光动力治疗的小鼠肺的细胞外基质:另一种组织灭菌过程的初步结果

文摘

肺移植的器官移植中最为困难的和微妙的过程。成功的过程和生存的新器官,非细胞肺的灭菌步骤之前recellularization是重要的,以确保它们是免费的任何传播感染的风险接受者的捐赠者。然而,没有任何信息关于杀菌光动力治疗后肺力学参数。本研究的目的是评估细胞外基质(ECM)脱细胞的肺和肺力学参数进行灭菌光动力疗法(PDT)。此外,我们还分析了后肺部感染控制白念珠菌为了评估PDT的有效性。肺力学评价参数,电阻( )和倒电容( ),表现出组之间没有显著差异。此外,没有PDT-induced肺的变化特性,与维护的粘弹性行为肺后支架1 h PDT。ECM组件保持几乎不变的非细胞肺两组。我们还表明,减少真菌感染人口PDT 45分钟后。然而,应该进行更多的研究以建立和验证的有效性PDT作为消毒可能意味着肺支架。这个手稿的硕士论文提出了Nadua Apostolico在康复科学的研究生项目,大学诺德Julho-UNINOVE。

1。介绍

据世界卫生组织(世卫组织)、器官移植通常是唯一的治疗最终器官衰竭,如肝、肺和心脏衰竭。然而,作为一种生物材料,所有植入或移植材料从人类起源提出了严重的几种疾病传播的风险。除了生物风险,器官/组织捐赠者的极低的可用性是最重要的限制等世界各地的过程。在此场景中,组织工程已成为另一种功能,旨在发展组织替代品的目的,改善晚期患者的健康和生活质量。

组织工程的具体目标是促进再生组织/器官的结构和功能受到疾病或手术。肺癌生物工程领域的研究尤为活跃,近年来由于缺乏可行的指定肺移植和减少移植后长期生存患者(1,2]。

的重要一步处理非细胞肺之前受到recellularization杀菌抑制任何风险传播病毒或细菌的捐赠者的接收机移植组织/器官。事实上,潜在的感染传播,如艾滋病毒和丙型肝炎,据报道在组织工程应用3- - - - - -5]。因此,不同的消毒方法的效果在各种组织类型的研究,以确定最优程序。为此,必须考虑到积极的灭菌方法,确保完全消除病原体也可能恶化的结构组件组织,特别是其力学性能(6,7]。

并不是所有的灭菌方法用于适用于bioscaffolds健康产业。起初,灭菌方法,如基于γ辐照,环氧乙烷,或其他化学药剂,可以使用。然而,所有灭菌过程有其副作用,因为任何行动摧毁传染性微生物同时会影响分子的不同结构支架。

据报道,环氧乙烷和辐照可以与分子和支架,并可能降低其功能。它最近被建议过乙酸(PAA)可以是一个有用的化学药剂消毒为组织工程支架(8]。然而,这并不是完全有效的消毒肺动脉支架(9]。

因此,适当的消毒程序,保存后的肺去细胞的力学性能安全的重新至关重要。特别是,光动力疗法(PDT)可能是一个工具来获得必要的可行的肺的重新过程(10,11]。

PDT发现于1900年的奥斯卡和赫尔曼·冯·拉布Tappeiner [12),他发现草履虫种虫害原生动物被杀后吖啶橙染色和随后的暴露在明亮的光(13]。在1970年代,PDT最初开发用于癌症治疗后发现,卟啉选择性地在肿瘤局部(14]。此后,PDT一直是临床上用于治疗各种恶性肿瘤和毁灭的批准治疗年龄相关性黄斑变性脉络膜新生血管(CNV)。最近,抗菌PDT已被建议作为一个替代方法治疗局部感染(12- - - - - -16]。

一种光敏剂在PDT的功效起着关键作用。原卟啉IX (PpIX)是积极运入细胞通过一种吸收机制诱导生长在营养限制条件。例如,在白念珠菌,表面性质和组成复杂、动态和疏水性的许多潜在的因素可能会影响吸收。先前的研究表明,丝状的形式和生物膜白色念珠菌是敏感PDT使用卟啉作为光敏剂(17- - - - - -19]。

