文摘
在光遗传学,定向照明用于控制细胞表达外源激活蛋白质的功能。采用optogenetic方法近年来迅速扩大。在本文中,我们描述了光敏通道蛋白参与了这些方法,描述技术针对神经元和其他细胞内外神经系统,并讨论其应用程序领域的神经科学。我们特别注重脑细胞蛋白质ChR2,光敏蛋白通常受雇于光遗传学。ChR2已经被许多团体控制神经活动,在体外和在活的有机体内用精致的解剖,短时间尺度和精度。此外,我们描述最近开发的工具,如视蛋白/ G protein-coupled受体嵌合分子光活性转基因体系。此外,我们讨论的潜在意义光遗传学发展的临床治疗。虽然不到十年,光遗传学已经负责不同领域的巨大的进步,和它的未来无疑是光明的。
1。介绍
光遗传学包括越来越多的家庭相关技术的转基因细胞因光刺激来影响细胞行为。对靶细胞受到光线的影响,他们必须设计来表达外源性光敏蛋白质改变膜电位,或其他细胞属性,为了应对照明(1- - - - - -5]。膜去极化的影响(或者一般较少,超极化)可以在单个细胞水平的监测,一组相互作用的细胞(如组织或神经回路),或整个有机体。因此,光遗传学包含几个组件:光敏蛋白的发现和优化,针对技术编码这些蛋白的基因特定的细胞类型,并为有针对性的照明技术在活的有机体内。此外,光遗传学是一种适当的方法来观察电生理学、功能,及光刺激产生的行为变化6- - - - - -10]。
光遗传学领域相当年轻。几个在optogenetic实验中,使用的光敏蛋白质如脑细胞(11,12和紫13- - - - - -15),几十年前被首次发现。然而,直到2005年,他们第一次被用来控制神经活动(16]。“光遗传学”一词被戴瑟罗斯本身创造了约2006,而实验室开创了许多基因和光学技术,促进照明的使用调查神经动力学(17]。最早的研究进行在体外在细胞培养,但到2007年,光纤的出现神经接口允许使用的细菌视蛋白影响行为完好无损,自由表现的哺乳动物(18,19]。从那时起,optogenetic应用迅速扩大到包括神经回路的研究,大脑疾病,和nonneuronal系统如干细胞、心肌组织,骨骼肌。因此,基于其日益增长的重要性作为一个范例在许多领域的生物医学研究,光遗传学被选为2010年年度“方法”自然方法(20.]。
在这次审查中,我们总结了最近的文献描述光遗传学发展新技术的使用控制的细胞功能。因为大多数的文献发表日期描述使用光敏蛋白质,如微生物视蛋白和植物光传感器,我们提供这些代表光敏蛋白的概述。此外,我们总结光遗传学的临床意义。
2。光活化的蛋白质
2.1。脑细胞和紫
一般而言,光遗传学操作涉及电激细胞的膜电位的改变通过控制照明的光。神经元的膜去极化引起瞬态电子信号(或动作电位峰值),最终神经元之间传递信息在同一电路。要人工神经元去极化的照明,他们设计表达的蛋白质改变膜的离子通透性的反应。第一个光敏蛋白质作为“开关”控制神经活动衣藻蛋白质名为(ChR2)、阳离子选择性通道,允许进入Na+和Ca2 +离子反应蓝光(470 nm波长)21- - - - - -31日)(图1)。ChR2,藻趋光性受体,利用等离子体光去偏光膜(32),充当light-gated阳离子通道在动物细胞中表达的时候12]。ChR2表达主要在光线暗的条件下,表明蛋白质参与了黑暗的视觉感受衣藻细胞。与大多数cation-selective离子通道,ChR2包含七个跨膜α螺旋(GPCRs) G protein-coupled受体的特征。内格尔等人证明ChR2不同大小的细胞可以用来去偏光只需照亮细胞与适当的波长(12]。当ChR2神经元中表达,细胞被暴露在蓝光,通道立即去极化的神经元,引发了飙升。
开始培养神经元和更复杂的程序在体外系统,这个属性ChR2一直利用精确控制神经活动。在最初的研究中,戴瑟罗斯集团(16]ChR2用来可靠地控制神经元飙升兴奋和抑制性突触在毫秒时间尺度控制传输。因为照明可以控制在空间和时间分辨率很高,这种方法允许实验操纵的神经处理精度,即使在单峰值的水平和突触活动。毫秒——第二音阶控制神经元的功能也是通过李et al。33),他们开发的系统光激活的神经元使用脊椎动物大鼠视紫红质4 (RO4)和绿藻ChR2。两种激活蛋白的使用允许精确的和可逆的敌对的神经功能的控制,在培养的神经元和完整的脊髓。敌对的控制也是通过使用替代激活蛋白具有不同波长敏感和离子渗透率。例如,氯泵紫(NpHR)神经元超极化反应黄灯(590 nm波长),与装备,去偏光表达细胞与蓝光(图下照明1)。
