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法比奥Fenili, Amedea曼,伊丽莎白·Ranucci保罗Ferruti, ”保利(amidoamine)水凝胶作为细胞培养支架和管道周围神经再生”,国际高分子科学杂志》上, 卷。2011年, 文章的ID161749年, 20. 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/161749
保利(amidoamine)水凝胶作为细胞培养支架和管道周围神经再生
文摘
可生物降解和生物相容性的聚(amidoamine)——(PAA)为基础的水凝胶被认为是不同的组织工程应用。第一代AGMA1水凝胶,两性但普遍含有羧基和胍组阳离子水凝胶作为取代基的一面,结果令人满意的粘附和增殖特性对不同的细胞系。不幸的是,这些水凝胶非常膨胀性材料,易碎物品处理,发现了不足为其他应用程序。为了克服这个问题,第二代AGMA1水凝胶已准备采取一种新的合成方法。这些新水凝胶具有良好的生物特性在体外令人满意的力学特性。他们得到了在不同形式和形状和成功测试了在活的有机体内对周围神经的再生。本文报道了我们最近的努力的使用第一代PAA水凝胶为基质细胞培养和管状支架周围神经再生。
1。介绍
组织损失或终末期器官衰竭引起的伤害或其他类型的损失是最具破坏性的和昂贵的问题之一在人类医疗保健。手术策略开发解决这些问题包括从一个个体器官移植到另一个,从一个健康的网站转移到病变组织网站在同一个人,和更换使用机械设备,如人工关节或透析机器。此外,医疗补充包含代谢产品的非功能性组织。尽管取得了重大进展在卫生保健方面的治疗选择,仍然存在许多局限性和尚未解决的问题(1]。器官用于移植的数量远远超过患者的数量需要这样的程序。在欧洲仅在2010年,大约有9300人在等待器官移植的名单由于终末期器官衰竭,但只有3100例移植手术进行(2]。组织转移不能取代原始组织的所有功能和熊供区并发症的风险。
组织工程”是一个跨学科的领域,应用工程和生命科学的原理对恢复的生物替代品的发展,维持或改善组织或器官功能。”这个定义是基于几篇文章,由兰格和文森提发表在1990年代(3- - - - - -6]。在这些文章中提出了组织工程替代器官移植当其他治疗失败时使用三个主要策略。第一,利用孤立的细胞,它有很大的优势取代真正需要的细胞,最终注入前基因操纵它们。这个策略允许微创手术,但总有免疫排斥或失败的可能性在维护新的功能。第二种方法是使用tissue-inducing物质,如生长因子或细胞因子。然而,这种解决方案的缺点是净化和大规模生产问题,它总是需要有一个系统来实现其目标的生物活性分子。最后,第三个策略利用细胞放置在一个支架,作为合成细胞外基质细胞组织成一个三维的建筑和呈现刺激的直接的生长和形成所需的组织(7]。这种策略目前用于组织工程。
支架可以从天然材料制造或合成聚合物。一般来说,理想的支架应该是三维的,高度多孔的、相互连接的孔隙网络和生物相容性,降解速率控制,应该有一个适当的表面细胞粘附、增殖、分化,应保持适当的机械性能。在所有的合成高分子材料发现适合组织工程应用,最近特别关注生物可降解聚合物和水凝胶。一些评论在文学描述自然的使用(8- - - - - -15和合成16- - - - - -20.]可生物降解的聚合物以及一些非生物降解的21,22),目前用于软骨、神经修复、骨骼、心脏、血管移植,和许多其他组织工程应用。在合成材料中,一直注意增加水凝胶由于其组织如属性对于活细胞的相互作用,如类似的含水量和渗透氧气和代谢物(23]。合成水凝胶,而不是自然派生的材料,更有利,给的可能性完全控制水凝胶组成、表面性质和其他关键参数吸水和(生物)降解时间等。此外,水凝胶结构可以用来封装细胞,蛋白质,和信号的因素,以及生物活性在细胞生长缓慢释放[半个24]。本文报道了我们最近的努力的使用第一代聚(amidoamine)水凝胶基质细胞培养和管状支架周围神经再生。
2。保利(amidoamine)水凝胶:合成和性质
