文摘

客观的。本研究的目的是探讨治疗效果的670纳米发光二极管(LED)照射在糖尿病性视网膜病变(DR)使用缺氧猕猴choroid-retinal (RF / 6 a)细胞作为模型系统。背景资料。治疗与光的光谱从红到近红外区有有益的影响组织损伤和670 nm retinoprotective治疗是目前临床调查。方法。在培养细胞进行了研究缺氧治疗下氯化钴(CoCl₂)。辐照后670海里不同功率密度,细胞活力、细胞色素C氧化酶的活动,和ATP浓度测定。结果。670海里的辐照导致显著提高细胞生存能力,细胞色素C氧化酶活性,ATP浓度在细胞缺氧RF / 6。结论。670海里了辐照可以恢复CoCl造成的缺氧损伤₂。领导的670 nm Photobiomodulation发挥着潜在的作用对糖尿病视网膜病变的治疗。

1。介绍

糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病微血管并发症最严重影响大量的病人。导致视网膜毛细血管损伤[博士1),最终导致失明。尽管视网膜激光光凝术治疗的广泛应用,博士有严重的副作用和治疗本身是一个病理过程。新的治疗方法正在积极探索和photobiomodulation博士博士是最有希望的治疗方法之一。

Photobiomodulation已经证明能够调节各种生物过程在细胞培养和动物模型2包括加速伤口愈合,改善线粒体功能,衰减在受伤的视神经变性3- - - - - -6]。低水平激光和发光二极管(led)是最常见的为photobiomodulation光源。与激光相比,LED显示更有前途的未来有更少的热量生产和有毒副作用。

先前的研究提供的证据导致治疗的治疗效益在670 nm提高线粒体的氧化代谢在体外和功能恢复的视网膜急性损伤后线粒体毒素在活的有机体内(4,7]。它表明,细胞色素C氧化酶中发挥着重要作用生成ATP是主光感受器在红色光的近红外线光谱区域(8- - - - - -10]。

在这里,我们表明,670海里的保护作用导致在射频/ 6细胞刺激细胞活动的结果与细胞色素C氧化酶活性的增强,进一步提高线粒体的氧化代谢,并提供保护缺氧损伤。我们雇佣了细胞色素c氧化酶活性和ATP含量CoCl造成的缺氧后的敏感指标₂和展示了670海里的功效治疗每天一次交付。我们建议photobiomodulation领导代表着创新和非侵入性治疗方法治疗糖尿病性视网膜病变。

2。材料和方法

2.1。材料

领导设备获得了从深圳Lamplic科技有限公司。视网膜血管内皮细胞行射频/ 6从细胞库,获得中国科学院。MTT和CoCl₂得到从Sigma-Aldrich公司(大陆)。线粒体细胞色素C氧化酶活性套件是购自Genmed科学Inc .)、美国。线粒体分离设备,BCA蛋白质浓度测定装备,和ATP测定设备购自上海Beyotime研究所的生物技术。

2.2。细胞培养

射频/ 6 a细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM(链霉素和青霉素1%)低于5%二氧化碳,37°C,每2 - 3 d通道。

2.3。CoCl引起的缺氧模型系统₂

缺氧模型系统是由恒河猴choroid-retinal (RF / 6 a)细胞与CoCl孵化₂24 h。控件组RF / 6没有氯化钴的细胞。

2.4。领导处理

射频/ 6与CoCl细胞₂治疗辐照与670 nm 71秒在黑暗中领导一天一次3天。

2.5。细胞生存能力

MTT比色细胞生存能力分析。细胞在良好的条件下被转移到细胞悬液,然后添加到96 -孔板5×10⁴(100 /毫升L)。麻省理工的解决方案(5毫克/ m1, 20L)添加到每个好然后养殖有限公司₂孵化器4 h。在200年中被L添加DMSO和震撼10分钟。OD值通过ELISA读者。

2.6。细胞色素C氧化酶化验

细胞色素C氧化酶活性变化确定的光吸收值与分光光度计比色法在550海里。30L线粒体溶解产物增加了线粒体分裂。指导下线粒体细胞色素C氧化酶活动装备介绍由制造商提供,样品准备。缓冲和样本后,OD值被分光光度计测量。细胞色素C氧化酶活性样本计算和基于OD值归一化和蛋白质浓度。

2.7。ATP分析工具

分析基于萤火虫luciferase-catalyzed D-luciferin氧化在ATP和氧气的存在,即大量的ATP是量化的光()生产。培养细胞与寒冷的磷酸盐,冲洗从封面通过细胞刮刀,然后离心机在4°C, 12000克与上层的8分钟离开。100年L ATP检测试剂添加和在室温下培养3 - 5分钟排气ATP的背景。然后用荧光素酶混合ATP化验,化验光度计。

2.8。统计分析

所有的值表示为±SEM手段。单向方差分析是借助SPSS13.0统计软件中使用,以确定任何组间存在显著差异。在所有情况下,被视为最低水平的意义。

3所示。结果

3.1。最优CoCl的行列式₂浓度

RF / 6模型细胞分为对照组和缺氧组不同浓度的CoCl引起的₂(100、200、300、400和500mol / L)。细胞生存能力是通过MTT法来衡量的。它表明,细胞生存能力降低功率密度依赖的方式(图1)。200细胞生存能力之间存在显著差异mol / L, 300年mol / L, 400年mol / L和500mol / L CoCl₂损伤组和对照组。在这里,200mol / L CoCl₂被选为下面的实验。

