文摘

Polyhydroxybutyrate (PHB)被广泛用作生物材料在医学和组织工程的应用,结晶度相对较高限制了其应用。混合的PHB与乙基纤维素(等)容易实现减少PHB结晶度和促进其降解在生理条件下没有过度的对生物相容性的影响。材料强度复合电影持平在6.50.6 MPa为40% (w / w)等载荷。PHB相分离两个生物聚合物之间的决心与结晶度减少从63%到47%的电影相同的加载。这降低结晶度支持复合薄膜的降解率的增加从0.39到0.81%的工作⁻¹分别的PHB及其组合。没有明显的形态学变化,观察嗅鞘细胞的增殖与复合材料尽管平均表面粗糙度(显著增加R_一个从2.90到3.65)的电影m的PHB和混合80% (w / w)等。

1。介绍

Polyhydroxyalkanoates (pha)是一个家庭的biopolyesters合成一系列微生物物种的环境压力条件下过量的碳(1]。目前,pha组成的一个或多个已确定,包括超过150种不同的单体单元产生的商业polyhydroxybutyrate (PHB) [2,3]。PHB是最普遍的研究成员PHA家庭可生物降解和生物相容性和用作医疗器械生物塑料和生物材料(图1)[4]。

微生物的PHB由β-hydroxybutyric酸(HBA)单体单元,也是哺乳动物细胞产生的酮体条件下的饥饿和糖尿病和被认为是促进生物相容性的微生物同行,在缺乏木糖醇,不触发任何哺乳动物细胞毒性反应(5]。福斯特和Tighe表明微生物HBA的化学性质和哺乳动物的HBA,意识到哺乳动物的酶(5,6]。微生物产生的PHB不会引发免疫和炎症反应或导致吻合的失败7]。PHB作为生物材料,已被用于各种生物医学设备如缝合、假肢装置,为手术和药物输送系统和应用程序(8]。然而,PHB的结晶性质,其脆性和低弹性,长降解率在生理条件下,加工性能差限制其潜在的组织工程(9]。修改的PHB生化的和材料属性通过copolymerising和混合了成功操纵这些属性尤其是作为促生长的环境但有限的成功应用在生物医学的场景中(10,11]。

类似于PHB,乙基纤维素(等)也是一个FDA -(美国食品和药物管理局)批准的生物材料,广泛用作血液凝血剂,涂料制药平板电脑,不溶性药物和矩阵(12]。乙基纤维素也被用作一个框架稳定药物释放的药物传输系统通过纤维素表面亲水界面(13]。此外,研究表明,等容易消化的酶在人体14]。相比之下,通过非生物水解降解PHB的收益,在生理条件下是一个缓慢的过程采取年完全降解[15]。PHB退化的速度提高了混合的PHB与其他聚合物如三乙酸纤维素(CTAc)和挂钩(16,17]。

虽然有各种各样的报告PHB-based混合,研究使用纤维素衍生品是有限的。在这项研究中,我们报告的操纵的PHB生化的和材料属性通过添加乙基纤维素作为混合剂的生产复合PHB-Etc生物材料电影(图1)。

2。实验

2.1。试剂

Polyhydroxybutyrate (PHB)的自然起源、乙基纤维素(48%乙氧基)和胰蛋白酶买来西格玛奥德里奇(澳大利亚悉尼;图1)。分析级氯仿和二甲亚砜(DMSO)从Univar购买,(罗马、澳大利亚)。哺乳动物细胞生长介质,胎牛血清(的边后卫)和青霉素/链球菌抗生素取自Gibco-Invitrogen(澳大利亚悉尼)。近年在杜尔贝科修改鹰的常规培养介质(DMEM / F12)补充10%的边后卫从Lonza购买(美国)。

2.2。电影制作

生物聚合物薄膜是由溶剂铸造按Zhang et al。18]。PHB等样品的重量比为100:0,80:20日60:40岁,40:60岁和20:80 (w / w)加热溶解在氯仿在无菌密封容器(5% w / v, 160 rpm, 50°C)。解决方案是允许冷却(22°C, 160 rpm, 15分钟)涌入无菌之前,玻璃培养皿和溶剂蒸发站(12小时,22°C)。由此产生的电影随后被维持在40°C下真空退火前48小时内删除任何溶剂残留在70°C 10天。

2.3。材料描述

PHB的材料性质和PHB-EtC电影进行分析使用一个拉伸试验仪(美国instron - 5543) 22°C相对湿度为30%。电影样本(30毫米×15毫米)被夹到校准张力计使用气动控制缓慢移动分开min(20毫米⁻¹)。破坏时的最大负荷,抗拉强度和延伸使用Bluehill计算机软件(美国)计算。意味着至少10个样本测定(n= 10)。