除了培养神经元,ChR2一直在利用的背景下培养大脑切片,允许调查的细胞在更大、更复杂的安排。张和Oertner [34)结合millisecond-scale激活ChR2钙与双光子成像鼠海马切片的文化。在这个研究中,钙的大量涌入造成光驱动动作电位大于这些体细胞所产生的电流注入;因此,作者能够实现高度可再生的突触传递。此外,相关的光刺激的突触后去极化片诱导长期势差。这样的在体外系统将允许调查使用的工具的突触可塑性遗传学和药理学。
片文化已被用于解决相关的挑战单细胞optogenetic激活时间精确的定位,与高峰时机。在海马切片鼠标,Andrasfalvy et al。35)使用optogenetic方法实现亚微秒级的单一神经元的控制。暂时集中激光照明的使用,研究允许同时激发大量的渠道在单个神经元,造成去极化,都是大级(~ 15 mV)和快速(小于1 ms)。高时空分辨率的技术使选择性照明(因此选择性激活)的亚细胞的特性,包括突触前终端和树突,在相当大的深度切片。
虽然大脑切片比培养个体生理相关神经元,他们仍然不完整的大脑。照明方法优化在活的有机体内上下文(如光纤),与转基因技术相结合,使ChR2-mediated光遗传学将培养皿跳出到活着的生物。例如,在线虫秀丽隐杆线虫,ChR2表达兴奋细胞被用来激活特定的神经和肌肉,从而引出生活的具体行为和完整的动物36]。然而,光遗传学的最大优点已经被广泛的最近的研究显示在啮齿动物。早期研究采用转基因动物表达整个大脑激活的蛋白质,如Arenkiel等的研究。37)使用老鼠表达ChR2-YFP融合蛋白在中枢神经系统。这些作者能够利用在活的有机体内激活的神经元映射神经回路参与嗅觉;他们的数据表明,嗅觉处理鼠标取决于僧帽细胞融合到嗅觉皮层细胞皮层和随后的集成。这项工作集早期先例的价值光遗传学方法影响完整的动物的大脑神经活动和使用这种实验操作来探测复杂功能的神经元之间的连接在活的有机体内。
更大的实验能力已经达到目标的表达ChR2大脑内神经元的特定子集。这样的目标通常是通过限制通道表达都在解剖学上,通过精确的交付ChR2-encoding病毒载体到特定的大脑区域,或基因,通过将ChR2专门激活启动子的控制下在感兴趣的细胞类型。基因定位本身可以通过多种方式,例如,通过转基因技术或使用病毒编码通道由细胞特定类型启动子驱动的。此外,解剖和基因定位方法通常一起使用。几种定位方法及其应用的例子如下所述。
在严格的解剖定位的一个例子,Huber et al。38)执行在子宫内电穿孔的ChR2-GFP皮层锥体神经元的胚胎小鼠。作为成年人,electroporated老鼠表示通道层2/3的一小部分神经元,主要在桶皮层。这些动物可能是习惯于检测短暂的光脉冲序列(导致相应的简短的列车动作电位),证明非常短期的皮质皮层神经元的活动在一个稀疏的子集可以驱动决策和学习。在一个严格的基因定位的情况下,王等。39)生成转基因小鼠行表达ChR2神经元在大脑的不同区域的不同子集和使用他们的系统映射活体动物的大脑皮层神经元的突触回路。
几项研究目标交付ChR2基因和解剖学上为了限制对特定大脑区域的通道的表达和/或感兴趣的细胞类型。蔡et al。40]stereotactically注入Cre(特定站点DNA重组酶)诱导腺相关病毒(AAV)编码Chr2-EYFP到腹侧被盖区(VTA)酪氨酸hydroxylase-internal核糖体进入位点(IRES) Cre转基因老鼠,导致光活性蛋白的表达特别的多巴胺(DA) VTA神经元。通过选择性地刺激这些细胞自由行为的动物,作者能够表明,相位的DA神经元的激活VTA导致行为调节不能通过长,低频动作电位。同样,Kravitz et al。41)注入AAV编码Cre-activatable ChR2-EYFP dorsomedial纹状体的转基因老鼠在媒介表达Cre带刺的神经元(msn),从而限制表达的渠道直接或indirect-pathway msn。