文摘
目的。探讨LED-activated姜黄素光动力作用对细胞活力的影响,膜透性和细胞内的活性氧金黄色葡萄球菌。方法。金黄色葡萄球菌与不同浓度的姜黄素孵化60分钟,然后由蓝色辐照光的波长470 nm和剂量的3 J /厘米吗2。集落形成单位试验是用于调查photocytotoxicity姜黄素金黄色葡萄球菌共焦激光扫描显微镜(样品形貌)和流式细胞仪(FCM)分析膜透性,FCM分析DCFH-DA染色测量细胞内ROS水平和透射电子显微镜(TEM)观察形态和结构。结果。蓝色的光活性姜黄素明显死亡金黄色葡萄球菌姜黄素剂量依赖性的方式。TEM观察到显著的结构性破坏金黄色葡萄球菌在光驱动姜黄素。发现更多的π的红色荧光染料金黄色葡萄球菌被蓝色光活性的姜黄素比控制细菌细胞。细胞内ROS增加激活后观察姜黄素。结论。蓝色的光活性姜黄素明显损坏的膜透性,导致细胞死亡金黄色葡萄球菌并强调了细胞内ROS增加可能是光动力杀死一个重要的事件金黄色葡萄球菌姜黄素的存在。
1。介绍
金黄色葡萄球菌是一种最常见的机会性病原体在兽医,这通常会导致皮肤和软组织感染和呼吸道感染疾病和菌血症1- - - - - -4]。抗生素是最常见的药物目前用于临床的设置。然而,长期抗生素治疗容易导致耐药菌株的紧急,影响并降低抗生素的治疗效果。因此,迫切需要探索新的和更有效的策略来消除金黄色葡萄球菌。
光动力疗法(PDT)是另一种方法来消除快速增长的细胞和组织。PDT,无毒的染料,也叫敏无害的可见光激发,产生细胞毒性活性氧(ROS),引起致命的损害在目标细胞和组织(5- - - - - -8]。PDT是一种另类的政权已经被许多国家批准治疗恶性肿瘤患者和年龄相关性黄斑变性(AMD)。最近,越来越多的数据显示,光动力作用能有效地杀死病原微生物,称为光动力失活(PDI)以及光动力抗菌化疗(协议)5- - - - - -7,9- - - - - -11]。相比传统的抗生素治疗,PDI独特优势的双特异性针对消灭病原微生物:优惠病原微生物的吸收和目标病变辐照激光或可见光。此外,细菌的耐药性PDI很可能因为PDI对细菌的非特异性损伤(12]。所以,PDI显示潜在的承诺根除病原微生物和治疗传染病。
姜黄素(坏蛋),孤立的根状茎姜黄,是一种天然多酚化合物。许多调查发现姜黄素的各种生物活性包括抗增殖、抗菌和抗氧化活性13]和姜黄素的活动可以增强在可见光照射在周围的波长400 - 500纳米14]。这些数据还表明,姜黄素是一种有效的天然光敏剂。因此,在我们目前的研究目的是探讨LED-activated姜黄素光动力作用对细胞活力的影响,膜透性,细胞内活性氧(ROS)的金黄色葡萄球菌。
2。材料和方法
2.1。光敏剂
姜黄素作为光敏剂在本研究从西格玛(美国)。股票的解决方案是在二甲亚砜(DMSO)浓度的100毫米和蒙在鼓里−20°C。
2.2。菌株
金黄色葡萄球菌应变的Liangku黄先生从第二附属医院,重庆医科大学,中国。从患者压力最初是孤立的金黄色葡萄球菌肺炎和被铬琼脂技术。细菌细胞种植在一夜之间在Luria-Bertani 37°C(磅)中颤抖。然后细菌悬液是分布在LB-Agar盘子和培养从有氧锻炼如我们以前的报告所述15]。
2.3。Photocytoxicity测定姜黄素的细菌
的细菌细胞金黄色葡萄球菌在LB培养基上生长在指数期在4 000转离心收获而5分钟。细菌悬液(108cfu /毫升)准备和孵化与不同浓度的姜黄素(0、0.5、1、1.5、2、2.5μ米)在6-well板在室温下在黑暗中60分钟,然后由蓝光LED光源所发射的辐射的波长470 nm和60兆瓦的功率密度/厘米2被江et al。16]。
