应用生物可降解Polyhydroxyalkanoates作为腹疝修补术的手术电影在老鼠身上

文摘

的细胞毒性和生物安全聚- (3-hydroxybutyrate) (P3HB)和聚(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (P3HBV)电影使用3 t3成纤维细胞进行体外和体内通过皮下植入电影的老鼠。体外试验表明,endotoxin-free P3HB和P3HBV电影允许细胞附着和生长。Film-soaked条件媒体显示没有明显的抑制或细胞毒性对细胞增殖的影响。体内吸收试验表明,P3HB和P3HBV电影慢慢退化,P3HB较慢的降解率比P3HBV。疝修补术中应用P3HB电影展示了一种有利的结果:这部电影能够正确诱导的腹腹疝结缔组织和脂肪的生成和展出极慢的速度下降。此外,P3HB电影展示的优势降低肠道粘附到腹疝站点相比P3HBV和PP商业电影。

1。介绍

各种类型的合成和生物膜已经开发成网格疝修补术(1,2]。理想网格的主要特征包括良好的修复能力和良好的生物相容性1,3]。目前使用最广泛的材料是聚丙烯(PP),基于网格的各种重量、纤维尺寸、孔隙大小和编织结构(4- - - - - -6]。这样的PP网格提供破裂强度高的优点;因此高刚性,网迁移和收缩很少发生在修复。尽管复发疝是一种少见的并发症使用PP网格时,他们倾向于诱导慢性炎症反应纤维和组织到网格体系结构。这提供了一个机会的粘附肠循环到网植入,导致进步的硬度,腹痛,或严重后果取决于粘连的程度(1,3,5,7]。某些生物网格被引入临床使用疝修补术就是用人类——或者animal-originated组织移植物(3,8)和制造collagen-rich韧带等组织和皮肤移植的细胞内容完全移除。由此产生的细胞胶原蛋白矩阵提供了一个替代装置疝修补术。与合成网格相比,生物网格是柔软和矩阵支架可以用病人自己的组织逐渐取代[8,9]。这解决了出现异物感和反应问题,使用PP网格。然而,生物网格的破裂强度相对较低,他们更脆弱,尤其是当发生突然腹部压力增加。这种缺乏完整性和复发的问题已报告在使用这些生物材料临床并发症(3,8]。理想网格,满足所有的要求永久疝修补术,也就是说,生物相容性高,低水平的异物感,和长期生物力学支持,还有待发现。

Polyhydroxyalkanoates (pha)新兴材料生产医疗设备(10- - - - - -13]。pha是天然产物的微生物作为碳和能源存储材料在有限的条件下氮、磷的来源。大多数pha展览脂肪族聚酯的结构的碳,氧和氢。不同长度的碳链和一个广泛的函数组,PHA聚合物包括超过150选民,功能多样化的特点(14]。在各种PHA聚合物,聚- (3-hydroxybutyrate) (P3HB)和聚(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (P3HBV)是最著名的生物材料,具有低bioreactivity和生物降解速度缓慢12,14- - - - - -16]。尽管大多数努力制造这些PHA聚合物已经在塑料行业新兴需求组织工程已促使许多研究的医学应用PHA聚合物。医学使用P3HB和P3HBV一直在广泛调查各种类型的手术材料的发展。P3HB-composed补丁测试,防止粘附在心脏手术心脏和胸骨之间(17- - - - - -19]。在动物和人类研究中,P3HB补丁大大降低术后粘连的发生率观察在长短期[17,18]。P3HB和P3HBV表已被用作再生衔接和指导材料组织如神经纤维(20.)和骨(21,22]。P3HB补丁作为支架材料修复小腿的心房中隔缺损,展示明显再生的心房中隔墙逐渐退化补丁的巨噬细胞(23]。其他测试功能的P3HB P3HBV-based材料包括心血管支架,为牙科治疗障碍的电影,microparticulate运营商对药11- - - - - -14]。然而,没有研究调查P3HB或P3HBV疝修补术的电影。

在这项研究中,我们评估了P3HB和P3HBV电影在腹疝修补术中的应用。P3HB和P3HBV电影的生物相容性测试体外,及其bioabsorption和疝修补术能力评估在9月期间体内。