使用这个系统,作者表明,轨迹激活通过光纤照明ChR2获救疾病相关症状的帕金森病(PD)模型。他们的研究结果清楚地表明,基底神经节电路起到了至关重要的作用在帕金森运动行为和监管建议治疗轨迹的调制电路可能用于治疗运动赤字与帕金森病有关。在另一个例子的解剖和基因定位相结合,Adamantidis et al。18]介绍了慢病毒编码ChR2-mCherry食欲素(Hcrt)启动子的控制下通过立体定向注射到老鼠的外侧下丘脑,导致通道表达细胞在这个大脑区域的一个子集。Hcrt神经元的特定模式的刺激从睡眠唤醒的可能性增加,表明这些细胞发挥了积极作用在决定清醒。这些结果提供了重要的见解睡眠的神经基础的监管。
它可能会达到更高的空间分辨率,在特定的结构在特定的细胞类型,使用光驱动目标的蛋白质亚细胞车厢内神经元。(如上所述,这种级别的分辨率可以达到大脑切片使用暂时集中激光,但这种照明方式并不适合使用在大脑完整。)例如,刘易斯et al。42]表明ChR2融合Melanophilin myosin-binding域的局部somatodendritic隔间。结合上述解剖和基因定位的方法,这样的融合蛋白可以用来使特定的光刺激树突的特定的细胞类型,大大增加了电路级分析的潜在力量。
上述报告显示,ChR2被广泛用于调节神经元的膜电位,但最近,几组也探索的可能性ChR2调停optogenetic应用在大脑细胞以外的其他神经元。例如,为了模仿pH-induced钙反应参与调节呼吸,Gourine et al。43)使用光刺激ChR2-expressing星形胶质细胞。这刺激导致化学感受器神经元的激活和呼吸的影响反应在活的动物,表明神经胶质细胞参与呼吸反射。此外,ChR2越来越多被应用在中枢神经系统。特别是,光遗传学方法被用来控制心肌细胞和其他心脏电活动的细胞。Bruegmann et al。44表示ChR2心肌,使他们能够刺激心脏组织空间和时间精度;他们的发现揭示了长时间的去极化对节奏的影响一代和钙稳态的心。骨骼肌与光遗传学工具也被调查:浅野et al。45]光诱发动作电位用于ChR2-expressing肌管,最终导致这些细胞的可控收缩。因为骨骼肌能传感力有效,这种方法可能是有用的生物微器件中收缩模式是由局部照明。此外,ChR2也被引入胚胎干细胞(ESCs),允许可靠的跟踪这些细胞和他们的后代,以及空间和时间控制神经元的电活动(和其他细胞类型)源自ESCs [46,47]。这些方法应该允许精确光学调节ESCs的分化在活的有机体内和在体外和促进研究的方法,移植的ESCs导致的组织和网络最终驻留。
2.2。视蛋白/ G Protein-Coupled受体(GPCR)嵌合体和其他视蛋白
如上所述,微生物与GPCRs视蛋白结构相似。Airan等人利用这种相似性来构造opsin-GPCR嵌合体,称为“optoXRs”的信号活动响应光(48]。结合光照明技术也用于ChR2-mediated光遗传学,optoXRs被用来精确地控制细胞内信号事件在活细胞和完整的生物体。在最初的研究中,Airan等人开发了两个optoXRs激活不同的信号在光照明模块(图2(一个))。生活伏隔核的小鼠,这两个optoXRs表现出拮抗对神经元活动的影响。此外,当光刺激与特定的时间、管理的影响optoXRs在细胞内信号可以调节调节自由移动的动物。因此,使用optoXRs补充使用ChR2介导optogenetic控制行为在哺乳动物如老鼠(图2 (b))。
(一)
(b)
在一个类似的实验中,古铁雷斯et al。49脊椎动物视网膜紫质)开发了一个optogenetic系统,protein-coupled受体表达在小脑浦肯野细胞(pc)的老鼠。在活的有机体内激活的视紫红质光照明专门表达个人电脑减少了简单的峰值发射,相当与减少解雇观察小脑激活的耦合的GABAB受体。特别是,小脑蚓部的光照明在自由移动的老鼠改变了运动行为。因此,通过调制介导的信号在小脑电脑影响运动协调和显示一个新的有前途的方法来研究G protein-coupled生理功能的受体介导信号细胞特定类型的方式。Karunarathne et al。50)也利用nonrhodopsin optogenetic范式目标几类的视蛋白G protein-mediated单个细胞的胞内信号精确划定区域。使用这个系统,他们能够调节行为的分化细胞和早期分化的神经元通过照明控制。类似的策略可以很容易应用于调查的角色G蛋白在其他现象,如免疫细胞的迁移和导航或收缩的心脏组织。
