完成保护聚合物的容器,由于抗生素从肌肉中提取。

研究测定红霉素在药用salmonid鱼饲料表示为球团进行了液相色谱和光谱(38),在检测抗生素乐队3500厘米⁻¹;然而,没有遵守其在执行试验鱼肌肉及其转移容器的保护聚合物因此反映出本研究的原创性。

图10显示了傅立叶变换红外光谱分析的描述和验证化合物的存在从鲑鱼组织到宠物聚合物,附着力的附加信息的收集鲑鱼肌肉和其最终影响涂层由于抗生素残留的存在。几个退化地区相关的光谱与鲑鱼的依从性组织相比nondegraded区。上层M1和M2光谱属于muscle-adhered和urea-treated样本,分别从控制,而两个低光谱拉开PET-coated ECCS样品(1和2)。可以观察到典型的光谱,可以作为控制区分肌肉附着在聚合物表面。

光谱显示一些相似之处,但也在不同的地方不同的乐队表明坚持鲑鱼的部分是不同的。可以看到这些乐队在960厘米⁻¹,1260厘米⁻¹,1300厘米⁻¹,1440厘米⁻¹,1657厘米⁻¹。谱图显示了乐队和坚持肌肉之间的相关性,因此可以确定聚合物表面经历了任何损害(17]。上面的值表示没有显著影响聚合物表面结构;然而,它是可能的描述样本的不同区域。尽管如此,乐队960厘米⁻¹可以归因于磷酸基的对称振动,可能造成污染的三文鱼罐头过程中。光谱显示,没有证据表明任何抗生素的研究。值得一提的是,红外拉曼分析杰出的结晶形式活跃氯霉素截然不同的乐队在859,389,293厘米⁻¹(42]。

图10显示了乐队在970、1038、1163和1536厘米⁻¹生产和确认的样品,但没有观察到的控制。频带宽度的分析显示重要的光谱强度差异区域2700 - 3000厘米⁻¹相应的,ν(碳氢键)振动与检测相关肽(碳氢键)和由表面区域和减少退化。这是证实了文献[43),即蛋白质也可以发现在1800 - 1500厘米⁻¹(C = O - h、碳氮)和在该地区500 - 1200厘米⁻¹由蛋白质、脂类、碳水化合物(切断,P = O)。

另一方面,傅立叶变换红外光谱分析没有检测到明显的ODS乐队在PET表面,反对XPS的成果;也就是说,乐队在2962 CH₃-、2924和2854 ch₂——在光谱区2800 - 3000厘米⁻¹没有检测到(44]。前者可以解释为执行特性的分析;红外光谱分析是进行震源深度5μ米从涂层表面,而XPS测量进行宠物的最外层原子涂层。使用的技术允许我们歧视和验证的鲑鱼粘附聚合物涂层的影响。

低维的工具用于特征和物理化学分析证明拥有巨大的潜力来确定抗生素的存在,污染物,和化合物water-enclosed环境中发生在水产养殖,打算保持食品质量和保持生态系统不受这些物质。

4所示。结论

本研究评估鲑鱼到宠物聚合物涂料的附着力受雇于罐装过程来检测潜在的抗生素残留在他们的应用程序的水产养殖行业。没有可检测水平测试的抗生素被发现。然而,质谱法分析检测有机分子的痕迹,明显区别的存在α胡萝卜素和氧化胆固醇可自然中发现鱼的肌肉像鲑鱼。我们也决定多肽和蛋白质的质谱分析和电泳(sds - page)在变性条件。

与上面所示的信息我们已经清楚地得出结论,有机分子如颜料(类胡萝卜素)、胆固醇和蛋白质绑定到聚合物宠物涂层。这些微量元素需要进一步的研究来确定其对保护的影响聚合物。

宠物的形态表征聚合物领域的鲑鱼粘附显示均匀接触表面的扫描电子显微镜(SEM)观察;然而,我们证实,表面毛孔,粗糙,或者聚合物microfolds青睐附着肌肉蛋白的容器。

一小部分肌肉仍然附着在宠物,证明强化学键的聚合物纳米粗糙度的表面,导致坚持作为一个方面证明了AFM分析显示相变与表面不同程度的倾向。

光谱分析显示,宠物的存在,以及鲑鱼组织坚持聚合物表面。鲑鱼粘连或退化的地区表面显示小显微结构的变化;宠物聚合物与小尿素的痕迹没有显示相同的结晶度透露的拉曼频率较低。

傅立叶变换红外光谱结果特征的存在和粘附聚合物鲑鱼肌肉,尿素的活动方案,阐明坚持坚持的条件,通过波长乐队,治疗后的解决方案。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者欣然承认Fondecyt通过拨款计划Conicyt智利的金融支持。1130634和智利大学南国的特殊贡献。

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