所有实验被随机分为四组,如下所示。(1)组1(虚假的控制):细菌细胞在虚假的控制被姜黄素和蓝光治疗。(2)组2(姜黄素治疗单):细胞仅在姜黄素治疗组被姜黄素没有光照射治疗。(3)组3(仅蓝光照射):细胞仅在光辐照组被蓝光与辐照剂量的3 J /厘米2而姜黄素治疗。(4)组4(蓝色光活性姜黄素):蓝色的细胞激活姜黄素组preincubated由不同浓度的姜黄素结合蓝光的剂量3 J /厘米2。
激活的姜黄素后,细菌被连续在磷酸缓冲盐稀释10倍(PBS)获得稀释10−1~ 10−6原来的浓度。50μL(每个稀释然后传播LB-Agar盘子和培养在黑暗中耗氧16 h在37°C。细菌的生存能力是通过计数集落形成单位调查。
2.4。膜透性试验
细菌细胞的膜透性调查使用共焦激光扫描显微镜(样品形貌)和流式细胞术(FCM)。总之,细菌与姜黄素(2.5首先孵化μM) 60分钟在黑暗中在37°C,然后由蓝光与辐照剂量的3 J /厘米2。光动力治疗后,细菌是收获(4 000 rpm, 5分钟)和propidium碘(π)(10μg / mL)被添加到每个。在黑暗中孵化后20分钟,染色观察细胞的膜透性立即使用样品形貌和使用电荷耦合器件彩色摄像机图像记录。此外,膜透性的细胞染色π也使用FCM分析(美国正欲SE)的激发光的波长488纳米。
2.5。ROS测量
细菌细胞后在姜黄素(2.5光敏μ米,3 J /厘米21),细菌细胞孵化μL 2, 7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA 10 mM, Beyotime、江苏、中国)为在黑暗中20分钟37°C。ROS分析使用流式细胞术(FCM)(美国正欲SE)的激发光的波长488 nm和信号终于获得FL-2通道。
2.6。超微结构的观察
在光驱动姜黄素(2.5μ米,3 J /厘米2),细菌细胞固定在2%戊二醛和1天OsO后缀为2%4酒精与分级、脱水和嵌入环氧树脂812(电子显微镜,华盛顿堡,宾夕法尼亚州,美国)。超薄部分(100海里)的细菌细胞染色醋酸双氧铀及柠檬酸铅和透射电子显微镜(TEM)下观察(h - 600;日立、日本)。
2.7。统计分析
所有数据都表示为均值±SD和Windows使用SPSS 18.0统计分析。单向方差分析(方差分析)是用于比较组之间的差异。一个值小于0.05被认为是显著的差异。
3所示。结果
3.1。Photocytoxicity化验
Photocytoxicity姜黄素的金黄色葡萄球菌用集落形成单位分析测量。图1表明,蓝色的光活性姜黄素明显灭活金黄色葡萄球菌姜黄素浓度的方式。没有显著失活活动在控制细胞被发现仅靠姜黄素单独或蓝光照射治疗()。
3.2。膜透性试验
细菌细胞的膜透性用PI染色后的样品形貌测量。发现更多的红色荧光金黄色葡萄球菌被蓝色光活性姜黄素比细胞从虚假的控制,姜黄素治疗,和蓝光照射。虚假的控制没有显著区别,姜黄素治疗,和蓝光照射(图2)。流式细胞术显示,细菌染色的阳性检出率π虚假治疗为1.27%,仅在姜黄素治疗,1.46%和1.50%仅在蓝光照射,然而,PI染色细胞的阳性检出率显著增加了28.31%姜黄素联合治疗后,蓝光照射(图3)。
(一)
(b)
(c)
(d)
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3.3。ROS生产
DCFH-DA染色后,FCM调查显示荧光的光谱转变曲线向右移动,表明ROS水平金黄色葡萄球菌激活后姜黄素明显高于控制细菌从虚假的对照组,姜黄素治疗组,和蓝光照射组(图4)。
3.4。超微结构变化
TEM观察到,金黄色葡萄球菌细胞仅从姜黄素治疗组(2.5μ米)和蓝光照射组(3 J /厘米2)完好无损和平滑(数字5 (b)和5 (c)),类似于那些虚假的对照组(图5(一个)),而电子密度的蓝色细菌细胞被激活姜黄素低于对照组(图5 (d)大多数观察)和液泡金黄色葡萄球菌细胞LED-activated姜黄素治疗后。结果表明,部分细胞质泄漏发生姜黄素联合治疗后(2.5μ米)和蓝光照射(3 J /厘米2)。
