的效果与405 nm蓝紫色相比激光辐照Osteosynthetic生物材料细菌黏附

文摘

延迟术后感染被称为骨手术后并发症主要使用osteosynthetic生物材料如钛(Ti)和bioresorbable有机材料。然而,这种类型的感染的具体原因还不清楚,没有建立有效的预防。本研究的目的是调查的效果与405 nm蓝紫色相比激光辐照细菌粘附在基于Ti和hydroxyapatite-poly-L-lactic酸- (HA-PLLA)材料表面和验证其临床应用的可能性,防止使用osteosynthetic生物材料延迟骨手术后感染。暂停金黄色葡萄球菌FDA 209 p是在磁盘表面的钛或HA-PLLA组成。细菌附着在每个磁盘使用扫描电子显微镜(SEM)观察。与蒸馏水彻底清洗后,细菌附着在材料表面的生长是检查与alamar blue-based氧化还原指示剂。此外,405海里的杀菌作用蓝紫色相比激光辐照残留细菌对材料使用克隆形成试验研究。因此,之间没有显著差异的细菌粘附Ti和HA-PLLA材料。相比之下,45 J /厘米²与405 nm蓝紫色相比激光辐照抑制细菌增长大约93%在Ti磁盘和HA-PLLA磁盘上大约99%。这项研究清楚地展示了这样一种可能性,即与405 nm蓝紫色相比激光辐照是有用的是一种另类的管理策略来预防使用osteosynthetic生物材料延迟骨手术后感染。

1。介绍

几种类型的生物材料包括钛(Ti)和bioresorbable poly-L-lactic酸(丙交脂)等材料用于骨缝术在骨科领域和craniomaxillofacial手术(1,2]。钛是一种传统的材料和最常用的骨缝术因其高生物相容性和优越的物理性能(3,4]。相比之下,丙交脂是代表bioresorbable材料之一,水解的环境中的水分,导致降低材料的分子量,然后最终分解成二氧化碳和水。这个属性,丙交脂被用作源试剂bioresorbable osteosynthetic材料自1990年代(5,6]。2006年,新的骨缝术是生物材料,是由incalescent /未烧结的羟磷灰石(u-HA)粒子和丙交脂,并常用由于(1)最好osteoconductivity [7- - - - - -10),(2)不需要二次手术切除的材料(11,12),(3)没有限制在年轻患者骨骼生长13- - - - - -15),(4)没有金属离子的洗脱,可以作为过敏原(16- - - - - -19]。

延迟术后感染,主要和骨手术后严重的并发症之一,使用osteosynthetic材料,通常遵循一个旷日持久的过程作为一个持续的并发症(20.- - - - - -23),导致最终切除材料随后骨组织再生/伤口愈合[的失败22,24- - - - - -26]。尤其是bioresorbable材料,切除手术术后感染完全否定的有益属性材料。因此,它是非常重要的,以防止使用osteosynthetic材料延迟骨手术后感染。然而,这种类型的感染的具体原因还不清楚,有效预防尚未建立。

尽管各种各样的细菌是引起术后感染,金黄色葡萄球菌是最负责任的一个在手术部位感染。此外,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是一种冒犯致命感染的微生物由于其耐药特点β内酰胺抗生素。对抗生素的替代疗法,蓝光的杀菌效果金黄色葡萄球菌,已在先前的研究中得到了验证。古费和Wilborn报道,与405 nm蓝紫色相比激光辐照杀菌的效果金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(27]。其他的研究也报道,可见光是有效的Porphyromonas gingivalis,梭菌属nucleatum,金黄色葡萄球菌,变形链球菌,大肠杆菌(28,29日]。我们之前的研究结果也证实了与405 nm蓝紫色相比激光辐照杀菌的效果p . gingivalis这是一个主要periodontopathogenic微生物以及普氏菌媒介物,甚至对白色念珠菌这是一个主要负责真菌导致念珠菌病(30.]。这些结果证明的可能性与405 nm蓝紫色相比激光辐照能够消除各种微生物坚持osteosynthetic的表面材料和有效防止延迟术后感染。

因此,在目前的研究中,我们试图探索的可能性与405 nm蓝紫色相比激光辐照杀菌的影响金黄色葡萄球菌坚持Ti和HA-containing丙交脂(HA-PLLA)的表面材料和辐照可以有效和有用的预防术后感染的骨外科手术后使用osteosynthetic材料。

2。材料和方法

2.1。准备样品

Ti样本磁盘(直径10毫米,厚约2毫米;Daido Bunseki研究公司,日本名古屋)的商用纯钛(ISO 5832/2, 4年级)。磁盘是barrel-polished和阳极氧化膜的表面酸处理后去除氧化层的稀硝酸和氢氟酸的混合物,也就是加工过程用于临床实践。磁盘然后在乙醇超声脱脂,然后去离子水(DW) 10分钟。HA-PLLA样本磁盘(10毫米直径,厚度2毫米)这是由丙交脂和微粒bioresorbable u-HA(超级Fixsorb®)由Takiron有限公司,日本大阪。