PAAs的家庭合成聚合物含有叔氨基和酰氨组定期安排在他们的聚合物链25,26]。他们是通过Michael-type加聚合的一级或二级胺bis-acrylamides(计划1)。
PAAs是极其多才多艺的材料。PAAs包含其他取代基侧化学功能,如附加叔氨基、羧基、羟基、和烯丙基组,可以很容易地获得通过使用适当的官能团单体,例如amino-carbohydrate衍生品(27]。肽和蛋白质也可以通过终端参与加聚合反应以及氨基酸组ε赖氨酸氨基酸组,如果存在(26- - - - - -28]。许多PAAs展览的组合属性传授他们相当大的潜在生物医学领域(见下表1)。他们是高度亲水和通常在水降低媒体的速度取决于它们的结构(29日]。此外,他们中的很多人几乎无毒,尽管polycationic自然,与集成电路50值从0.5到3.0毫克/毫升(30.,31日]。两性PAAs, PAAs带羧基组作为取代基的一面,甚至更少的有毒和可能构成的生物相容性与葡聚糖(32]。
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交联PAAs可以很容易地通过不同的方法。到目前为止,最常采用的方法是主要的二元胺作为交联剂引入到聚合混合物(33]。主要二元胺进行四种不同移动氢,因此像四功能化合物的单体在PAA合成(计划2)。典型的水凝胶交联PAAs,吸收大量的水,如果他们交联程度并不是太高。
另一个合成过程导致PAA-hydrogels包括制备线性PAA携带主要氨基酸吊坠,如两性(NH之一2BAC)由加聚合monoprotonated EDA BAC(计划3)[34]。可以使用此PAA作为多功能交联剂的二元胺(35]。
两性PAAs的聚合物链包含酰胺、胺,和羧酸盐组在常规序列,在某种意义上可以被认为是蛋白质像合成材料。事实上,他们与蛋白质具有良好的兼容性,比如白蛋白。它也表明,不同的分子和生物分子,如寡肽和蛋白质(36),能够繁殖receptorial网站的蛋白质在细胞粘附发挥着根本性的作用,如纤连蛋白、层粘连蛋白,vitronectin [37]。其中,目前最受欢迎的三肽RGD (38]。
最近peptidomimetic PAA, AGMA1上贴上标签,已经被加聚合反应得到2,以叔(acrylamido)醋酸胍基丁胺(4-aminobutyl胍)(39- - - - - -41]。报道在图1,AGMA1胍和羧基组,展示了一个强大的和RGD序列结构的相似之处。
Agmatine-containing PAAs水凝胶,容易获得使用4-aminobutyl胍胺单体,完全cytocompatible也显示非凡的粘附和增殖特性对几种细胞系(42]。
胍基丁胺主要包含一个氨基和一个胍组携带五个潜在的移动可能参与加聚合反应的氢。因此,一个潜在的交联剂主要在PAA合成二元胺EDA。尽管如此,一个大的差异之间存在基本性质胍基丁胺的胺和胍组。后者已经pK一个> 12,远高于任何脂肪族胺,和仍然是质子化了的条件下从事PAA合成(表2)。
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退化的测试条件下进行选择的PAA水凝胶模仿体液(pH值7.4和37°C)显示,他们的降解产物是完全无毒的42]。PAAs退化的机制似乎是纯粹的水解没有乙烯基组,比如那些将来自一个β消除反应,可以确定。此外,降解似乎不受孤立的溶酶体酶的存在在pH值5.5 [43,44]。
3所示。保利(amidoamine)水凝胶作为细胞培养基质
