文摘

漆stellacyanin被连续分离和纯化漆丙酮粉交联葡聚糖列色谱使用交联葡聚糖50,DEAE 50及50凝胶。纯化漆stellacyanin有蓝色与一个主要和三个小乐队在26 k和SDS页面。考察了胰蛋白酶和chymotrypsin-treated漆stellacyanins LC / MS / MS确定三个N-glycosylation网站(N28 N60, N102),并进一步分析了MALDI TOF MS,表明N-linked聚糖被附加到三天冬酰胺(Asn)网站,分别。此外,胰蛋白酶消化和PNGase和PNGase F治疗后的分裂N-linked聚糖Asn网站,发现漆stellacyanin有木糖包含biantennary N-linked多糖与核心fucosylation组成的13个糖残基(一个复杂类型N-linked多糖)的MALDI TOF MS分析。这是第一次报告的结构N-linked漆stellacyanin多糖。

1。介绍

漆液是一种天然漆,漆酶聚合,儿茶酚的oxidoreductive酶,给电影与光荣的耐用。漆液是一种油包水乳液主要由漆酚,多糖、糖蛋白、漆酶,stellacyanin [1]。其中,stellacyanin漆酶一样,是一个铜的糖蛋白;它第一次被描述为一个蓝色的糖蛋白Keilin和曼于1940年(2]。stellacyanin漆是一种低分子量蛋白质(约20 kDa)和一个107个氨基酸残基的多肽链和一个铜原子。自从糖蛋白被确认为stellacyanin [3),蛋白质类似于漆stellacyanin一直孤立从黄瓜4),南瓜皮(5)、菠菜叶(6),和山葵根(7]。这些糖蛋白植物特定的糖蛋白属于phytocyanin cupredoxins的子类。Stellacyanin电子转运蛋白(8),参与氧化还原过程主要国防、木质素形成,和细胞间的信号传输;然而,确切的生理功能尚不清楚(9- - - - - -11]。此外,植物糖蛋白N-linked聚糖已经被证明能够影响催化活性、热稳定性、木质素形成、折叠或亚细胞定位,和分泌12,13]。最近,人们发现N-linked聚糖可能发挥作用在植物病原体集成和功能模式识别受体(14]。去除复杂类型N-glycans从植物糖蛋白突变修改N-linked聚糖在一些植物,拟南芥和烟草,证明没有或小对植物生长的影响15]。结构分析的碳水化合物组成的漆stellacyanin,没有发表的结果除了一纸色谱分离水解单糖的stellacyanin Peisach等人于1967年(16]。

我们已经调查了漆的结构和特定的生物活性多糖在日本和中国漆削弱了。漆多糖的相对分子量被高分辨率核磁共振测量分析,揭示漆多糖是酸性多糖,()- - -β-D-galactopyranan主链与葡萄糖醛酸组成的复杂的分支在终端(17]。发现lacquebr多糖减少小鼠肉瘤180肿瘤的生长和血液coagulation-promoting活动相比,控制(18]。硫酸盐化作用后,漆多糖表现出强大的抗艾滋病和低抗凝血活动。这些特定的生物活性应该源自酸性分支结构(18]。此外,用碱性溶液稀释透露,漆多糖治疗协会建立了低分子量多糖(19]。

糖基化是最常见的一种肽的重要修改,改变蛋白质的功能。一般来说,N-linked聚糖位于一个天冬酰胺(Asn)残留的三肽序列,Asn-X-Ser或刺,其中X是脯氨酸以外的任何氨基酸(20.]。有三种可能的N-glycosylation网站(Asn-X-Seror刺)的氨基酸序列stellacyanin (N28、N60 N102) (21]。质谱(MS)是有价值的和快速分析技术来分析结构的聚糖在蛋白质组学和蛋白质结合酶治疗(22]。首次在这项研究中,我们报告的结构分析N-linked聚糖在漆stellacyanin由基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI TOF MS)和液相色谱质谱加上电喷雾电离串联质谱(LC / MS / MS)酶消化后在漆sap stellacyanin功能的说明。