3.2。领导的最优功率密度的行列式

它表明,与对照组相比,RF / 6的细胞生存能力模型在200年细胞受损mol / L CoCl₂一组和射频/ 6 200年模型细胞受损mol / L CoCl₂然后由领导辐照在7兆瓦/厘米²14兆瓦/厘米²和28 mW /厘米²组显著降低。但是射频/ 6模型细胞的细胞生存能力受到200人mol / L CoCl₂和辐照领导在21兆瓦/厘米²与对照组相比没有显著差异。与200年相比mol / L CoCl₂单独组织,细胞的可行性射频/ 6 200年模型细胞受损mol / L CoCl₂强度和辐照领导与权力7日14日21日和28 mW /厘米²显著增加。在这里,21兆瓦/厘米²被选为最优跟踪实验的功率密度(图2)。

3.3。导致治疗对细胞色素C氧化酶活性的影响

如图3与对照组相比,细胞色素C氧化酶活性细胞受损到200年mol / L CoCl₂明显减少和细胞色素C氧化酶活性射频/ 6 200年模型细胞受损CoCl mol / L₂24 h和辐照21兆瓦/厘米²显著降低。之间不存在显著差异的细胞色素C氧化酶活动射频/ 6模型细胞治疗21兆瓦/厘米²领导和对照组。然而,与200年相比mol / L CoCl₂单独组织,细胞色素C氧化酶活性射频/ 6 200年模型细胞受损mol / L CoCl₂和辐照21兆瓦/厘米²导致显著增加虽然没有完全扭转细胞色素C氧化酶的对照组。有明显的区别的细胞色素C氧化酶活动射频/ 6模型细胞辐照21兆瓦/厘米²670海里领导单独治疗组和200mol / L CoCl₂独自一人。

3.4。导致治疗对ATP含量的影响

发现,与对照组相比,RF / 6的ATP含量在200年模型细胞受损CoCl mol / L₂24 h降低显著(图4);射频/ 6的ATP含量在200年模型细胞受损CoCl mol / L₂24 h和辐照21兆瓦/厘米²显著降低。之间不存在显著差异的ATP含量射频/ 6模型细胞治疗21兆瓦/厘米²领导和对照组。但与200年相比mol / L CoCl₂单独组织ATP含量的射频/ 6 200年模型细胞受损mol / L CoCl₂强度和辐照领导与权力21兆瓦/厘米²显著增加。之间有显著差异的ATP含量射频/ 6模型细胞辐照21兆瓦/厘米²670海里独自领导和200年mol / L CoCl₂单独治疗。

4所示。讨论

糖尿病视网膜产生异常,导致血管损伤和神经元,在严重的情况下,失明本身。博士的发病机制还有待阐明,尽管降低高血糖已被证明对发展起到积极作用,糖尿病性视网膜病变的进展。然而,血糖控制的成就和维护困难或不可能在许多患者;因此有效的抑制视网膜病变治疗研究。另一种方法是识别创新非侵入性治疗方法,由多个潜在的机制。光的光谱从红到近红外区(630 - 1000 nm)据报道是有益的治疗感染,缺血、缺氧的伤口和其他软组织损伤。

高能光被用作治疗眼科疾病的选项,如激光光凝术对年龄相关性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变。在目前的研究中,然而,我们证明了photobiomodulation使用低强度光可以恢复氯化钴所导致的缺氧的损害。我们发现低强度670海里LED照射3天改善细胞生存能力,细胞色素C氧化酶的活动,和ATP含量低氧射频/ 6 CoCl细胞受损₂曝光。我们的数据表明经济复苏的作用导致辐照对缺氧损伤引起的射频/ 6细胞氯化钴。此外,它没有影响正常的射频/ A6细胞,表明没有副作用的670 nm LED照射,这意味着低强度LED照射只起恢复作用的细胞在病理状态下,刘等人所指出的(11]。进一步研究的机制,只有影响病理细胞,但对正常细胞没有影响应该被进一步研究。

细胞色素C氧化酶复杂的抗氧化作用。最后在线粒体的呼吸电子传递链酶。它收到一个电子从每个四个细胞色素c分子和转移一个氧气分子。作为主要的感光光谱从红到近红外线光的区域,细胞色素C氧化酶中扮演一个重要的角色在治疗视网膜。在目前的研究中,我们探讨了低强度670海里了辐照对扩散的影响,细胞色素C氧化酶活性和ATP浓度缺氧射频/ 6细胞模型展示photobiomodulation细胞能量代谢的潜在可能的机制。尽管670海里了辐照可以完全恢复低氧的扩散射频/ 6细胞的正常RF / 6 a细胞,细胞色素C氧化酶活性和ATP浓度只能部分恢复。它建议的途径12)维持正常的射频/ 6细胞扩散和维护领导的完全康复了扩散的射频/ 6 CoCl细胞暴露₂都不同,但他们保持相同的扩散。这两个途径是众所周知的冗余路径(11]。

结果表明,光感受器细胞新陈代谢最活跃的身体和phototransduction所需的能量主要来自氧化代谢。这些信号事件可能包括立即早期基因的激活转录因子、细胞色素氧化酶亚基基因表达,和大量的氧化代谢相关酶和途径增加(13,14]。我们的研究表明,低强度670海里领导治疗可以调节视网膜的氧化代谢,改善视网膜功能通过增加细胞色素C氧化酶的活动中发挥作用抑制糖尿病性视网膜病变的发展。因为photobiomodulation被发现与最小风险,侵入式的,便宜,而且容易管理,它可能是一个简单的辅助疗法帮助抑制糖尿病性视网膜病变的发展。

5。结论

我们的研究提出,射频/ 6的缺氧损伤CoCl所致₂可以通过低强度完全康复了670海里辐照。领导的670 nm Photobiomodulation博士可能是一种新的有效的方法治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究的财政支持中国国家自然科学基金(没有。上海市自然科学基金,61078071)(09 zr1422500),和2013年“创新行动计划”从上海市科学技术委员会(没有。13 dz1940200)。