2。材料和方法

2.1。聚合物的电影

使用重组P3HB(98%)产生大肠杆菌在我们的实验室XL1蓝色24]。P3HBV (5 wt % 3-hydroxyvalerate)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。电影制作过程介绍了在我们之前的研究24]。总之,聚合物电影准备使用氯仿铸造方法。聚合物溶液(1.63 wt %)是涌入Φ10厘米的玻璃培养皿和干在一个通风橱获得polymer-thin电影。结果电影干在环境温度为3 d罩移除残留氯仿。P3HB physics-chemical属性和P3HBV聚合物电影表中列出1。确保影片endotoxin-free,他们进一步处理35%过氧化氢(H₂O₂在80°C) 1 h [25]。内毒素浓度确定使用ToxinSensor生色LAL内毒素试验装备(美国新泽西州GenScript,皮斯卡塔韦)。电影是在层流无菌水清洗和干燥柜供实验使用。商用PP膜(巴德软网)是购自Davel Inc .(美国国际扶轮华威)和孔隙大小的1 - 1.5毫米。

2.1.1。直接接触细胞毒性测试

底部的电影被放置在一个6-well板;随后,4×10⁵小鼠成纤维细胞3 t3细胞培养基被播种到井。板当时湿润37°C孵化有限公司₂孵化器。48小时后,培养基被丢弃和电影洗两次磷酸盐(PBS)和1%的福尔马林溶液固定。电影3 t3细胞的生长是可视化用结晶紫染色法和量化使用显微图像。最终结果是平均从3独立实验。

2.1.2。间接接触细胞毒性测试

电影是浸泡在培养基,轻轻的在动摇一个轨道振动器在37°C。同时,细胞被播种在6-well板4×10的细胞密度⁵/培养基。24小时后,条件培养基是收获和离心机200 g×3分钟,上层的保留。3 t3细胞的培养基是吸气,和PBS缓冲的细胞被洗两次。随后,条件培养基添加到指定的井。这些细胞被湿润37°C孵化有限公司₂孵化器为另一个48 h。观察细胞生长,细胞在每个固定1%福尔马林溶液结晶紫染色紧随其后。细胞密度量化使用显微图像。最终结果是平均从3独立实验。

2.2。动物

本研究的动物实验是实验动物研究批准委员会远东纪念医院,台湾,根据实验动物中心的指导方针进行远东纪念医院。有没有雄性balb / c小鼠体重15 -通用汽车被用于实验。老鼠提供食物和水随意在十二12 h昼夜周期(灯从0600年到1800年),室温保持在大约20°C。

2.3。Bioabsorption测试

有没有雄性balb / c小鼠购买国家实验动物中心,台北,台湾。小鼠体重与氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪(100毫克/公斤,10毫克/公斤,职责)。聚合物膜切成1厘米×1厘米,大约2.5毫克,植入腹壁皮下地区。在不同的时间点(0.5、1、3和9 mo),相邻的电影植入皮肤和肌肉组织切除和固定在10%福尔马林24 h。固定的组织被嵌入在石蜡和切成5μ米厚的部分。苏木精和伊红染色()),后部分被用于组织学评估组织应对各种各样的电影。剩下的膜厚度测量使用图像J软件(由美国国立卫生研究院)。在每个时间点,在每组6小鼠使用。

2.4。疝修补术能力测试

有没有雄性balb / c小鼠购买国家实验动物中心,台北,台湾。小鼠体重与氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪(100毫克/公斤,10毫克/公斤,职责)。聚合物膜切成1厘米×1厘米,大约2.5毫克。腹疝介绍了通过创建一个0.5厘米×0.5厘米穿刺在腹侧腹壁的肌肉层。这部电影被用来覆盖穿刺,和电影的4个角落缝合疝地区周围的肌肉组织。在不同的时间点(0.5、1、3和9 mo),老鼠laparotomized通过中线,附着力与相邻器官观察。腹部疝的修补被拍到,植入电影与相邻的皮肤和腹部肌肉层切除和固定在10%福尔马林24 h。固定的组织被嵌入在石蜡和切成5μ米厚的部分,沾)评估组织学上残留膜区域和附近的组织反应。在每个时间点,在每组6小鼠使用。

