文摘

口服疗法利用转基因微生物表明承诺在许多疾病的治疗。通过微型胶囊,可行的细胞可以克服恶劣的胃肠道(GI)环境和分泌治疗进入肠道。这些基因工程细胞应该包裹没有逃离到安全隐患的消化道,因此健壮的微胶囊膜是必要的。本文研究了一种新颖的微胶囊的胃肠道表现膜使用动态模拟人类胃肠道模型。结果表明,genipin交联alginate-chitosan (GCAC)微胶囊具有强劲阻力模拟胃肠道环境结构解体。泄漏的封装高分子量右旋糖酐,模型材料保护模拟胃肠道转运期间,是微不足道的超过72 h的曝光,与相当大的泄漏的右旋糖酐non-cross-linked同行。这些微胶囊并没有改变在模拟人类结肠微生物和酶的活动媒体。本研究建议的潜力GCAC微胶囊口服交付现场微生物和其他biotherapeutics。

1。介绍

分子生物学研究进展介绍了各种转基因微生物(GE)和一个优秀的生产能力的疾病修饰底物,如细胞因子、酶、疫苗、激素、抗体、生长因子和其他治疗产品(1,2]。这些微生物的使用开辟了新的治疗各种人类疾病的希望。因为分泌生物制剂一般脆弱,容易退化或变性3),封装技术可能提供了显著的优势,超过传统的生物技术生产的方法。防止外部压力,封装细菌仍然可行的和功能。他们可以检查目标站点交付在活的有机体内,不断分泌治疗产品主机在一个更有效的浓度(4]。最近的研究微型胶囊的通用电气细胞显示了巨大的潜力治疗肾衰竭,癌症,hypercholesteraemia,和许多其他疾病5- - - - - -13]。

口服摄入通常是首选的治疗给药途径;然而,微胶囊含有细菌细胞和其他biotherapeutic分子可以在严酷的破坏胃肠道(GI)系统等一系列手段低pH值、抗菌物质和机械应力14]。此外,微胶囊的爆发和随后释放转基因细菌可以引起许多副作用对身体(2]。之前显示,口服剂量的细菌可能刺激宿主免疫反应(15,16]。传播外国对胃肠道细菌可能会导致无法控制和持续的有害物质的生产,并可能不利地破坏天然微生物区系和/或更换(2,17]。也有相关的免疫调节和基因转移的风险使用新型微生物(18]。因此,至关重要的是,通用电气细菌在微胶囊包裹,在胃肠道中转执行治疗功能,和被排泄粪便的完整的微胶囊不被保留在体内,即使这些通用电气细胞被归类为非病原的(7]。来满足这些需求,重要的是要保持微胶囊的结构完整性,从而防止在胃肠道转运细胞泄漏。目前文献报道口服输送系统主要集中在控制释放封装内容,例如,益生菌和药物(4,19- - - - - -23]。仅有的研究可以在微胶囊用于保持细胞在整个胃肠道中转。

海藻酸和壳聚糖生物材料被广泛研究了细胞封装由于其良好的生物相容性,FDA批准的食品添加剂,地位和温和的工艺条件24- - - - - -28]。据报道,有关的具有离子alginate-chitosan (AC)膜改善胃益生菌的生存,但一些限制,比如不够稳定,容易退化和细胞泄漏持续(29日- - - - - -33]。Genipin及其衍生物,从栀子果实中提取34),传统上被用作草药和天然着色剂在食品行业35]。先前的研究已经证明了其在蛋白质和低细胞毒性和潜在的活细胞交货(36- - - - - -38]。我们之前已经开发出了一种新颖的共价交联微胶囊系统组成的核心与藻酸钙genipin交联壳聚糖膜(36,39]。我们最近的数据显示,这种微胶囊膜拥有强大的膜稳定性和抗酶促降解40]。本研究的目的是进一步评估的潜在genipin交联alginate-chitosan GI (GCAC)微胶囊系统应用程序使用动态人体胃肠道模型。相比较而言,常用的交流微胶囊也测试了。

2。材料和方法

2.1。化学物质

海藻酸钠(低粘度)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记右旋糖酐( 2000 KD)由Sigma-Aldrich,美国。壳聚糖(低粘度, 程度的脱乙酰作用或DDA = 73.5%)和genipin和光BioProducts买来kouichi,美国。4-nitrophenyl - - d galactopyranoside 4-nitrophenyl - -吡喃葡萄糖苷,4-nitrophenyl - 美国- d galactopyranoside取自记述有机物。4-nitrophenol 4-nitrophenyl - -吡喃葡萄糖苷,4-nitrophenyl - 美国- d葡糖苷酸是从Sigma-Aldrich购买。所有其他试剂和溶剂使用的试剂级和收到没有进一步净化。