地表地形(即。,contact angle and surface roughness) of the two materials were examined. Contact angles were measured by the sessile drop method using a measurement device (Kyowa Interface Science Co. Ltd. DM-300). Surface roughness average (Ra) was measured using the SURFCOM 550A surface roughness tester (Tokyo Seimitsu Co., Ltd.) with a 2 μ米半径在每个磁盘上三个不同的点。此外,磁盘的漫射透光率是衡量在正常发病率(0°)和磁盘的反射率测量的入射角8°200 ~ 2500 nm地区使用uv - 3100 pc(日本岛津公司公司,日本京都)。每个观察材料的表面纹理的磁盘使用扫描电子显微镜(SEM);房子5600 lv, JEOL有限公司、日本东京)的加速电压10 - 15千伏。

2.2。用扫描电镜观察细菌粘附

金黄色葡萄球菌FDA 209 p precultured耗氧在3毫升的脑心浸液(BHI)中(和公司正欲,火花,医学博士,美国)补充0.5%的酵母提取物,0.05%半胱氨酸,0.025%刃天青一夜之间在37°C。此后,100年μL文化解决方案是接种10毫升的BHI从有氧锻炼和培养5 h和搅拌在37°C。

每个磁盘的消毒和置于一个48-well微量滴定板。然后,100年μ1×10 L细菌悬液的调整⁴菌落(CFU) /毫升,1毫升的BHI介质被添加到每个从有氧锻炼,培养在37°C 3, 6日24或48小时。三个磁盘准备每个条件的材料。磁盘与DW删除不依从细菌冲洗两次,进一步洗涡与DW 30年代将材料表面细菌粘附差,和固定在2.5%戊二醛磷酸盐12 h在4°C。磁盘使用一系列的脱水乙醇分级浓度(50%,60%,70%,80%,90%,和绝对酒精),冷冻干燥使用id 2冷冻干燥机(日本东京英子工程株式会社有限公司),并涂以黄金使用sc - 701快速自动涂布机(常玉原籍Denshi,东京,日本)。四个方面是任意选择和加速电压的扫描电镜观察10 - 15千伏。

2.3。观察残留细菌的生长与氧化还原指示剂和SEM

监控剩余材料表面细菌的增长,修改后的氧化还原指示剂测定(alamarBlue®;Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。氧化还原指示剂是nonfluorescent蓝色色素氧化还原转化为红色颜料时减少细菌的增殖。这个红色颜料的吸光度测量使用multidetection读者(LabSystems Multiskan®;MultiSoft,芬兰赫尔辛基)的波长570 nm。

孵化后细菌的解决方案3 h 37°C, Ti的磁盘和HA-PLLA材料与DW冲洗两次删除不依从细菌和进一步洗涡与DW 30年代将材料表面细菌粘附不佳。除了这个,一些磁盘,只有冲洗两次与DW 30年代是准备作为对照组。此后,每个材料的磁盘被转移到5毫升的BHI中包含500μL(氧化还原指示剂(样品体积的10%)和孵化为120分钟37°C。吸光度测量使用一个自动化multidetection读者波长570纳米。检查残留细菌的增长,其他磁盘的每个材料培养了一个额外的24小时的加速电压和SEM观察10 - 15千伏。

2.4。与405 nm蓝紫色相比激光辐照对细菌粘附在材料表面

一百年μ在1×10 L的细菌悬浮液⁴CFU /毫升,1毫升的BHI介质被接种到Ti和HA-PLLA磁盘的表面在24-well文化板块3小时37°C。孵化后,每个磁盘DW清洗和表面多余的水分被吸收。此后,磁盘与405 nm的蓝紫色相比激光辐照室内相对湿度100%,水分在恒定输出功率0.2 W (176 mW /厘米²)不同辐照时间0(控制),180年代(27 J /厘米²),和300年代(45 J /厘米²)使用laser-emitting设备配备20纤维捆绑加上波长405纳米的激光二极管(Ushio Inc .,东京,日本)。405纳米的单波长激光的发射设备验证和确认使用分光光度计(USB2000微型光纤光谱仪和OceanView光谱软件,海洋光学公司,FL,美国)(数据没有显示)。激光输出是维持在一个稳定的功率,测量每次照射前的激光功率计和传感器(猎户座/ TH P / N 1 z01801: 188784年,3 a-p-sh-v1 P / N 1 z02622: 187487;俄斐达光电解决方案有限公司,耶路撒冷,以色列)。辐照后,样本踩胰蛋白酶的大豆琼脂板上。孵化后12小时37°C,盘子上的细菌菌落的数量统计。