2.5。对巨噬细胞免疫组织化学

组织部分deparaffinized和水化,紧随其后的是高压灭菌法在pH值6.0柠檬酸缓冲(121°C, 15分钟)抗原检索。内源性过氧化物酶活动被禁止使用DAKO peroxidase-blocking试剂(DAKO、丹麦)。的主要anti-mouse anti-CD68单克隆抗体(ab31630 Abcam,剑桥,英国)使用的稀释1:50和孵化部分在一夜之间在4°C。一只兔子anti-mouse二级抗体(DAKO)随后补充道,和幻灯片在室温下孵化1 h。color-developing代理3 3′-diaminobenzidine (DAB) (Abcam)和孵化部分添加了10分钟。部分被与苏木精复染色,推动组织的可视化。

2.6。统计分析

学生的以及用于评估不同群体之间的差异,只有在接受了统计学意义。

3所示。结果

P3HB的物理性能和热行为和P3HBV电影用于这项研究在桌子上1报道说,在我们以前的工作(24]。

3.1。制备Endotoxin-Free P3HB和P3HBV电影

木糖醇,发现电影外的革兰氏阴性细菌,如大肠杆菌是一个类的成员,磷脂叫做脂多糖。因为P3HB生产使用大肠杆菌之前,必须去除内毒素的电影可以用在医学应用。美国食品药品监督管理局批准的医疗器械的内毒素浓度是0.005欧盟/ g (26]。原P3HB粉可以包含一个内毒素浓度高达21 100欧盟/ g。一次氯仿铸造过程用于生产一种膜,P3HB电影中的内毒素浓度可以减少到1790年欧盟/ g。获得fda批准的标准,我们进一步消除痕迹内毒素的电影通过使用传统的H₂O₂浸泡法(25),成功地降低内毒素水平小于0.001欧盟/ g。同样,内毒素在P3HBV电影(460年欧盟/ g)被检测阈下水平(小于0.005欧盟/ g)。

3.2。体外细胞毒性试验为P3HB和P3HBV电影

调查P3HB膜的生物相容性,我们进行了体外细胞毒性分析ISO10993-5中指定的标准,包括直接和间接接触测试(27]。3 t3细胞小鼠成纤维细胞系用于测试。P3HB和P3HBV电影前后内毒素去除进行了测试比较。

直接接触测试,电影被放置在底部,和3 t3细胞直接播种到培养基的电影。48 h后,细胞在电影和控制好(没有电影)是固定的,与结晶紫染色。细胞生长在每个电影拍摄(图1(一)),相对细胞密度计算核在每部电影的数量除以,在控制好。一些细胞能够生长在endotoxin-containing P3HB P3HBV电影;相对细胞密度对这些电影0.72%±0.35%和8.86%±3.06%,分别为(图1 (b))。相比之下,3 t3细胞的生长更丰富的endotoxin-free P3HB P3HBV电影;相对细胞密度在endotoxin-free P3HB和P3HBV电影37.84%±2.99%和60.60%±7.76%,分别,都是明显高于那些endotoxin-containing P3HB和P3HBV电影(P3HB组和P3HBV集团)(图0.00041 (b))。这个结果表明,3 t3细胞能够附加和成长在P3HB和P3HBV电影经历了内毒素去除。

间接接触测试,3 t3细胞孵化条件媒体,这是之前浸泡表示电影48 h。孵化的另一个48 h后,细胞生长在每个被拍到(图2(一个)),相对细胞密度计算在每个核的数量除以,在控制好。要么没有观察到细胞或很少可行的细胞生长在培养基endotoxin-containing P3HB和P3HBV电影(0%和29%±9.68%的相对细胞密度,resp。)(图2 (b))。相比之下,类似的增长率被观察的条件培养基endotoxin-removed P3HB和P3HBV电影(92.27%±8.38%和96.78%±8.16%的相对细胞密度,分别地。,这两个都明显高于那些endotoxin-containing P3HB和P3HBV电影(P3HB组和0.0007 P3HBV集团))(图2 (b))。这意味着无论是endotoxin-free P3HB P3HBV电影也可以释放有毒因素显著危害3 t3细胞。