2.2。微胶囊的制备

交流和GCAC微胶囊是准备按之前报道协议(39]。除非另有规定,交联反应是由暂停交流微胶囊在genipin溶液在室温下(2.5毫克/毫升)(RT)。无菌微胶囊准备类似,除了整个封装过程进行了在生物密封罩和使用的所有解决方案要么是0.22 m过滤或热压处理过的,以确保不育。微胶囊含有高分子量FITC-labeled葡聚糖是由混合FITC-dextran海藻酸的解决方案,使最终的浓度的海藻酸和FITC-dextran 15毫克/毫升,2毫克/毫升,分别。后续的流程,包括海藻酸的形成珠、涂料和交联使用上述程序进行。

2.3。人类胃肠道(GI)的仿真环境

本研究中使用的人类胃肠道环境模拟在体外通过五个连续的生物反应器(图1)。每个舱模拟不同的人类消化道的一部分:胃、小肠、升结肠、横结肠、降结肠[41,44]。人类的泥浆含有正常的人类胃肠道细菌细胞接种入模拟结肠(最后三血管)。人类西方饮食悬挂食物内容,组成(每升)1 g阿拉伯半乳聚糖,2 g果胶,1克木聚糖,3 g马铃薯淀粉,葡萄糖0.4 g, 3 g酵母提取物,1 g蛋白胨,4 g粘蛋白,和0.5 g cystein喂第一船一天三次。进食后,胃的酸化(pH值 2)发生,其次是中和(pH 6.8)在第二个容器和添加模拟胰液(0.9 g胰液素,6 g胆汁盐,和12 g NaHC 每升)模拟小肠。之后,暂停被转移到模拟升结肠、横结肠、降结肠,最后排出废水。前两个反应堆fill-and-draw原则与程序的住宅和搅拌,最后三人不断搅拌(大约250 rpm)。整个系统维持在厌氧条件下通过与氮气冲洗每个容器的顶部空间每天15分钟,每个容器的温度保持不变 恒温器。pH值条件下,流体体积,保留时间在每一个阶段,以及整个交通模拟在计算机的控制下。这在体外人类胃肠道模型验证在活的有机体内早期的研究数据(41]。

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图1
计算机控制的动态在体外人类消化系统模型。(一)示意图;(b) 5-bioreactors设置;和(c)在线计算机控制。
2.4。微胶囊的抗模拟人类胃肠道中转

研究微胶囊抗模拟人类胃肠道中转,微胶囊(0.80 g)暴露在模拟人类胃肠道液体估计最大的时间内人类胃肠道中转(表1)[42]。微胶囊样本撤回在不同阶段下的形态学检查一个倒置显微镜(LOMO、PC),和故事作为记录使用数码相机(佳能劲射G2、日本)。不合格品率微胶囊三个随机选择的观测领域的估计。

表1
微胶囊的接触模拟人类胃肠道中转(总共72 h)和相应的形态学变化。

评估经济复苏后的微胶囊模拟人类胃肠道中转,已知重量的微胶囊被放置在一个密封的teabag-like容器和暴露于模拟胃肠道媒体根据表中描述的时间表1。在最后阶段,检索到的微胶囊被洗,干为大约10分钟,重使用滤纸。恢复被定义为:百分比%复苏= ( −W) / * 100, 和W之前和之后的权重是微胶囊接触模拟胃肠道中转,分别。

2.5。保留对浸出封装大分子模拟人类胃肠道液体

评估的能力GCAC微胶囊保持封闭的大型材料、高分子量FITC-dextran高分子是封装模型。这些FITC-dextran-containing微胶囊( g)暴露在2毫升的模拟人工胃液体从胃肠道模型和孵化环境振动器 100 rpm 1小时,72小时孵化2毫升的模拟人类肠道流体从胃肠道模型( 100 rpm)。孵化样本媒体撤回定期和泄漏的封装FITC-dextran评估spectrofluorometrically使用微型板块荧光读者(FLx800, Bio-Tek仪器,Inc .)吸收和发射波长485 nm和528 nm,分别。体积的孵化中通过添加新的模拟流体取样后保持不变。数据了 。一式三份的实验。

2.6。微胶囊技术在模拟肠道微生物区系的影响

探讨口服管理微胶囊对肠道微生物区系的影响,无菌微胶囊(1.0 g)涨跌互现的悬架模拟横结肠(10毫升)。后0、6、12和24小时的厌氧孵化 、样品的孵化培养基是无菌撤回,连续用生理盐水稀释。为特定的粪便细菌枚举标记微生物,大肠杆菌、金黄色葡萄sp。乳酸菌sp。总需氧菌和厌氧菌总数,使用agar-plate-count试验进行。电镀媒体和孵化条件表中列出的实验中使用2。模拟结肠悬挂没有微胶囊作为控制。