2。材料和方法

2.1。材料

漆丙酮粉是由添加丙酮漆sap根据Reinhammar方法报道(23]。CM-Sephadex 50和DEAE-Sephadex 50从医疗生物科技购买AB,瑞典。从猪胰脏胰蛋白酶(≥10000单位/毫克),α从牛胰腺胰凝乳蛋白酶(61.75户/毫克)、二硫苏糖醇(德勤),碘乙酰胺(IAA)和三氟乙酸(组织)从西格玛奥德里奇,获得日本。Peptide-N-Glycosidase (PNGase)杏仁和Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F)从罗氏公司购买。其他试剂,节细菌属ureafaciens从Nakalai唾液酸酶,BlotGlyco多糖纯化和标记工具(bs - 45603)住友电木有限公司,有限公司,2,5-dihydroxybenzoic酸(DHB)作为MALDI-TOF矩阵/女士从力量Daltonics GmbH, 10 - 20%梯度凝胶(E-T1020L), EZ标记(ae - 1440)标准,并从阿公司Coomassie蓝色的sds - page分析,日本,被使用。

2.2。隔离和净化的漆Stellacyanin丙酮粉

漆丙酮粉(20 g),这是由Reinhammar的方法(23),是溶解在200毫升0.01磷酸钾缓冲溶液pH值(6.0),然后在4°C搅拌过夜。混合物是离心机然后过滤删除任何不溶性材料。滤液色谱仪在CM-Sephadex 50列(250 mm×40毫米)收集漆漆酶和stellacyanin蓝色colorbands筛选了0.1米和0.2米磷酸缓冲溶液pH值(6.0),分别。漆stellacyanin进一步纯化,DEAE-Sephadex 50柱层析法(500 mm×20 mm)和后续CM-Sephadex 50柱层析法(500 mm×20 mm)逐步筛选了0.005米,0.025米,0.05米,0.1米磷酸缓冲的解决方案。蓝色终于脱盐的洗脱液用去离子水透析过夜然后冻干给0.233克(1.17%)和0.083克(0.42%)的纯漆漆酶和stellacyanin,分别。

2.3。制备Copper-Free Stellacyanin

蓝色stellacyanin (56 mg)溶解在20%三氯乙酸水溶液(10毫升),和蓝色混合搅拌直到消失。对去离子水透析后一夜之间,然后冷冻干燥给无色stellacyanin没有铜。纯化stellacyanin的纯度和分子量测定sds - page和MALDI TOF MS,分别。

2.4。酶消化和N-Glycan标签

漆stellacyanin悬浮在0.1 NH(1毫克)₄HCO₃解决方案,德勤(5μL, 120毫米)添加,然后混合孵化了30分钟60°C。混合物添加10μL (IAA(123毫米),在室温下在黑暗中孵化1 h给carboxamide-methylated stellacyanin,哪个没有净化用于下一个酶消化。胰蛋白酶(1毫克)或胰凝乳蛋白酶(1毫克)解决方案1毫升0.1 NH₄HCO₃(10μL)添加到上述carboxamide-methylated stellacyanin解决方案和孵化一夜之间在37°C和25°C,分别消化stellacyanin,然后混合物加热到95°C到变性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。

的trypsin-digested stellacyanin deglycosylated添加0.25 U PNGase pH值在5.0 (hcooh调整0.1%)和5 U PNGase F在pH值8.5,分别在一夜之间在37°C。消化N-glycans贴上- ((aminooxy)乙酰)tryptophanylarginine甲酯(aoWR)通过使用BlotGlyco多糖纯化和标记设备根据制造商的协议,然后aoWR-labelled聚糖被清理净化柱根据制造商的协议(24]。的chymotrypsin-digested stellacyanin也接受0.25 U PNGase和5 U PNGase F,分别通过上述过程给aoWR-labelled聚糖。