消除可能的热影响材料表面由于辐射的吸收,在辐照表面温度的变化与热电偶测量和监控设备(TCS620 NTC热敏电阻;美国太波长电子公司,勃兹曼)。

2.5。统计分析

多集团比较,数据分析单向方差分析。个体差异的重要性是使用Mann-Whitney评估测试。一个概率值( )< 0.05的被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。材料的表面形态特征

形态特征的差异被发现在Ti和HA-PLLA之间。Ti和HA-PLLA的Ra值分别为0.30±0.05,0.45±0.005,和每个材料的接触角分别为67.4±5.28,88.8±1.04,分别(表1)。各材料的透射率和反射率的波长405 nm展示在表2。SEM图像也显示出明显的两种材料表面拓扑结构之间的差异。钛的表面相对光滑,微孔隙被发现在一些地方,而HA-PLLA相对粗糙,点缀白色颗粒似乎HA晶体(图1)。

3.2。细菌粘附

虽然有不同的形态特征/表面拓扑Ti和HA-PLLA之间没有差异,在两种材料之间的细菌粘附。在细菌悬液接种后3小时,只有少数细菌被发现坚持材料(表面数据2(一)和2(b))。孵化24小时后,小殖民地或一些细菌的细菌组成的团被观察到在某些地方的表面材料(数据2(c)和2(d))。孵化后48小时内,更大量的细菌和更大的殖民地上形成的整个表面材料(数据2(e)和2(f))。

3.3。洗后残留的细菌生长

残留细菌的生长表面的每个材料研究氧化还原指示剂,alamarBlue®试剂。细菌生长没有明显的差异指出直到30年代洗2 - 3小时后用DW涡组和对照组之间在这两种材料。相比之下,在4 - 5小时后洗30年代DW,更多的观察细菌生长HA-PLLA相比之下,Ti在两组(图3)。SEM观察显示,细菌生长和集落形成涡在24小时后洗两材料(数据4(一)和4 (d))。这些结果表明,一些细菌表面保持材料即使在彻底清洗,都是随着时间增长的能力。

3.4。与405 nm蓝紫色相比激光辐照的影响细菌坚持材料表面

与405 nm蓝紫色相比激光辐照的影响细菌坚持这两个材料的表面进行了分析通过计算数量的殖民地上形成大豆胰蛋白酶的琼脂板上。明显的区别的可行的细菌观察对照组(没有辐照)之间的材料(数据5(一个)和5 (b))。Ti组辐照对180年代(图5 (c))抑制约76%的集落形成,同时为300年代(图辐照5 (e))抑制约93%。HA-PLLA组辐照对180年代(图5 (d)300年代)和(图5 (f))抑制集落形成约90%和99%,分别。有趣的是,405 nm蓝紫色相比激光产生了更多的杀菌效果比Ti HA-PLLA。对照组没有显著差异(没有辐照)两种材料之间(图6)。辐照对300年代引起的表面温度的增加HA-PLLA从20°C到23°C和从20°C到30°C的Ti(数据没有显示)。

4所示。讨论

延迟骨手术后感染使用osteosynthetic材料由Ti或bioresorbable材料是一个棘手的问题仍有待解决。然而,这种类型的感染的具体原因还不清楚,尚未建立有效的预防措施。本研究的结果证实了这一点金黄色葡萄球菌,这是术后最负责任的细菌感染,很容易遵循的表面材料由Ti或HA-PLLA,继续生存下去。也证实,一旦osteosynthetic材料表面的污染,一定量的细菌甚至可能依然提出材料表面经过严格清洗,然后导致殖民地在材料表面形成。即使有谨慎的注意在手术过程中,很难避免完全由一些细菌污染,清除所有污染细菌用生理盐水洗涤。这一事实表明,某些情况下,手术后炎症使用osteosynthetic材料可能是由于微量的细菌的生长在手术和附着在材料表面引入了身体。进一步的研究是必要的,然而,阐明建立的精确机制使用osteosynthetic生物材料骨手术后感染。

事实上,有相当数量的报告病例的延迟手术治疗后感染或发炎脓肿形成使用bioresorbable osteosynthetic HA-PLLA等材料(31日- - - - - -33]。到目前为止,这样的延迟通常被认为导致术后感染炎症与材料的分解,即异物反应或有缺陷的晶体组件的吸收26,34,35]。然而,目前的研究结果表明另一种可能延迟术后感染是由于炎症引起的延迟性少数坚持污染微生物生物材料的表面。这个概念可能会给一些新建议来解决临床问题。