理解机械肺脚手架绝育的后果是特别相关,因为肺器官结构和机械复杂性高,是生理上受到连续变形循环在呼吸。因此,器官支架的机械性能应保存尽可能多的后杀菌,以确保最佳的器官再生。然而,研究关于PDT的杀菌功效的肺支架和缺乏对力学性能的影响。因此,本研究的目的是评价脱细胞的细胞外基质和肺力学参数肺进行PDT和杀菌的目的进行概念证明肺感染的微生物分析白色念珠菌确定PDT的有效性。

2。材料和方法

2.1。实验动物

雄性C57BL / 6小鼠(7 - 8周大)标准住房条件下保存在通风的房间里(12 h明暗周期,温度23°C,湿度和60 - 70%),提供食物和水随意。实验过程进行伦理委员会提交和批准后的动物研究巴塞罗那大学和大学研究伦理委员会的诺德Julho (UNINOVE)协议(0038/2011)。

2.2。实验设置

本研究分为两个阶段:阶段1-decellularized小鼠肺机械评估和细胞外基质的形态是评估之前和之后PDT和相位2-decellularized小鼠肺部污染的实验白念珠菌(写明ATCC 90028)提交给PDT;微生物分析评估PDT的功效白念珠菌去污(图1)。

动物的体重,和1.0克/公斤聚氨酯腹腔麻醉,牺牲放血。立即通过肺动脉灌注肺与磷酸盐(PBS)包含50个U /毫升肝素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和1μg / mL硝普酸钠(SNP)(丙烯酰胺分析,圣路易斯,密苏里州,美国),以防止血液凝块的形成。然后,肺部和心脏被移除气管和食管。整个街区是储存在−80°C,直到去细胞协议执行。

2.3。肺去细胞

天的实验中,组织被解冻脱细胞如前所述[20.]。短暂的,一旦气管和肺动脉插管(图2(一个)),放入实验系统,以下序列灌注试剂是:PBS为30分钟,去离子水(DI) 15分钟,30分钟,特里同0.1% DI 5分钟,1%十二烷基硫酸钠(SDS) 150分钟,最后洗PBS的30分钟,导致一个半透明的非细胞肺癌(图2 (b))。

2.4。添加光敏剂和灭菌红色LED(660海里)

第一组实验是在一个测试来证明PDT能够平息控制感染白念珠菌。12的脱细胞小鼠肺的六个动物随机分为两组:一组注射原卟啉IX(集团PpIX或GPpIX)和对照组注射PBS(控制)。第二阶段,总共8脱细胞的小鼠肺被随机分为四组,每个都包含两种动物:对照组感染小鼠(CG),一组接受PpIX(集团光敏剂或GPS),一组用PDT治疗15分钟(PDT组15分钟或GPDT15),和一群PDT治疗45分钟(PDT组45分钟或GPDT45)。去细胞后,GPpIX、GPS、GPDT15 GPDT45小鼠气管注射1毫升PpIX (10μM;Sigma-Aldrich),而对照组都注射1毫升PBS。每个阶段一脱细胞肺辐照一个小时使用发光二极管(LED)波长为660 nm,由1400毫安的电流源控制在7.5 V(图3)。第二阶段,脱细胞肺辐照15分钟在GPDT45 GPDT15 45分钟。辐照是显示在表的参数1。