PHB-EtC电影的热性能检测使用DSC-1明星^e系统(梅特勒-托利多,美国)。样品(5毫克)密封在平底锅和加热10°C min⁻¹从25°C到200°C获得熔化温度()和熔化焓()。样品被冷却以同样的速度从200°C从−−50°C和加热50°C到25°C获得玻璃化转变温度()。混合(Blend-X_cPHB)和(PHB-X_c)相结晶度计算使用(1),分别19] 在哪里PHB的熔化焓(146詹⁻¹)[19),在混合膜的PHB的百分比。意味着至少15样品测定(n= 15)。

X射线衍射模式的PHB-EtC复合材料获得使用飞利浦X 'pert材料研究衍射(MRD)系统(荷兰)。电影样本(毫米)固定在玻片与2θ,z设在和ω扫描(散射角的范围= 10 - 30°和扫描步长为0.02°连续)。辐射的波长(铜K-Alpha)生成使用1.5406的幂45千伏,电流管40 mA。

傅里叶变换红外(FTIR)是在那些时光iS10 PHB-EtC电影使用Nicolet FTIR光谱仪(美国热科学)。红外光谱谱获得900至1800厘米⁻¹波数通过积累64扫描分辨率为0.5厘米⁻¹。光学与氮清除从二氧化碳和水蒸气抑制信号。

2.4。降解研究

Preweighed PHB-EtC电影(25×10毫米)的样本通过γ辐照杀菌处理,放入2毫升埃普多夫管。样本(37°C, 150 rpm)孵化后的磷酸缓冲盐(0.1 M, pH值7.4)和青霉素(100毫升⁻¹),链霉素(100μ克毫升⁻¹(2.5)和fungizone-amphotericin Bμ克毫升⁻¹)。每隔周期样本删除、过滤和干燥在干燥器(40°C, 24 h)允许适应之前22°C(气压上平衡重)。四个样品每个时间点,每个样本,测定。降解实验,从促进et al。修改,进行了超过105天(6]。减肥(%)计算: 在哪里W是减肥和比例和分别孵化后的初始体重和体重;5样品的测定(n= 5)。

2.5。细胞的研究

小鼠嗅鞘细胞(近年)栽培介质包含(青霉素DMEM, 10%的边后卫,250户,250人μ克毫升⁻¹链霉素和1μ克毫升⁻¹fungizone-amphotericin B)在t - 75组织培养瓶培养在37°C公司为5%₂(20.]。近年从瓶中取出使用胰蛋白酶(2.5%)70%的融合和细胞的数量大约2×10⁵细胞毫升⁻¹用于接种的电影(13×13毫米)样品。在周期性间隔,样本牺牲,电影10毫升的PBS冲洗两次,2毫升的胰蛋白酶(2.5%)随后补充说在孵化前(37°C, 2分钟)。在经过3天观察细胞增殖和细胞生存能力计算使用血球计和台盼蓝排斥法(20.]。样品进行了一式三份(n= 3)。

2.6。显微镜

细胞对PHB-based电影视觉效果在使用显微镜。电影与磷酸盐缓冲盐水冲洗两次(PBS 1%)和固定在2.5%戊二醛在0.1 M PBS缓冲(pH值7.2,4°C, 12小时)。电影三次然后用PBS缓冲洗5分钟时间,在1%锇四氧化二(OsO后缀₄1小时)。缓冲洗后,样本顺序在乙醇脱水(30%,50%,70%,80%,90%,95%,和100%,每10分钟)和临界点干燥,改编自涌et al。21]。标本被安装在铝存根和表面涂上一层黄金粒子使用溅射涂布机(Emitech K550x,英格兰)。样本随后检查使用扫描电子显微镜(日本日立S3400-I) 15 kV和750 mA。

的微貌PHB-EtC电影映射使用反射模式的激光共焦扫描显微镜(CSLM TCS-SP徕卡模式,德国)激发和发射波长的458和440 - 470海里,分别。多个图像通过z面记录(步长= 2.5μ米)。共有30个图像被用来生成一个三维深度图和计算平均表面粗糙度值()根据ISO 4298(2000)使用ImageJ软件(美国国立卫生研究所的): 平均表面粗糙度()计算从采样长度(l)、飞机(z)和违规行为的变化(dx从平均线)3]。

2.7。统计分析

数据显示每组的均值和标准差。一个学生的t以及测试执行意义有95%的信心。

3所示。结果与讨论

3.1。PHB-Etc电影描述

红外光谱是分子环境敏感的地方,因此被广泛应用于研究大分子之间的相互作用在结晶过程中(22]。在这项研究中,红外光谱测量在溶剂铸造的PHB电影显示特征光谱峰值为1721和1229 cm⁻¹分配给拉伸的C = O组和C-O-C债券,分别在水晶矩阵。而在1450年达到顶峰,1380厘米⁻¹非对称和对称甲基变形的特点,那些在1260年,1229年和1044厘米吗⁻¹与碳氢键分配给C-O-C拉伸变形,在无定形区域和C-CH C-O-C拉伸₃拉伸(23,24]。混合的PHB与等负荷的增加逐渐减少光谱的峰值强度属于水晶的PHB作为非晶复合材料的内容增加。相反Kumagai等人报道的PHB的混合与三乙酸纤维素(16),我们并没有解决谱峰的变化表明没有特定的两个生物高聚物组件(即之间的相互作用。氢键)。光谱似乎是简单的PHB半晶质等(图的线性组合2)。