表2
媒体和孵化条件用于枚举的代表微生物模拟人类结肠。
2.7。微胶囊技术在微生物酶活性的影响模拟结肠媒体

评估口服接种的影响微胶囊技术在胃肠道微生物酶活动,模拟横结肠的悬架(20毫升)厌氧孵化 在无菌微胶囊为24小时(2.0 g)。在不同的时间点(0)、12和24小时,酶的活动 牛乳糖, 葡糖苷酶, 葡萄糖醛酸酶, 牛乳糖, 葡糖苷酶在孵化中分析了spectrometrically使用前面描述的方法(43,44]。405纳米的吸光度被一个记录 定量多平台读者(Bio-Tek仪器)。免费模拟结肠液体微胶囊作为控制。结果表示为酶活动的比例相对于控制在每一个时间点。控制样品在每个时间点的数据归一化到100%。

数值显示为平均值±标准偏差。统计分析双尾学生的使用t以及与 被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。微胶囊的抗模拟人类胃肠道中转

评估抗胃肠道环境,GCAC微胶囊被暴露于模拟胃肠道媒体代表不同阶段的消化的时间长度根据估计人类胃肠道(表中最大限度的保留1)。图2描述了微胶囊的显微照片曝光后模拟人类胃肠道液体。测试微胶囊仍然形态稳定在模拟胃孵化(2小时, )(数据2(一个),2 (d)),但在随后的行为方式与模拟肠道运输取决于交联的程度。该相变材料微胶囊的GCAC交联 增加明显的模拟小肠(pH值7.2 - -7.4)(图2 (b))。他们变得脆弱和胶粘剂在模拟降结肠枯萎或部分溶解珠子被观察到。当离开模拟降结肠,30 - 40%的微胶囊失去了结构完整性(图2 (c))。相比之下,大多数GCAC微胶囊交联温度更高(RT)保持身体稳定在整个模拟人类胃肠道中转(数字2 (e)和2 (f)),超过80%的复苏后72小时曝光(图3)。相比之下,经济复苏的GCAC微胶囊少交联(交联 )较低(61.4%)(图3)。

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图2
故事的GCAC微胶囊交联 (a) - (c)和RT (d) - (f)在模拟人类胃肠道交通模拟胃、小肠和降结肠。原来在90 x放大。

图3
复苏后的微胶囊72小时的模拟人类胃肠道中转。 显示显著差异
3.2。保留封装高分子量右旋糖酐在模拟胃肠道中转

检查的容量GCAC包住大型材料微胶囊在胃肠道环境中,封装的高分子量FITC-labeled葡聚糖被暴露在模拟人类胃肠道媒体。作为一个大型2000 KD的聚合物,这种荧光探针是无限期保留完整的微胶囊内,不能泄露出来,除非微胶囊膜变得有缺陷或损坏(45]。在第一个小时的接触模拟胃液体,没有发现FITC-dextran孵化中(数据未显示)。在随后的接触模拟肠道中,泄漏的封装FITC-dextran non-cross-linked交流微胶囊与培养时间逐渐增加,达到70年的荧光强度,在24日,100年和115年分别为48和72小时。相比之下,只有微不足道的FITC-dextran逃出了GCAC微胶囊,中检测到的荧光强度非常低(不超过50)在整个实验(图4),这大大超过那些AC微胶囊。


图4
浸出的封装FITC-dextran模拟肠道中1小时后模拟胃曝光。误差线表示均值的标准差( )。
3.3。的微胶囊口服肠道微生物区系和酶的活动

微胶囊的影响对人类胃肠道微生物区系进行调查的人口粪便微生物标记和5代表胃肠道微生物酶的活动包含无菌微胶囊在模拟结肠媒体。由于模拟胃肠道模型是一个动态的系统,进行了静态实验研究中最大化的影响。我们没有发现显著差异测试微生物种群包括总需氧菌、厌氧菌,大肠杆菌、葡萄球菌sp。和乳酸菌sp。刺激结肠媒体包含测试微胶囊的交流或GCAC配方相比,控制媒体没有测试微胶囊(表3,所有 )。

表3
影响微胶囊在模拟横结肠粪便微生物标记。

图5显示了微胶囊的影响在微生物酶的活动模拟横结肠悬挂。随着时间的流逝,一个轻微的下降测试酶活动被发现在模拟结肠液体在微胶囊的存在。作为一个例外,减少20%以上的活动 葡萄糖醛酸酶检测经过12个小时的接触微胶囊,但损失仍在相似的水平,延长潜伏期长达24小时(图5 (c))。没有显著的差异酶活动的变更被发现当GCAC微胶囊比较与交流微胶囊( )。