在过去的几年里生物科学的进步导致了优秀体外细胞培养领域的发展。一些新技术,如细胞微阵列或细胞芯片,需要可靠的支持材料有良好的生物相容性和细胞粘附、优先一次性和易于使用45,46]。传统上,细胞培养是进行二维基质表面或组织类似物。目前,各种聚合物材料,聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)和聚丙烯(PP),应用常见的散装材料的二维细胞培养系统,如膜细胞培养和细胞培养。组织培养聚苯乙烯(安全和)是最常见的细胞培养基质由于其易加工性能和光学透明,但它仍然需要修改与聚(D-lysine)确保细胞粘附47]。在所有的合成高分子材料,已经发现合适的基质细胞培养,特别注意最近水凝胶。水凝胶存在独特的组织如属性与活细胞相互作用[23,48),如含水量和渗透氧气和代谢物。原则上,完全合成的水凝胶,而不是自然派生的媒体(如明胶、壳聚糖等),应该更有利,耦合上述性质的可能性完全控制水凝胶组成、交联、肿胀。水凝胶可以生产定制的形状和厚度,甚至在3 d结构,其表面可以用光刻技术(有图案的49,50]。此外,水凝胶可适切地携带生物分子获得定制的属性。细胞粘附在完全合成的水凝胶,然而,仍然是一个问题对于许多材料,水凝胶、交联等挂钩的衍生品(51]。一系列的化学和物理的修改提出了要克服这个问题,常常依赖于合成表面的改性生物和仿生半个,多肽或蛋白质(52通常,arginine-glycine-aspartate (RGD)。细胞粘附过程的底物,天然ECM和合成材料,是由细胞表面配体和受体之间的相互作用,如跨膜整合蛋白和蛋白聚糖(53]。三肽RGD,出现在几个ECM蛋白质,被密集的研究在过去几年的对象54]。事实上,一些研究已经表明,这三肽,和它的一些类似物,可以整合素家族的adhesion-regulating蛋白质相互作用和促进细胞粘附和传播中发挥作用,模仿一些ECM蛋白质的影响,如纤连蛋白或vitronectin [55- - - - - -57]。整体的作用机制仍不完全清楚,但一些研究相关的构象胍精氨酸的侧基,和它的距离和角度酸性吊坠的天冬氨酸(58,59]。改性的化学结构包括一个RGD或RGD-like团体已经提出了一些应用程序,需要细胞相互作用来增强附着力或识别细胞受体(60,61年]。
也曾试验过不同的PAA水凝胶作为细胞培养基质。他们一直使用不同的cross-linkers准备,如EDA, 1, 10-diaminododecane或线性NH2bac携带主要氨基酸吊坠(表3)。
细胞毒性测试进行了直接接触法与水凝胶纤维母细胞细胞系的原生状态(即。作为自由基地),盐与酸不同的强度,即盐酸、硫酸、醋酸和乳酸。这已经完成,以确定是否有任何counterion-specific对细胞毒性的影响。人们已经发现,所有的两性PAA水凝胶都cytobiocompatible视为自由基地和盐(图2),他们的生物性能是独立的反离子的性质33)(图3)。
(一)
(b)
(c)
降解测试一直在进行选择水凝胶样品受控条件下模拟生物环境,也就是说,杜尔贝科介质pH值7.4和37°C。所有样品完全降解和溶解在10天内。所有样品的降解产物已经证明是noncytotoxic [33]。
PAA-AG1和PAA-AG2生物活性方面允许细胞粘附和进一步扩散。细胞生长的形态学上的表面水凝胶相当与细胞生长在安全和用作控制。在所有情况下,细胞融合已经达到10天后从一开始的实验42)(图4)。
(一)
(b)
肿胀试验都证明了PAA水凝胶具有较高的膨胀能力。这个属性,而不是意想不到的考虑所有研究PAA水凝胶的亲水性和离子性质,确保一个有效的低分子量物质的扩散,从而促进净化过程在广泛的提取和水组成。然而,机械强度水凝胶的膨胀形式是温和和材料出现相对脆弱。PAA水凝胶的溶胀与不同的酸质子化了的仍然是非常高的,而不是显著不同,相应的自由基地,除了硫酸盐,稍微不那么肿了。
系统响应的比较研究上执行一个上皮细胞系AGMA1-EDA水凝胶,在nonfunctionalized两性ISA23-EDA水凝胶,和组织培养塑料基板(62年,65年]。正如前面指出的,AGMA1重复单位(图1)非常类似于著名的adhesion-modulating RGD肽序列。因为ISA23不携带任何侧基胍,它预计将显示没有明显的细胞粘附特性(33),作为nonfunctionalized控制。为了使水凝胶更方便,一个新的双层系统设计,准备和测试。它是由一个官能团玻璃覆盖着一层薄薄的水凝胶层的支持。MDCK细胞一直在镀两种水凝胶和安全和。电镀后1小时内,没有明显的差异是观察AGMA1-EDA和ISA23-EDA之间,和在这些基质粘附细胞的数量明显低于在安全和(图5)。3小时后,这一趋势是明显不同的,和粘附AGMA1-EDA比得上在安全和(在一个标准偏差)而ISA23-EDA仍然肯定降低(图5)。