2.5。唾液酸酶治疗

漆stellacyanin(0.5毫克)处理节细菌属ureafaciens唾液酸酶(1.0 U在50 mM三羟甲基氨基甲烷/ HCI缓冲液)在一夜之间在pH值5.6和37°C确认存在与否的唾液酸聚糖。

2.6。MALDI TOF MS

MALDI TOF MS光谱被记录在一个Ultraflex II仪器(力量Daltonics)在反射模式下的加速电压在正离子模式下25 kV(正电压极性)。使用提供的光谱女士是自动FlexControl软件3.0版本。外部校准进行了单独收取单一同位素的山峰肽标准(1046.5 Da血管紧张素ⅱ,1296.6 Da血管紧张素I, 1347.7 Da P物质,1619.8 Da蛙皮素,和2093.0,3474.5 ACTH剪辑肽)。DHB矩阵在乙腈/水(3:7,v / v)被用于的MALDI TOF MS测量aoWR-labelled N-glycans, trypsin-digested肽、糖肽混合物。的aoWR-labelled N-glycans主要是检测作为质子化了的分子离子[M + H]⁺。唾液酸残基在多糖被甲基(羧基酯化库奇舞₃;质量信号增加+ 14.02),和计算的确切质量聚糖多糖的质量[M] =[观察m / z−−447.21 + 18.01 (14.02×)−1.00,447.21是aoWR标签试剂的质量唾液酸的数量。

2.7。LC / MS / MS

LC / MS / MS进行使用液相色谱(日本岛津公司LC系统)串联质谱(AB SCIEX API 4000问陷阱)系统,涡轮喷射源和电喷雾电离(ESI)。一个ODS柱(TSK-Gel ODS - 80 - ts (5μ米)ID为2.5毫米×15厘米和啧啧保护盒(5μ米)ID为3.2毫米×1.5厘米)曾在30°C。组织所使用的洗脱液(A) 0.1% 90%乙腈和组织(B) 0.1% 10%乙腈与0.2毫升/分钟的流量在120分钟的梯度程序。和MS / MS谱中获得积极的电离方式收购时间每秒0.63光谱。

女士也,以下数据是通过增强(EMS)女士的扫描速率是4000 Da / s,扫描范围是100 - 2800 Da,固定线性离子阱(点燃)全职10 MS,和Q0了检查。增强分辨率女士(ER),扫描速率是250 Da / s,固定点燃全职10 MS, Q0上,依赖和信息采集(IDA)标准插入选择1 - 3最强烈的山峰;离子大于400 (m / z)和小于1500 (m / z)和峰值强度超过50000 cps被选择。最后,两个增强产品离子(EPI)实验研究,扫描速率是4000 Da / s,扫描范围是100 - 2500,固定点燃全职50毫秒,Q0捕获。

4.0数据处理女士DataAnalyst糖肽分析通过使用默认设置。在糖肤肽序列通过蛋白酶被BioAnalyst注释(肽序列)和MS / MS分析附加聚糖是手动解释。蛋白质的信息可以在UniProt ID号P00302和条目名称STEL_TOXVR (http://www.uniprot.org/uniprot/P00302)。

3所示。结果与讨论

3.1。净化和漆Stellacyanin分子量

计划1显示了酶法水解的漆stellacyanin分析方案。漆stellacyanin是分离和纯化漆丙酮粉,这是通过增加丙酮漆液,通过连续列网交联葡聚糖和DEAE A50凝胶色谱法。图1sds - page概要文件,显示了(a) (b) MALDI TOF MS概要文件,(c)漆stellacyanin的氨基酸序列。证实了纯化漆stellacyanin sds - page,表明漆stellacyanin有一个主要和三个小乐队在26 kDa。乐队非常接近对方,如图1(一)。我们使用这个漆stellacyanin没有进一步净化。图1 (b)显示了MALDI TOF MS谱漆stellacyanin使用DHB作为矩阵,在这几个信号,至少有四个高峰出现在17000 - 19000 Da与一个强大的和三个弱信号。最强的信号出现约18700哒。这些结果表明,漆stellacyanin不是一个单一的蛋白质,但由同功酶相同的蛋白质。SDS - page电泳的分子量大的MALDI TOF MS,可能由于SDS的线性结构。图1 (c)展品的氨基酸序列漆stellacyanin根据文献[21]。漆stellacyanin有107个氨基酸残基,氨基酸残基的分子量是12296哒。因此,碳水化合物的分子量部分的漆stellacyanin约达7000人。