2.3。Light-Switchable转基因体系
上面描述的系统中使用的光传感器是膜蛋白,细胞表面定位。他们要么改变膜电位或激活细胞内的信号级联反应。虽然光激活这些蛋白肯定影响基因表达,这种监管是相当低的特异性,而且仅限于的信号通路的下游目标光传感器交流。为了克服这些挑战,实现高度特定的基因激活光刺激,王等人设计了一个合成light-switchable反式激活因子,结合目标启动子在回应蓝光(51- - - - - -53]。反式激活因子包括的核心特征Gal4 dna结合域融合自民党,其中包含light-oxygen-voltage(值列表)二聚在探讨蓝光照明领域。当这个核心融合是一个合适的transactivation域(例如,从p65)融合蛋白结伴的反应,一定会的加上游激活序列,和一个目标基因的转录激活或基因(图3(一个))。这转基因系统,“LightOn”,时空上允许精确的操纵与更大的特异性基因表达水平可以通过刺激法案通过细胞内的信号级联的膜蛋白。
(一)
(b)
值列表域也利用吴et al。54Rac1]生成photoactivatable衍生品,肌动蛋白细胞骨架的关键调节器。在此系统中,在unilluminated细胞,值列表域块Rac1与其合作伙伴的互动过程中蛋白质;辐照导致链接器区域连接Rac1和值列表域放松,解放Rac1从事下游信号。使用photoactivatable Rac1 (PA-Rac1)、吴等人可以使用光诱导细胞突起和波动空间精度高,刺激细胞的能动性,和影响的方向运动。
值列表域并不是唯一的蛋白质模块可能会利用上述这类策略。已知的感光细胞是有区别的根据他们的发色团和光化学分为六类:值列表传感器,xanthopsins,光敏色素,疯狂使用黄素腺嘌呤二核苷酸的传感器,中一种,视紫红质55- - - - - -57]。几个评论提供了一个深入的讨论自然值列表和光敏色素光感受器(58,59]。
因为我们有报道,隐花色素2,蓝光光感受器和生物钟蛋白质,是控制细胞分化的关键因素后,蓝光照明(60- - - - - -62年),隐花色素2是一个适用于蛋白质的光遗传学light-switchable转基因体系。Konermann等人报道的发展light-inducible转录效应器(点燃),一个optogenetic 2台混合动力系统集成可定制的故事与光敏色素2蛋白质和dna结合域互动合作伙伴CIB1(图3 (b))[63年]。点燃不需要额外的外源性化学代数余子式,很容易定制针对许多内源性基因位点,并且可以在几分钟内被激活和可逆性。他们的应用系统主要鼠神经元,以及自由表现的老鼠的大脑在活的有机体内调解可逆调制的哺乳动物内源性基因表达以及目标表观遗传染色质的修改。他们的结论是,optogenetic LITE系统建立了一个小说模式的内源性细胞过程的控制,使因果角色的直接测试的遗传和表观遗传调控在正常生理过程和疾病状态(63年]。
2.4。使光敏化腺苷酸环化酶(PAC)
细胞内营一直扮演着重要的角色。Iseki等人首先发现用光催化腺苷酸环化酶(PAC)是一个独特的蛋白质可以作为光感受器和作为效应器来催化合成营,与G-protein-coupled受体系统相比,在三个不同的蛋白质顺序行为调节环核苷酸水平(64年,65年]。PAC原本孤立的鞭打眼虫属股薄肌。后通过蓝光刺激导致营迅速增长的水平。因此,使用PAC允许操纵神经递质释放和行为直接影响细胞内信号(66年,67年]。
2.5。LiGluR
Volgraf等人报道,一个ionotropic谷氨酸受体亚型6 (iGluR6)基因和化学工程,使其光敏感。使用基于结构的设计,他们修改其无处不在的clamshell-type配体结合域开发激活通道,这名叫LiGluR [68年]。小组还发现,LiGluR迅速产生大电流(数以百计的pA),产生大量(数万mV)在海马神经元去极化。毫秒闪光诱发动作电位或阈下的电压变化,模拟快速兴奋性突触后电位。能够激发神经元与LiGluR丝毫反应的ChR2 LiGluR电流5倍大,稳定在长时间的照明,和因为失活是light-driven更快地释放,从而使细胞在更高频率可靠地解雇了。此外,LiGluR有独特的属性,一旦被短暂的光脉冲,激活通道将为分钟在黑暗中保持开放,直到处于待发状态的脉冲光关闭它,从而使长期的动作电位去极化和火车诱发以最小的曝光(69年]。