1 - 2天后,在安全和有效的MDCK细胞增殖是观察,而这一过程在AGMA1-EDA似乎慢了下来(图6)。
3天后,与此同时安全和实现融合的细胞,细胞AGMA1-EDA形成集群和没有融合观察报告,如图7。
(一)
(b)
这种效应可能考虑解释说,尽管PAA水凝胶层是由刚性材料,细胞可能经历一个比安全和兼容的衬底。光学图像表明,细胞粘附AGMA1-EDA传播关于安全和较低。这种行为可以归因于发生相反的刺激细胞:合规的水凝胶表面,可防止cell-substratum强相互作用和应力纤维的形成,和整合素配体的存在,有利于更有效cell-substratum附着力。肌动蛋白纤维压力的行为在不同的基板图所示8。AGMA1-EDA慢肌动蛋白纤维形成压力,ISA23-EDA匹配这些水凝胶扩散越慢。基质的化学与物理特征属性可以参与影响细胞粘附。已经表明,表示clusterized整合素配体的形式使焦接触和应力纤维的形成(66年和决定细胞扩散67年]。整合素配体的均匀低密度,相反,无法支持应力纤维的形成66年]。因此,慢扩散和压力纤维形成AGMA1-EDA水凝胶也可能由于更多统一的(即不是clusterized)的整合素配体安全和相比。也是有趣的注意,ISA23-EDA细胞群岛经常显示膜结构为丝状伪足和板状伪足指示不稳定焦点联系和倾向于细胞迁移68年]。
4所示。PAA水凝胶微流体和实验室芯片的应用
微流体处理液体的精确控制和操纵几何约束小,通常亚毫米,规模。这是一个多学科领域交叉工程、物理学、化学、制造技术,生物技术,实际应用系统的设计等,将使用小体积的液体。
微流体出现了1980年代初,是用于DNA芯片的发展,实验室芯片技术,micropropulsion和低温技术(69年- - - - - -71年]。
除了构建生物材料ECM-derived细胞粘附分子,有证据表明表面形貌,僵硬和电气性能发挥重要作用在细胞粘附和生长72年]。基于这些前提,ISA23-EDA水凝胶已被用于图案衬底的制备使用扫描电子显微镜。暴露的方法包括水凝胶干燥电影电子束(计算机辅助)在高真空室63年]。荧光标记,FITC或TRITC、蛋白质如BSA、荷尔蒙EGF FITC,和生物分子Phalloidin-TRITC,附加有选择地electron-beam-modified表面以剂量依赖的方式。更高的曝光剂量导致更高的蛋白质或生物分子附件。细胞,如MDCK和PC12,花纹表面镀。MDCK细胞增长是观察到的所有表面,独立于模式或其他物理和化学的修改。PC12细胞,可以分化成神经细胞在神经生长因子诱导时,提出了一种强烈的偏好electron-beam-modified衬底。24-hours-PC12细胞培养,神经生长因子摘要,一直生长在一个水凝胶的桌面面积图9(总面积600×600μ米)。包含交替暴露和nonexposed广场(100×100μ米),细胞总数的84%(400细胞)在electron-beam-exposed广场(图9)[63年]。
(一)
(b)
利用的选择性吸附生长和分化PC12细胞microwells薄连接的通道,我们的神经突起来的单个细胞神经网络的扩展以及巩膜(63年]。这个神经网络的精细控制进一步加强,输出的数量是由神经突的数量对于来自每个microwell(图10)。
(一)
(b)
(c)
电子束光刻在PAA水凝胶打开生产多功能微流体设备支持的机会在一个小玻璃芯片,将复杂的地形,可以精确地控制单个细胞的生长和组织和提供能力研究生理和药理反应在单个细胞水平。
5。PAA水凝胶作为周围神经再生的支架
周围神经损伤形成重大的临床挑战世界各地(73年]。外围神经系统受伤是常见的,残疾的主要来源,影响肌肉和/或移动的能力感到正常感觉或导致痛苦的疾病。由于在治疗此类伤害的困难,许多病人没有任何好处的医疗干预。即使在周围神经外伤的患者接受治疗,50%以上没有明显复苏的迹象,否则遭受大幅减少肌肉力量(74年]。