3.2。糖肤的LC / MS / MS分析

识别的漆stellacyanin N-glycosylation网站,trypsin-digested肽和糖肤直接分析LC / MS / MS没有任何分离和净化因为LC / MS / MS是一个高分辨率的工具,用于分析混合样品的液相色谱(LC)系统。我们使用两个不同的蛋白酶,胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,获得三种可能N-glycosylation网站,包含Asn N-linked多糖从stellacyanin的氨基酸序列。糖肤的识别,trypsin-digested肽的混合物和糖肤选择性地检测到提取离子色谱(XIC)显示,它包含了多糖的标志m / z204.1由于葡萄糖胺,GlcNAc⁺。标记提取离子的总离子色谱(TIC) LC / MS概要文件,然后它出现在几个地区XIC分离。我们确定了三个糖肤N-linked Asn28多糖,Asn60 Asn102,基于肽的理论质量;这些都是没有₂₈K (m / zNYQSCN = 605.2)₆₀DTTPIASYNTGBBR (m / z= 2291.9),VHIN_102年VTVR (m / z= 937.5)如表所示1。糖肤的MS / MS谱进行了分析,然后是信号m / z= 204.1 (GlcNAc₁),m / z= 366.1(加+ GlcNAc)m / z= 512.1 (Fuc +加+ GlcNAc)由于N-linked聚糖碎片离子,以及b和y型寡肽的糖苷键裂解碎片离子非常经常观察到。确认后胰蛋白酶N-glycopeptides派生的MS / MS,附加N-linked聚糖的特性是基于他们的产品离子光谱。

的LC / MS / MS谱trypsin-digested漆stellacyanin图所示2。抽搐和XIC包含m / z= 204.1离子信号由于GlcNAc给出数据2(一个)和2 (b)。一个糖肽是₂₈K与Asn Asn28观察13 - 15分钟左右在抽搐,和最强烈的离子信号m / z= 605.2与寡肽的分子量部分。从观察到的分子量在图2 (c)和MS / MS的糖肤在605.4和2286.7之间(8),N-linked多糖在Asn28特征(HexNAc) 4(十六进制)5 (Fuc) 3 xyl,从产品获得一个复杂类型多糖与双重带电离子光谱m / z= 1399.87。其他形式的复杂类型聚糖Asn28中观察到,如表所示2。

的trypsin-derived N-glycopeptide NYQSCNDTTPIASYNTGBBR (m / z= 2291.7)轴承Asn60观察作为一个长肽只有一个GlcNAc残渣附着在肽在MS / MS谱图3(一个)。然而,当我们使用胰凝乳蛋白酶的消化漆stellacyanin,一个N-linked多糖得到寡肽,QSCNDTTPIASY (m / z= 1356.5)由LC / MS / MS分析如图3。因此,同一N-linked HexNAc的多糖结构₄十六进制₅Fuc₃Xyl₁在Asn60也确认了。我们还发现,同样的复杂类型多糖是连接Asn102胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行消化和随后的LC / MS / MS分析。这些结果总结表1。

Trypsin-digested寡肽和oligoglycosyl肽也应用MALDI TOF MS没有任何进一步净化。之间的信号m / z= 700年至4500年观测到的来自trypsin-digested寡肽和oligoglycosyl肽(数据见支持信息)。最强的信号出现在m / z= 4487.4由于糖肤Asn60轴承一个复杂类型N-linked多糖的分子量2192。从MALDI TOF MS分析,海藻糖和xylose-containing复杂类型biantennary多糖与漆stellacyanin三个Asn网站。海藻糖和木糖应该连接到旁边的GlcNAc Asn在中央甘露糖残基,分别。