从目前的研究结果来看,为了防止术后感染osteosynthetic材料植入后,似乎有助于减少微生物引入活体伤口之前关闭。所以,我们检查的有效性405海里蓝紫色相比激光辐照,已被证明有杀菌作用,微生物的杀菌坚持osteothynthetic生物材料。古费和Wilborn报道,与405 nm蓝紫色相比激光照射15 J /厘米²导致90 - 95%死亡率的解决方案金黄色葡萄球菌(27],Maclean等人报告了100%的死亡率与405 nm蓝紫色相比激光在36 J /厘米²(36]。其他研究表明,氧化钛能产生抗菌效果与紫外线和短波长可见光辐照时(37- - - - - -39]。在目前的研究在以往的研究中,405海里蓝紫色相比激光的照射产生杀菌作用金黄色葡萄球菌生物材料的表面由Ti。这405海里的杀菌效果观察到紫罗兰激光上升随着辐照能量,按照先前的研究的结果(30.,36,40]。导演今村昌平等人证实了明显的杀菌作用p . gingivalis在300年代0.2 W(与辐照30.]。当暴露于辐射在300年代0.2 W,能量密度的45 J /厘米²的磁盘,杀菌效果HA-PLLA Ti大约是93%和99%,这被认为是足够的消毒的残留量金黄色葡萄球菌洗后在生物材料。此外,300年代的辐照时间被认为是在可以接受的范围之内,在实践和病人的潜在负担最小,即使照射在手术过程中执行。

有趣的是,尽管没有显著差异的细菌粘附和两种材料之间的增长率,比Ti在HA-PLLA杀菌效果观察。虽然真正原因或精确的机制两种材料之间的杀菌效果的差异仍不清楚,还会涉及一些可能性。其中一个可能性是这两者之间的区别在颜色和反射材料。自HA-PLLA反射率高于钛材料表面的性质,更反映了405 nm蓝紫色相比激光发生表面上。因此,表面细菌粘附HA-PLLA可以与激光辐照即使在相同的辐照时间与Ti相比,和杀菌效果会更加强。另一种可能性是材料的形态特征的影响。计算表面粗糙度(Ra)和最大高度(Rz)在Ti与HA-PLLA相比更大。此外,扫描电镜显示一些作用分散。这些差异可能会影响辐照对细菌细胞的效率提出材料;,一些细菌粘附在表面的阴暗区域Ti可能辐照与那些HA-PLLA相比要小得多。 More interestingly, a slightly more bacterial growth was observed on the surface of HA-PLLA compared with Ti at 4–5 hours of culture after vortex washing, despite of no significant differences in bacterial adhesion between both materials. This phenomenon might come from a modest antimicrobial activity of photocatalytic titanium oxide layer covering the surface of Ti, because the investigation was not performed in complete darkness.

临床应用的卫生处理或消毒方法,对周边的影响组织必须仔细考虑关于活细胞和组织的潜在损害。从这一事实的波长405 nm蓝紫色相比激光在这项研究中的应用是在可见光范围内和辐照时间最多是300年代,这种辐射被认为是无害的,无害的邻近组织。此外,监测辐射的热效应表示,每个材料的表面温度增加到最多30°C在Ti甚至辐照后300年代,这意味着这个过程是无害的邻近组织,也影响细菌生长。由于这些原因,405海里的辐照蓝紫色相比激光被认为是临床适用的,并承诺措施防止使用osteosynthetic材料延迟骨手术后感染。

这项研究也是第一次检查405海里的杀菌效果蓝紫色相比激光细菌坚持osteosynthetic生物材料表面,确认辐照的有用性与临床应用相对较短的一段时间。虽然机制405海里的杀菌效果蓝紫色相比激光仍在调查中,卟啉,存在于细菌代谢产物可能参与其中。从内部产生的卟啉可以作为敏化并生成活性氧和自由基在光辐照下,导致细菌生长和生存能力,减少和最终的细胞死亡(41,42]。进一步的调查等胞内敏卟啉可以解决这个问题在不久的将来。

5。结论

目前的研究清楚地表明,辐照和405海里蓝紫色相比激光有效地减少了微生物的数量坚持osteosynthetic生物材料和引入活体骨手术。这些发现强烈建议的潜在效用405海里蓝紫色相比激光辐照作为替代策略预防术后感染后植入生物材料。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者声明没有其他关于这篇文章的出版的利益冲突。

确认

作者收到了金融支持对于本研究从Takiron有限公司,日本大阪。这项工作是支持的科研补助金(25463102号,26463028,16 k11770 17 k17156,和17 h04411)从教育部,文化,体育,科学,和日本的技术。此外,作者希望感谢Ushio inc .) 405海里laser-emitting设备的发展。

补充材料

补充图1:分光光度法确认的单波长发射激光的波长405 nm。(补充材料)

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