总的来说,这些体外接触化验表明,内毒素去除后,P3HB和P3HBV电影证明了低细胞毒性和高生物安全在促进成纤维细胞的依恋和增长。

3.3。体内组织反应和Bioabsorption P3HB P3HBV电影

探讨P3HB体内细胞相互作用和P3HBV电影,这个endotoxin-free P3HB电影,P3HBV电影,PP网植入皮下的老鼠。这部电影的植入大小是1厘米×1厘米。在不同时间点(0.5、1、3和9 mo)植入后,植入物,相邻的皮肤,和腹壁区域切除和固定。利用组织切片和染色),我们观察到组织应对每部电影和膜厚度随时间的变化。P3HB和P3HBV植入显示板结构衬里的中性粒细胞在0.5到1 mo周围的电影。在3莫,P3HB和P3HBV电影已经层的结缔组织包围,和组织层厚积累,特别是在P3HBV电影。6和9,中性粒细胞浸润显著降低(图3(一个))。观察PP膜丝的圈子里,很快就被完全覆盖的影响层结缔组织后植入(0.5莫)。周围的中性粒细胞浸润纤维明显从0.5到6 mo和稍微减少9帽(图3(一个))。这些观察表明,P3HB和P3HBV电影引起组织反应类似于PP膜但程度不一样,持续时间更短。

P3HBV电影开始分裂成更小的碎片在早期的时间点(从1 mo)和碎片的数量显著增加。相比之下,P3HB电影后保持结构的完整性,断成几截3莫(图3(一个))。比较的体内bioabsorption P3HB P3HBV电影,电影残余的相对百分比在不同时间点的计算是通过测量膜厚的横截面。如图3 (b)这两部电影的厚度随时间慢慢减少。P3HB薄膜的厚度分别为81.82%±5.95%在3 9莫莫和74.14%±9.82%。的相对厚度P3HBV电影在3 72.37%±3.94%莫莫(图9点和53.18%±4.46%3 (b))。P3HBV电影相对更快的吸收比P3HB电影()。根据这些结果,我们得出的结论是,P3HB和P3HBV电影bioabsorbable和不同退化速度和模式。

3.4。体内的腹疝修补术的能力P3HB和P3HBV电影

探讨腹疝修补术的体内P3HB和P3HBV电影的能力,我们设计了一个腹疝模型小鼠通过删除0.5厘米×0.5厘米从腹部肌肉壁穿孔疝。endotoxin-free电影被用来盖穿孔地区使用point-fixed方法缝合。所有的动物在手术和没有感染的迹象或拒绝展出。最重要的是,没有疝突出观察9莫实验期间。在不同的时间点(0、0.5、1、3和9 mo)手术后,从每组小鼠安乐死,疝固定的状态和组织粘连被记录。组织从维修站点,包括电影,相邻的皮肤,和腹壁,收获了固定、组织切片、染色)。在0.5莫,我们观察到P3HB和P3HBV电影变得透明,血管变得hernia-covered地区(图4(一))。在1和3,遮满了电影更多的组织向内成长,透明窗口的电影明显变小。在9月,整个电影是完全嵌入到越来越多的组织和血管(图4(一))。

术后粘连是其中一个关键因素在决定理想的疝修补材料。每部电影分级是根据粘附强度的概率从0到3,0 =没有粘连,“1 =“粘连与温柔的紧张,很容易被释放”,2 =“与钝性剥离粘连,可以释放,”,3 =“粘连,需要大幅解剖分离”(28]。如图4 (b)的平均强度不同的电影在不同的时间点进行了比较。结果表明,P3HB电影引起附着力小于P3HBV电影或PP网在研究时间点(),而P3HBV附着力等级相似的PP网()。

3.5。组织学检查的疝修补术

我们观察到的显微结构变化的疝修补术网站基于圆)染色和慢性炎症反应的程度用CD68-positive巨噬细胞染色莫(图9点5(一个))。与bioabsorption测试(图一致3),P3HBV膜有较高的降解率比P3HB电影。P3HB膜的炎症反应是有限的,而且只有一层薄薄的衬里结缔组织被膜,用一层厚厚的脂肪细胞面对腹膜腔。P3HBV电影引发的炎症反应并不是缺失或减弱,就像在bioabsorption测试在同一时间点。高度退化的碎片P3HBV电影被淋巴细胞包围,形成了一层结缔组织修复网站。巨噬细胞的数量很低,他们只找到附近的断裂片段(图5(一个))。人民党电影也导致沉重的炎症反应,甚至表现出一个肉芽肿形成维修站点(图5(一个))。