3.3。MALDI TOF MS分析漆Stellacyanin N-Linked聚糖

隔离和净化后的漆stellacyanin,胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消解时,分别给消化肽和糖肤。每个产品进一步接受PNGase PNGase F,分别从Asn分裂N-linked聚糖负担N-linked聚糖,由使用标签BlotGlyco多糖纯化和标记设备给aoWR-labelled N-linked聚糖。的aoWR-labelled N-linked聚糖是混合矩阵(DHB),然后进行MALDI TOF MS提供初始信息的相对数量N-linked聚糖漆stellacyanin中给出。图4显示的MALDI TOF MS谱aoWR-labelled N-linked聚糖后(a)和(b) PNGase PNGase F漆stellacyanin的消化。观察到的质量数量增加447.21由于aoWR标签试剂相比underived N-linked聚糖。尽管出现在相同的信号m / z位置数据4(一)和4 (b),强度略有不同。这些结果表明,N-linked漆stellacyanin中多糖岩藻糖在旁边的葡萄糖胺Asn因为PNGase释放N-linked聚糖有或没有α1,3-fucosylated GlcNAc Asn和PNGase F劈开N-linked聚糖旁边α1,6-fucosylated GlcNAc。表2显示的结构N-linked聚糖的基础上m / z在MALDI TOF MS谱图4。最强烈的峰值(1号)m / z2642年被分配到一个复杂类型N-linked多糖组成的四氨基葡萄糖(HexNAc),五个己糖(十六进制),三个海藻糖(Fuc),和一个木糖(Xyl),也就是说,(HexNAc) 4(十六进制)5 (Fuc) 3 Xyl(那些遵循相同的描述)2),这表明主要的低聚糖在漆stellacyanin复杂类型N-linked多糖。这种类型的N-linked多糖是植物中最常见的结构,有一个α1、3联系fucosylated GlcNAc Asn旁边,和一个β1、2与木糖应该连接到中央甘露糖残基(20.]。其他信号的峰值,数字2 - 7日图4,减少了质量数据的m / z2642年,这表明一个或多个糖残基裂解的N-linked多糖(HexNAc) 4(十六进制)5 (Fuc) 3 xyl如图4。这些结果表明,漆stellacyanin有相同的复杂类型N-linked多糖的三Asn网站。

MALDI TOF MS谱的漆stellacyanin与唾液酸酶处理和未经处理的,这两个光谱是相同的。此外,该信号m / z由于NeuAc = 292.1,m / z由于NeuAc-H = 274₂啊,,m / z= 657.1由于十六进制+ HexNAc + NeuAc诊断或标记离子来自sialylated糖肤。然而,这些信号出现在LC / MS / MS谱。这些结果表明,N-linked多糖在漆stellacyanin没有唾液酸。

4所示。结论

由酶来进行MALDI TOF MS和LC / MS / MS分析,我们发现的结构N-linked多糖和oligoglycopeptides三Asn残留(Asn28, Asn60, Asn102)漆stellacyanin,表明N-linked多糖三个Asn网站有相同的结构,是一个biantennary复杂类型N-linked多糖含有海藻糖在旁边GlcNAc Asn,木糖在中央甘露糖残基。复杂类型N-linked多糖在漆stellacyanin确认是最常见的N-linked在植物多糖。没有唾液酸漆stellacyanin确认。这是第一次报告的结构表征N-linked聚糖漆stellacyanin从采用vernicifera,phytocyanin植物糖蛋白的家庭。描述的N-linked聚糖漆漆酶还在调查之中。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

本研究在一定程度上支持科学研究补助金从日本促进社会科学2012 - 2014(没有。24550129)。