2.5。评价肺力学

来评估非细胞肺阻力和倒电容,使用了一个定制的系统。气管插管,肺是垂直连接到系统。流信号被记录为压降在pneumotachograph压差传感器(DCXL01DS,射程而言不啻±2.5₂O)和气管压力( )使用压力传感器测量(176 pc14hd2±35而言不啻₂O) pneumotachograph和套管之间的侧孔。非细胞的肺受到传统与quasi-sinusoidal流压力控制通气模式在80次/分钟的频率。一个积极的呼气压力(偷看)2他而言不啻结束₂O应用通过通风机抵消缺乏生理-胸腔的压力。流量和压力信号记录与虚拟仪器(©2011美国国家仪器公司,奥斯汀,德克萨斯州,美国),用MATLAB postanalyzed (©1994 - 2015 MathWorks Inc .,纳蒂克,麻萨诸塞州,美国)。有效的肺阻力( )和倒电容( )通过线性回归计算的记录信号(气管压力),(体积),(流),使用传统的呼吸系统力学模型 ,在哪里是一个参数来考虑外部偷看呼吸机的应用。对于每一个脱细胞肺,和从数据包括五个通风计算周期(21]。

2.6。Immunofluorescent显微镜

传统荧光显微镜分析、脱细胞肺固定的最佳切削温度复合(10月)(美国樱花Finetek托兰斯,CA)和PBS 3: 1比和冻结在−80°C。Ten-micrometer肺样本获得的部分使用一个嗯560 CryoStar低温恒温器(美国马热科学、沃尔瑟姆)。然后,部分与PBS冲洗去除10月固定用4%多聚甲醛在室温下30分钟,10分钟孵化和4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。评估后细胞外基质蛋白质PDT, cryosections如前所述,孵化阻止溶液清洗(1%的牛血清白蛋白,6%胎牛血清,和0.5% triton Tris-buffered解决方案)30分钟,用PBS,一夜之间,孵化具有以下主要抗体:anti-collagen-I (Abcam,剑桥,英国),anti-laminin (Sigma-Aldrich) anti-collagen-IV(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),和anti-elastin(圣克鲁斯生物技术)。主要的抗体被发现使用适当的二次抗体。图像被使用一个Eclipse Ti荧光显微镜(尼康,东京,日本)。

2.7。扫描电子显微镜(SEM)

脱细胞肺后由SEM分析了PDT在两组。组织样本和2%戊二醛和2.5%多聚甲醛固定在0.1米甲次砷酸盐缓冲在室温下2小时。然后,样本在甲次砷酸盐缓冲液冲洗,切片,乙醇梯度脱水。样本中脱水hexamethyldisilazane 10分钟,一夜之间干,涂上一层14.4 nm的黄金使用溅射涂布机(SC510;Fisons仪器,圣卡洛斯、钙、美国),并分析了使用DSM 940显微镜(蔡司、从德国)的加速度15千伏。

2.8。白色念珠菌生长条件和培养液准备

白色念珠菌(写明ATCC 90028)是培养在Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA) 37°C 24 h。细胞被收获,悬浮在PBS和均质涡瓶。浓度估计的浊度悬挂在15%透光率(22]。培养液的浓度是证实了文化在SDA和CFU /毫升数,根据杰特提出的方法论等。23]。

2.9。微生物评价

微生物分析,我们进行了矢状切成左肺。切片后,一半的左肺受到手工浸渍。浸渍后,连续进行了稀释和镀SDA和盘子被孵化24小时37°C。24小时后,计数克隆形成单位镀内容(CFU / g)。

2.10。统计分析

所有率表示为 (SD)。验证组织的常态,我们使用了Shapiro-Wilk测试。单向方差分析被用来测试组之间的差异。该集团与图基测试和列文测试手段进行了分析对比的差异。对比得到的值和以每组进行预处理和辐照后使用成对的学生的 - - - - - -测试。的价值被认为是在5%的显著水平。对于这些分析,我们使用社会科学统计软件包(SPSS)版本21.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

肺力学进行评估在所有12分为两组小鼠的肺:控制( )注射1毫升PBS和GPpIX ( )注射1毫升PpIX在肺部,辐照与领导的660海里。通风卷和人是描述在表2。

有控制和GPpIX组之间没有显著差异,也代表了一个通风的评估。肺力学评价参数,和 ,展出两PDT间隔(图之间无显著差异4)。也没有改变观察到随着时间的辐照,代表的粘弹性行为的维护肺支架1 h后LED灯。