我们比较组织厚度维修站点的各种材料。P3HB, P3HBV和PP组表现出的厚度μ米,μm,μm,分别在9帽(图5 (b))。这些数据表明,疝修补术使用P3HB电影造成更少的组织增厚而使用P3HBV电影()或聚丙烯网()。

4所示。讨论

Adhesion-related腹疝修补术的手术后并发症一直是一个关键问题页的使用网格。生物网格证明间接免疫与组织互动,但没有表现出相对较弱的修复力量与合成网格(3,7,9]。寻找新一代材料提供PP的优点和合成网正在进行。新的聚合物和混合型合成材料测试和评估antiadhesive品质(29日- - - - - -33]。在这个研究中,我们表明,PHA-derived疝修补材料是一个潜在的选择。PHA材料测试医疗使用的手术修复,尤其是预防粘连(34]。这是第一个研究使用PHA材料作为疝修补术的电影。我们的研究结果表明,两种类型的PHA电影,P3HB尤其适合使用在疝修补术。

P3HB的生物相容性和P3HBV一直得到广泛的研究在体外和体内。Korsatko等人报道没有显著P3HB对小鼠成纤维细胞的细胞生长的影响(35]。斋藤等人使用P3HB电影进行炎症测试绒毛膜尿囊的电影的鸡蛋和报道,聚合物薄膜没有造成大的炎症(36]。Chaput等人评估细胞反应P3HBV通过直接接触分析和报道,固体聚合物对细胞有轻微的影响(15]。讨厌测试提取的细胞毒性效应的P3HBV利用小鼠成纤维细胞细胞培养和报道,提取稍微抑制细胞活性(37]。对于体内测试,柯南道尔等人证明P3HB支架植入后没有引起慢性炎症反应在兔子12。Chaput等人观察到的组织反应在羊P3HBV电影长达90周,揭示急性炎症反应减少移植后1周,在11周。此外,电影最终被封装的纤维组织和大量的脂肪细胞(15,38]。同样,Gogolewski et al。(1993)监控组织应对P3HB和报道,在聚合物纤维囊出现厚1 mo,成为逐渐由6 mo(薄39]。这些研究显示,P3HB和P3HBV都是生物相容性、无毒材料,可以被认为是潜在的候选人在医疗设备中使用。

P3HB评估在体外降解的早期研究[14),显示P3HB电影退化极为缓慢在磷酸缓冲和人类血清在37°C和这部电影持续减肥只有5%的6个月。在我们的研究中,P3HB电影更快的体内生物降解及其厚度减少了19%和26%,3和9月,分别(图3 (b))。厚度和结构分解损失发生在早些时候P3HBV电影比P3HB电影(图3 (b))。

P3HB电影表现出优越的性能在影响低水平的组织响应,低粘附率相比P3HBV和PP(数字3(一个)和4 (b))。9点莫疝修补术之后,用一层薄薄的一层结缔组织丰富脂肪细胞的修复。高脂肪的积累的原因P3HB电影还不清楚。然而,这些脂肪细胞可能是一个关键因素的粘附率极低P3HB电影(数字4和5)。与P3HB电影相比,P3HBV电影展示了相对较高的组织反应,可能是因为它的高降解率和更多的碎片。因此,P3HBV修复诱导一个紧凑和厚层的结缔组织。结缔组织和腹腔之间的界面是相当光滑,表现出脂肪细胞(图5)。P3HBV膜的粘附率略低于PP网(图4 (b))。修复的PP网形状不规则,免疫细胞和网状纤维混纺,结缔组织,一些膜结构在腹腔(图5(一个))。免疫反应对所有3电影持续时间比bioabsorption疝修补术实验实验。这可能导致疝伤口和与腹腔的交互而不是腹壁。然而,最异物反应,特别是对PP网,导致进步的组织生长。这可能是其高水平的术后并发症的主要原因。

5。结论

这项研究的结果表明PHA的电影,尤其是P3HB疝固定的潜在材料。这样的电影可以进一步修改,通过与不同比例的3-hydroxyvalerate P3HBV,例如。或者,一个双层膜P3HB面临着腹膜腔可以降低附着力等级;P3HBV面临真皮的一面可以加厚组织生长修复网站。总之,PHA-based电影未来疝修补术的强大的和有前途的材料。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢台湾的国家科学委员会的财务支持本研究在格兰特NSC号101 - 2632 - e - 155 - 001 - my3和102 - 2221 - e - 155 - 056。

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