(一)
(b)
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(d)
4所示。讨论
药用植物被发现含有大量的活性成分杀死病原微生物(17]。中药是一些特定的药用植物,广泛用于传统医学应对各种临床疾病(18]。许多传统的中草药,如清洁热,解毒草本植物被广泛用于治疗感染性疾病。姜黄素是一种天然色素与传统的中药姜黄。大量研究和临床证据表明,姜黄素具有许多医疗活动包括抗氧化、抗肿瘤、抗菌和免疫调节13,19- - - - - -23]。发现了姜黄素诱导细菌FtsZ组装和抑制细菌的胞质分裂,甚至中断群体感应(QS)减少致病性13,24]。最近的研究表明,姜黄素抑制Sortase A和金黄色葡萄球菌细胞粘附纤连蛋白(25]。然而,更高的药物剂量往往需要实现杀菌功效的姜黄素(26]。有趣的是,越来越多的证据表明,可见光照射能够激活姜黄素和增强其抗菌和antitumoral活动(8,14]。为了有效地激活姜黄素,我们已经成功地建立一个蓝色使用LED光源。在目前的研究中,光动力作用的蓝色光活性姜黄素金黄色葡萄球菌使用CFU试验研究。我们观察到显著减少的可行性金黄色葡萄球菌姜黄素联合治疗后,蓝光照射和姜黄素低剂量明显死亡金黄色葡萄球菌在蓝光照射。TEM结果也明显观察到细菌细胞超微结构损伤的姜黄素联合治疗后,蓝光照射。PDI的事实,它可以杀死致病细菌已经被美国和其他科学家证实5- - - - - -7,9- - - - - -11]。姜黄素,一个活跃的化合物与多目标活动从食物和传统中药,是一种安全、有效的抗菌剂和也是一个天然光敏剂(8,13- - - - - -16,24,25]。姜黄素的结合和光线照射会双重抗菌效果,包括直接姜黄素本身的抗菌活性和ROS-mediated姜黄素在蓝光照射的抗菌效果。因此,蓝色光活性姜黄素可能是一个潜在的方法杀死金黄色葡萄球菌。
膜完整性的prerequirement细菌生存。π是荧光核酸绑定染料排除的细菌和真核生物的细胞膜完整,细胞膜渗透性的通常是用作指标(27]。在当前研究中样品形貌与PI染色法观察了细菌与红色荧光姜黄素治疗后结合蓝光照射的控制,包括虚假的辐照,姜黄素治疗,和蓝光照射。流式细胞术也强化了样品形貌的观察,证明蓝色光活性姜黄素明显损坏的膜金黄色葡萄球菌。TEM发现许多细菌细胞的液泡,显示部分细胞质泄漏姜黄素联合治疗后,蓝光照射。观察结果表明膜完整性的破坏可能直接导致的损失细胞质内容,随后导致细菌死亡。
过度的细胞内活性氧的积累是细胞死亡的直接或间接原因15]。过多的活性氧可以破坏细胞膜,细胞质膜、核膜直接导致细胞死亡。此外,通过氧化细胞内ROS可能间接导致致命的细胞损伤生物分子如核酸和蛋白质(6,15,28- - - - - -31日]。我们与DCFH-DA染色流式细胞术也观察到细胞内ROS水平显著增加姜黄素联合治疗后,蓝光照射,表明蓝色光活性姜黄素破坏膜透性可能通过细胞内活性氧的过量积累引起的细胞死亡金黄色葡萄球菌。然而,姜黄素光动力作用是一个复杂的细胞和分子事件;确切的机制将进一步探索在未来的调查。
5。结论
崛起的新抗生素耐药性细菌相对缓慢的发展促使研究人员寻求新颖的抗菌策略。我们目前的数据显示,蓝色的光活性姜黄素膜透性受损,导致细胞死亡金黄色葡萄球菌并强调了细胞内ROS增加photodynamically杀死可能是一个重要的原因金黄色葡萄球菌姜黄素的存在。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是支持的一般研究基金会(平)授予来自香港RGC(476912),香港中文大学的直接拨款(4053026),和深圳的创新和技术基金(CXZZ20120619150627260)。作者表达衷心感谢吴我博士Liangku Wong先生和柳庙对他们有用的帮助。