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图5
微生物酶活性百分比保留在模拟人类的悬挂横结肠的微胶囊相对于没有微胶囊(控制)。值控制在每一个时间点归一化到100%,是用来计算酶活性百分比保留microcapsule-containing媒体在相应的时间点。(一) 牛乳糖;(b) 葡糖苷酶;(c) 葡萄糖醛酸酶;(d) 牛乳糖;和(e) 葡糖苷酶。

4所示。讨论

成功开发的微胶囊口服交付设备,了解他们的表现在生理上相关的条件下,代表人类的消化道是至关重要的。虽然在活的有机体内研究使用特定技术,如组织学切片46),放射学(47)和γ探讨[48,49]可以逐步跟踪的微胶囊消化道,仍然很难遵循口头管理微胶囊在消化动物或人类的每个阶段由于繁琐的加工、微胶囊的体积小,有限的检测分辨率和道德约束。在体外模拟提供了许多优势,例如,控制实验条件和简单抽样,特别是更可取的筛查和检查各种样品。缓冲的解决方案,例如,pH值在1 - 2或6.5 - -7.5,在文学的模拟胃肠道液体(31日,50,51];然而他们只代表了pH值在胃和小肠,和无法模拟出复杂的人类胃肠道微生物生态系统。而其他的体外和在体外模拟模型包括USP装置也被报道(52),其中大部分是静态系统,液体不能不断转移到顺序GI隔间。我们目前研究使用动态的计算机控制的人工模拟胃肠道模型,模仿逐渐吸收材料的运输通过模拟胃肠道喂养放电。它还保持在人类肠道微生物群落实际上提出了系统,它允许评估的行为更多的生理相关条件下微胶囊。

正如前面提到的,当务之急是微胶囊维护物理完整性在胃肠道中转防止转基因细胞的泄漏,这是强烈依赖于微胶囊的鲁棒性和稳定性。据报道,到目前为止,很少有研究解决这个问题(44]。本研究调查的行为GCAC微胶囊在模拟人类胃肠道环境。当暴露于模拟胃肠道媒体、微胶囊经历了模拟交通通过消化道包括pH值波动,酶促降解,微生物操作,机械应力,以及其他相关的化学和生理约束。根据最大曝光时间选择时期保留在人类胃肠道代表最具挑战性的情况下对微胶囊进行测试。保存较为完好的形态学和更高的检索率与GCAC微胶囊在RT(数据交联2和3)表示提高膜稳定性更高程度的交联。此外,可以忽略不计的封装荧光探针被释放到孵化GI媒体从GCAC微胶囊(图4),这表明微胶囊膜的完整性被扣留。相比之下,non-cross-linked交流微胶囊被发现容易受到严酷的胃肠道结构破坏的条件,可能由于相对较弱的聚电解质络合膜材料,容易胃和蛋白水解降解。这些发现证实了此前报告的结果(44,53- - - - - -55]。目前的研究表明,微胶囊膜的共价交联genipin大大提高了抗膜降解模拟人类胃肠道环境。

利用微型胶囊口服治疗的另一个重要的先决条件是,微胶囊的管理不应该干扰自然结肠菌群,尤其是当长期反复口服摄入需要相当大量的微胶囊治疗。微胶囊是由各种材料和化学物质通过络合和交联反应,这些都可能影响最终的微胶囊的生物相容性。特别是,平衡肠道微生物群是重要的在维护人类健康(56,57)和微胶囊的摄入量不应改变。当考虑静态特性和一个相当大的剂量(1.0 g的微胶囊在10毫升的肠道流体)的实验在体外研究中,我们的研究结果表明,材料用于构造微胶囊不引起明显的不良反应在人类肠道菌群和genipin交联壳聚糖膜的生物相容性不妥协微胶囊相比non-cross-linked科目。减少测试微生物酶的活动包含发现微胶囊在模拟结肠媒体。它可能归因于约束力或扩散的酶微胶囊,但进一步的研究可能会继续说明结果。

5。结论

这项研究检查了genipin性能的交联alginate-chitosan生理相关的胃肠道条件下微胶囊使用动态模拟人类胃肠道模型。结果表明,这些GCAC微胶囊具有优越的抗分解模拟胃肠道环境中,没有明显改变正常的肠道菌群。这部小说微胶囊配方是口头的承诺转基因细菌;然而,进一步的研究需要在肠道内腔封装细胞生存能力之前可以实现其全部潜力。

确认

本文得到了加拿大卫生研究院的研究(CIHR)拖把64308。研究生奖学金从加拿大自然科学和工程研究理事会(h . Chen和c马东尼)和全宗魁北克人de la矫揉造作的苏尔la自然等莱斯技术(h . Chen和w·欧阳)极大地承认。作者还要感谢m·l·琼斯对他的帮助与胃肠道模型设置,t . Haque m . Shafiei和h Wightman援助的实验。