图5表明,细胞外基质部分负责维护的3 d肺结构、弹性蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白我和IV,仍然几乎不变的非细胞肺控制和GPpIX组LED的应用。SEM分析,观察到在图6表明,微观肺结构一直保持在两组(控制图6(一)和PpIX,图6 (b)),应用光动力治疗后。此外,肺动脉支架经辐照后去细胞过程导致相比非细胞的肺受到光动力治疗显示没有细胞核评估DAPI染色。

本研究的第二阶段,八个老鼠肺部脱细胞,分为四组:CG ( ),全球定位系统( ),GPDT15 ( ),和GPDT45 ( )。在CG,没有任何形式的干预。group-denominated GPS,没有领导的应用,只是添加PpIX光敏剂。我们观察到,PDT协议促进减少真菌人口约1.60(CFU / g) ( 和 分别为GPDT15和GPDT45)相比,GPS ( ; )。当比较CG ( )与全球定位系统( ),没有明显减少微生物计数观察(图7)。

4所示。讨论

组织工程是一个快速发展的领域,旨在发展功能性组织替代品的目的,改善患者的生活质量,促进真正的再生组织的结构和功能受到疾病或手术。因此,它是特别重要的,选择一个适当的消毒方法,以确保安全和维持肺灭菌后支架的机械性能的有效再生器官。灭菌生物工程需要的器官,因为污染的风险在整个过程的创建和由于存在潜在的传染性生物体的供体组织。微生物群有机体认为良性健康的个人可以成为致病时支架在重新提交一个生物反应器过程。

在过去的几年中,研究人员探索替代的灭菌方法由于限制传统的用于组织工程(8,9,24]。Siritientong等人分析了聚乙烯醇的灭菌对支架的影响冻干丝胶和得出结论,γ辐照降解24小时后的支架近70%,但这是最合适的灭菌方法(25]。Rainer等人说,干热和高压釜治疗导致结晶度的增加,而紫外线和过氧化氢等离子低温保存的结构属性(26]。希勒等人证实PAA和抗生素解决方案有效地杀菌中空纤维和持平的聚(丙交酯乙交酯):但获得不利的形态学变化27]。这些研究中的局限性,前面所提到的,包括缺乏统一的生物模型的测试;许多没有指定源或污染的细菌或其他微生物的身份,很难比较灭菌方法对组织工程支架。初步研究表明,杀菌的支架在组织工程是维护材料和结构的特性,如关于杀死微生物25- - - - - -27]。灭菌假定包含蛋白质或生物材料支架的主要意义,变性的风险是真实的,可以导致重要生物活性的减少或损失(8]。

芬生、拉布和冯Tappeiner证明光的组合和管理导致光化学疗法的药物成为治疗工具和隔离的卟啉和发现光毒性的影响癌细胞的发展导致PDT [12,28]。ECM是重要的组织在多细胞生物组织,是一个复杂的大分子网络分泌的细胞,细胞间驻留作为一个障碍和组织构建的支架。研究已经证明,PDT改变了细胞外基质(29日]。Pazos等人证明了ECM组件的影响,即使它们不是主要目标(30.]。然而,我们也应该记住,PDT在特定的分子途径的作用取决于所使用的影响率和光敏剂。

据报道,环氧乙烷和辐照可以与分子和支架,并可能降低其功能。它最近被建议过乙酸可以是一个有用的化学消毒代理的组织工程支架(8,31日]。相比之下,在我们的研究中,我们表明,没有明显的弹性蛋白的相关的细胞外基质成分的变化,层粘连蛋白,胶原蛋白我和IV。这些组件仍基本保持不变,后两组的非细胞肺导致应用程序。

显然涉及高温灭菌方法必须被丢弃的变性蛋白质和其他生物分子在这些条件下。在伽马辐射的影响,研究肺动脉瓣支架应用的剂量批准kGy的表现出极大的减少细胞外基质的胶原蛋白含量碎片,照射后引起的氧化损伤。这导致相当大的生物力学改变组织的完整性,造成结构性破坏胶原纤维的力学行为和重大变化(32]。此外,Uriarte等人表明,辐照与一个典型的非细胞肺⁶⁰公司伽马消毒剂量对健康应用程序导致的机械阻力显著增加肺(33]。