差示扫描量热法(DSC)没有显著改变熔点(mp, 175±4°C)和玻璃化转变温度(Tg、1±1°C)的PHB在复合(图3)。然而,PHB融合焓变()从92减少到10 g J⁻¹电影中有80% (w / w)等。x射线衍射模式和极大值,观察到14日,17日,22日和26°,PHB-Etc复合材料与先前的研究(图一致4)[25]。随着等荷载的增加相对峰值强度降低,这样的组合为80% (w / w)等加载显示更广泛的频谱峰值在14和17°才明显。没有观察PHB晶体结构的破坏,进一步支持红外光谱数据显示明显的分离结晶的PHB从无定形的PHB等地区为半晶质矩阵等连锁困在PHB薄片(26,27]。Scandola的研究结果是一致的,他们研究了PHB相行为等混合和混合对环境恶化的影响这些复合材料(27]。

区分晶体和无定形区域显示等内容的增加,混合比例结晶度下降从63.5±3.3%[的电影19PHB在电影9.2±1.5%当电影拥有PHB只有20% (w / w)。(图5(一个))。同样,增加负载的PHB等扰乱了结晶过程减少了约32%,至31.5±4.2%和80% (w / w)等加载符合张等人的工作报告的PHB的混合淀粉醋酸(图5(一个))[18]。

薄膜结晶度的变化结果的混合等,预计影响PHB-EtC复合材料特性的电影。然而,图5 (b)没有重大变化在抗拉强度等加载增加到40% (w / w)在一个戏剧性的减少从大约6.83±1.05,0.84±0.33 MPa(图5 (b))。相比之下,打破电影显示一个明显的线性扩展从PHB 1.58 + 0.38%降低到0.52 + 0.12%复合材料含有60% (w / w)等()。加维等人表明,结晶增加退火PHB-EtC电影同样的PHB退火相比,电影(28]。此外,相对较高的使用温度在电影制作已经被证明可以支持成核和球粒的形成的PHB电影同时减少PHB颗粒之间的距离矩阵(9]。在这项研究中,PHB-EtC复合材料为20% (w / w)等载荷退火25°C表现出最佳的力学性能,抗拉强度和延伸在断点保存(图5 (b))。

3.2。电影退化

除了影响材料性能,结晶度也可以规定非生物降解行为。减少的PHB分数结晶度使电影更渗透水分子,从而增加水解的酯键29日]。当在生理条件下孵化(pH值7.4,37°C, 160 rpm)的PHB和复合材料电影与载荷高达40% (w / w)等无显著减肥第一40天,而电影等载荷表现出较高的减肥后20天(图6)。图6清楚地表明,增加PHB-EtC电影增加了退化等加载,这样的PHB电影失去了大约3.5%的初始体重105天后孵化时复合材料为20% (w / w)的PHB损失了大约12%的初始重量。此外,减肥速度是线性和显著增加(从0.39%)工作⁻¹周PHB电影0.81和1.34%⁻¹PHB对混合40 - 80% (w / w)等。

3.3。细胞反应PHB-Etc电影

PHB的混合与等商业吸引力的生物聚合物都是FDA批准,已经证明成功生物医学设备。混合与PHB等降低了结晶度和允许操作的电影在生理条件下材料特性和更有利的退化。在这项研究中,在生物相容性的影响等的PHB电影比较使用成人嗅鞘细胞(近年)。图7表明PHB近年容易附着及其复合20% (w / w)等,表现出健康与许多灯丝扩展与细胞形态以异步控制与生物材料的缺失。此外,虽然那时细胞似乎略大的PHB均聚物,这些都是本研究过程中不显著(图8)。在所有情况下,OEC生存期间保持超过95%的电影研究的持续时间。

不规则多孔表面PHB-based电影已经被证明影响细胞粘附和生长(29日]。微貌的电影清楚显示表面结构变化的结果等混合(图9)。深度地图来自这些图像被用来确定平均表面粗糙度的(按ISO 4298(图)10)。PHB电影表现出2.91±0.12μ增加了米,等内容也增加了。综合电影与80% (w / w)等载荷最不规则表面大大增强值为3.74±0.10μm(图10,)。这里的研究相比,赵等。报道,增加表面粗糙度在PHA电影减少小鼠成纤维细胞附件,与细胞显然更平滑的表面(30.]。

4所示。结论

的高度结晶性质的PHB作为医疗器械的生物材料限制了其应用。操纵的成分和处理是用来促进PHB-based设备更有利的属性(31日,32]。在这里的研究报告中,我们结合的PHB与另一个fda批准的生物材料,乙基纤维素。混合这两个组件生产复合膜的结晶度显著减少生理条件下促进其降解但没有显著影响材料性能或生物相容性。预计的添加控制退火能有效“裁缝”PHB-based生物材料通过混合支持生物医学设备制造神经导管等神经再生以及矩阵组织工程的发展。