神经创伤后,标准的临床操作过程由反对两个神经末梢和缝合在一起没有产生张力。当切断神经末端的缺陷太大不能直接缝合,神经损伤是由自体神经移植物桥接。虽然是最好的临床自体桥梁可用的今天,因为他们是生物相容性、无毒和提供一个支持结构促进轴突的粘连,这种方法有很多缺点。其中包括需要二次手术,施主能级的损失函数,有限的可用性、形态不匹配引起的(感觉神经被用来修理汽车或混合神经),或移植供体和神经瘤的形成。
各种组织工程策略被用来影响再生过程的不同方面希望功能恢复使用天然和合成管状支架。脚手架的设计标准制造应该解决各种因素包括成分(75年)和维度的管状支架76年),添加外源因素,如纤维蛋白前体(77年和生长因子,神经胶质细胞的结合,最常雪旺细胞和成纤维细胞78年,79年、弹性模量、渗透率、地形、肿胀率、降解率、大小和间隙的降解产物80年]。特别是支架的弹性模量应至少1200 kPa为了抵抗压缩和拉伸部队生成在植入后的手术以及周围组织(81年]。不同的自然和合成材料被用来促进神经再生。在自然的管状支架,自体神经移植静脉和动脉功能恢复一直是最成功的实现在10毫米神经缺陷(82年- - - - - -84年]。静脉移植在整个过程中保持不变的神经再生和动脉移植相比更容易提取82年]。而天然材料有良好的生物相容性,使用时他们经常崩溃再神经漏洞。此外,这些外植体的有限的可用性问题,以及autograft-triggered免疫反应,有一些在许多原因促使探索替代材料直接神经生长85年]。合成管状支架也有类似的优势自然支架但另外提供机械和结构控制(86年]。在最近的过去,一些指导技术开发了利用人工神经导管引导神经再生向远端树桩(87年]。孤立的环境中提供的指导渠道帮助监禁和集中由支持细胞释放神经营养因子,同时保护从免疫细胞轴突与崩溃和入侵82年]。指导渠道的使用消除了施主能级功能丧失,缺损的相关条件,通常。初步研究采用短不透水硅胶管的使用取得了可喜的神经再生在3毫米的差距(88年),随后虽然显著纤维化和神经压迫与这些管子的使用(89年- - - - - -91年]。生物可降解聚合物如聚(L-lactic酸)、聚乙醇酸(和保利(lactic-co-glycolic)酸最初材料合成的首选渠道,由于它们的相对丰度和适用性92年- - - - - -101年]。除了聚(酯),生物可降解聚(聚氨酯)102年- - - - - -104年),聚(organo-phosphazene) [16),聚(3-hydroxybutyrate) [105年- - - - - -107年显示一个引导再生的能力。然而,这些材料不能满足所有的需求,一个支架在活的有机体内应用程序应该有。举例来说,一个常见的可生物降解聚酯的不便是导致周围组织炎症导致当地的酸浓度在退化。
近年来,特别注意水凝胶。水凝胶表现出整体属性类似于软组织,可调弹性,营养渗透,生物相容性,低界面张力。在自然水凝胶,gelatin-based管状支架(108年),alginate-based毛细管水凝胶(109年),胶原蛋白和多通道神经导管(110年)被用来引导轴突生长在动物实验中。合成水凝胶包括挂钩(111年)和聚(2-hydroxyethyl methacrylate-co-methyl丙烯酸甲酯)(112年]。虽然这些材料取得了可喜的成果在神经再生方面,它们的属性如渗透率、降解性、机械强度还没有令人满意的(113年]。
AGMA1-EDA水凝胶具有一定的潜力,仿生材料和值得进一步考虑不同的生物技术应用,如基质细胞培养(62年]。不幸的是,他们的机械性能不满意的使用作为组织工程的支架,在他们的力量仍然很低,他们非常软,易碎物品处理。为了克服这个问题,一种新的合成方法导致了第二代AGMA1水凝胶具有类似成分和表现出相同的生物学性质但改善机械强度(64年]。特别是,一个不同的两步合成途径一直在跟踪报道计划4。在第一步一个丙烯酰节流线性AGMA1低聚物合成使用控制bisacrylamide过剩;在第二步中photopolymerized低聚物的紫外辐照生产AGMA1-UV水凝胶与所需的力学特性。