2.6。HyLighter
Janovjak等人还报道potassium-selective ionotropic谷氨酸受体可逆地抑制神经元活动响应光分离神经元和大脑切片以及可逆地抑制行为在斑马鱼70年]。嵌合体是跨膜螺旋的构造和可重入的pore-loop K+选择性sGluR0被移植到iGluR6,这些修改的最佳light-gating和称为HyLighter。这个超极化light-gated通道被短暂的光脉冲在一个波长和关闭脉冲在一个波长。光激活后,光电流和光沉默的活动持续长时间在黑暗中。的低光照条件和双稳态HyLighter代表神经系统解剖的优势(70年]。
3所示。交付的光
电子系统集成的身体提供了强大的基础研究和临床医学诊断和治疗能力。最近的研究建立了材料和机械电子线路的结构、发光二极管(led),传感器,和其他组件。在光遗传学,光纤设备限制的机会在活的有机体内使用和广泛的生物应用。作为一个解决方案,Bruchas和罗杰斯集团机械的开发,超薄多功能光电系统,安装在可发布的注射针插入深度的软组织(71年,72年]。这些设备将从细胞层面组件独立可寻址五彩缤纷的微尺度。此外,田村等人报道了钨microelectrode-based光学探测器、光纤化学传感,包含在其绝缘玻璃光纤(73年]。这种光滑的玻璃光纤化学传感是一个有前途的慢性的工具在活的有机体内实验与不同的研究目标包括脑深部结构表现猴子。
这些类型的定制设备代表了光遗传学社区的重要一步在活的有机体内应用程序,允许多个明亮激发站点以及微创探针的长度。
4所示。光遗传学的临床意义
光遗传学的效用并不局限于实验操作,还包括潜在的重要的治疗应用。为临床使用的一些最有前途的机会optogenetic方法的出现,也许不足为奇的是,在视觉系统,ChR2的原始函数作为光敏色素是最相关的。当ChR2引入二阶神经元(双极细胞)rd1视网膜变性的小鼠模型,能够刺激light-evoked反应合成感光细胞在视网膜神经节和视觉皮层(74年]。同样,ChR2引入视网膜神经节细胞在基因盲人恢复视力大鼠(75年]。这些研究的结果提出了这样的可能性,那就是这ChR2可用于基因治疗人类某些形式的先天性或后天失明的(75年]。
在另一个医学领域,ChR2被用来探测特定大脑区域的角色和活动模式在控制癫痫发作76年),海马的双向网络的潜在意义确定癫痫发作的开始和结束。通过促进发展的方法来选择性地阻止或激活相关电路,这些发现可能有一天有助于改善治疗癫痫。
特劳纳和Isacoff集团报告方法,基因和化学工程LiGluR表示有选择地在视网膜神经节细胞(RGCs),最经久不衰的细胞在视网膜致盲性疾病。当表达的RGCs的视网膜变性的鼠模型,LiGluR恢复RGCs感光性,恢复光响应性的初级视觉皮层,和恢复瞳孔反射和自然light-avoidance行为(77年]。
5。结论
给定的速度进步在过去的几年里,它是合理的预测,分子光遗传学技术将继续快速发展,这些方法的应用程序将继续扩大。正如解剖和光敏蛋白质的基因定位做出了极大地贡献我们的知识的神经回路,日益增长的工具集的亚细胞定位optogenetic组件应该促进我们理解的进步的重要性亚细胞的生理和功能域和胞内隔间神经元和其他细胞类型。同样,蛋白质-蛋白质之间的关系通过光驱动二聚作用域的控制将进一步使控制定位特定亚细胞的蛋白质和信号中间体的生产地区。
从它的起源在神经科学,optogenetic技术迅速传播跨越学科界限,及其广泛的潜在应用才刚刚开始采样。随着技术的发展和成熟,光遗传学应该继续变换生物学在未来几年。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
这个评论文章是由日本促进社会科学(jsp) KAKENHI授予数量25713009。