值得注意的是,在目前的研究中,我们观察到肺倒电容的值没有变化( )和肺阻力( )辐照后过了60分钟的光敏剂。这是γ辐照与先前的报道,导致退化和肽链的碎片,也损害胶原纤维,导致肺力学性能变化(34]。

PDT已被成功地用于治疗不同的局部感染(35,36),我们的结果是一个概念证明,PDT也一个合适的方法来促进减少白念珠菌。我们的研究提供了证据表明光敏剂PpIX不表现出任何抗真菌活性当单独使用没有领导的应用。它也描述了文献中,仅使用激光,没有添加光敏剂,同样不能减少真菌种群。我们发现有一个减少真菌45分钟后人口PDT相比只有15分钟的PDT。据推测从PDT的行为,白念珠菌分解时的一部分细胞分离,形成另一个细胞,这可能是与酵母菌开拓殖民地混淆。Teichert等人证明了总真菌负载减少依赖光敏剂的浓度和光参数,使用红色和亚甲蓝激光在口腔黏膜的小鼠模型(37]。

5。结论

总的来说,这是第一个研究评估肺支架的力学行为受到了辐照光敏剂,消毒的肺的目的。我们发现,辐照剂量,可以有效减少感染不要修改脱细胞肺的结构和力学性能。本研究打开了一扇大门,进一步的研究来证实PDT的工具是否适合经常消毒过程中肺肺生物制造。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者,在合理的请求。

附加分

高光。下面突出显示:肺动脉支架的力学性能的行为提交给光动力疗法,应用光动力治疗肺动脉支架的灭菌,并使用LED灭菌过程中再生医学的肺。

信息披露

这个手稿的硕士论文提出了Nadua Apostolico在康复科学的研究生项目,大学诺德Julho-UNINOVE。

的利益冲突

作者声明没有财务或其他方面的利益冲突。手稿介绍的结果研究的硕士论文作者Nadua Apostolico辩护在康复科学硕士学位大学诺德Julho (UNINOVE),巴西圣保罗(SP), (38]。这项研究的结果都是原版的,而没有以前公布的手稿。

作者的贡献

LVFO、射频和DN:概念化的研究,项目管理和监督;NA、JJU RKP RABLM,探测器,说唱,AMD,探测器,以下:调查,方法,数据收集和正式的分析;以下,MCOJ RABLM、RPK LVFO,射频,JPRA解释数据;RKP RABLM。JJU, LVFO NA:写的原始版本的手稿;射频,DN, JJU LVFO:回顾了手稿的最终版本;所有作者阅读和同意的最终版本的手稿。

确认

我们要感谢提供的技术支持Unitat德生物物理学我Bioenginyeria Facultat药物,巴塞罗那大学(乌兰巴托),西班牙巴塞罗那。我们想表达一个特别感谢教授保罗博士文中de Tarso卡米洛•德•卡瓦略为他的友谊,机会,学习,参与这项研究。这是保罗的悼念文中de Tarso卡米洛•卡瓦略·医学博士,1962 - 2020。这部分工作是支持西班牙经济和竞争力(saf2011 - 22576)。Luis韦森特弗朗哥de Oliveira收到拨款CNPq研究生产力modality-PQID 313053/2014-6协议号码。Nadua Apostolico收到国家的支持”Fundacao德帕罗尽管做Estado de Sao Paulo,“协议2013/21765-5数量,,还覆盖着一个“Bolsa de Estagio德尽管没有外部(BEPE / FAPESP)必须占州政府协议2015/01649-6数量。”该论文的合著者Nadua Apostolico,路易斯•鲁道夫费雷拉和Manoel Carneiro de Oliveira初级收到支持改善高等教育的协调人员(本地缩写斗篷)。

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