水凝胶管不同的尺寸(长度10 - 30毫米,外部直径3毫米,内直径0.5 - -1.2毫米)(图11);然而,老鼠注入的首选维度10毫米长度和1毫米内径(64年]。
(一)
(b)
交联PAAs,得到乙二胺为交联剂,在水中膨胀给非常柔软水凝胶(33,42,62年,65年]。肿胀测试进行AGMA1-UV水凝胶在双重蒸馏水和0.1米PBS溶液pH值7.4 200%吸收在这两种情况下,三次低于AGMA1-EDA水凝胶。
AGMA1-UV管状支架已经测试在活的有机体内作为神经再生导管在活老鼠。对大鼠的坐骨神经被切断在中间,和水凝胶管道有10毫米长度和直径1毫米内植入神经5毫米的差距(图12)。所有老鼠都活了下来,无手术相关并发症发生,因为所有的伤口愈合后自发(64年]。
神经再生的发展已经广泛地分析在不同的时间点,也就是说,30岁,90年,手术后180天(64年]。植入后30天的管道集成并没有出现混乱。再生神经是耐机械牵引没有中断的证据。无明显炎症反应或血清渗透的迹象被发现,即使一张薄纤维周围的管道。上部和下部之间的再生神经树桩发生支架内导的存在证明了神经纤维填充最初的差距。管道主要退化但不完全吸收,因为两个大型脚手架片段(h)是嵌入在神经周围的神经外膜(图(13日))。在手术后90天,一个完整的神经结构明显与一些碎屑仍包括在神经周围的纤维组织(图13 (b)),而在180天内支架严重吸收,只有一些碎石在周围神经外膜(图13 (c))。
(一)
(b)
(c)
形态学评估一直专注于手术后30天内,由于神经再生显然令人满意和不显著不同,观察植入后在90年和180年天(64年]。immunofluorescent证实了30天的轴突再生坐骨神经的纵向分析部分通过管道树桩。
神经纤维与抗神经丝标记绿色的M / H抗体和雪旺细胞细胞核染蓝了核DAPI标记。图(14日)显示绿色标签的连续性的重链轴突神经纤维细丝。更强的神经丝immunopositivity手术后90天与更高的一致,完整的轴突再生(图14 (b))。
(一)
(b)
6。结论和观点
PAAs构成家庭的高度亲水离子聚合物很容易合成,可以设计成生物相容性和可降解的体液。线性PAAs通常水溶性。可以通过以下几种方式获得的交联PAAs,形成高度肿胀的水凝胶其中一些绝对保证作为组织工程支架的应用潜力在体外和在活的有机体内高度生物相容性和生物可降解的,无毒,self-buffered产品,不引起周围组织炎症反应。
在更普遍的术语中,PAAs高度通用的功能性聚合物的生物技术应用还有待充分利用。
缩写
| PAAs: | 保利(amidoamine) |
| I.P。 | 等电点 |
| EPR: | 增强的渗透和保留效果 |
| BAC: | 2,以醋酸(acrylamido) |
| EDA: | 乙二胺 |
| RGD: | 三肽arginine-glycine-aspartic酸 |
| 水凝胶: | 保利(2-hydroxyethyl丙烯酸甲酯) |
| 挂钩: | 聚(乙二醇) |
| ECM: | 细胞外基质 |
| 安全和: | 组织培养聚苯乙烯板 |
| MDCK: | Madin-Darby犬肾细胞系 |
| FITC: | 异硫氰酸荧光素 |
| TRITC: | Tetramethylrhodamine异硫氰酸酯 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| 表皮生长因子: | 表皮生长因子 |
| PC12: | 大鼠嗜铬细胞瘤细胞系 |
| 神经生长因子: | 神经生长因子 |
| DAPI: | 4′,6-diamidino-2-phenylindole。 |
承认
这项工作已经由基金会CARIPLO项目下“为组织再生功能高分子水凝胶”(没有。2010年- 0501年),呼吁在先进材料科学研究,2010。
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