文摘

目的。调查的影响光驱动hypocrellin B的生长和膜透性革兰氏阴性细菌。方法。大肠杆菌(大肠杆菌细菌的革兰氏阴性细菌)作为模型孵化与不同浓度的hypocrellin B为60分钟,随后被辐照蓝光波长为470 nm的剂量12 J /厘米²。菌落数的生长抑制率大肠杆菌细胞激活后计算hypocrellin b膜透性测量使用流式细胞仪和共焦激光扫描显微镜(样品形貌)propidium碘(π)染色。细菌形态使用透射电子显微镜(TEM)观察。活性氧在细菌细胞用流式细胞仪测量DCFH-DA染色。结果。显著的生长抑制率大肠杆菌光动力作用后细胞观察hypocrellin b的超微结构的损伤大肠杆菌也是TEM观察到。流式细胞术和样品形貌观察表明,激活hypocrellin B明显的膜透性增加大肠杆菌。流式细胞仪显示细胞内ROS增加大肠杆菌光动力治疗作用hypocrellin B。结论。激活hypocrellin B细胞内ROS增加引起的结构破坏和抑制革兰氏阴性的增长大肠杆菌细胞。

1。介绍

细菌感染是威胁人类的出现加剧了问题可以通过使用抗生素耐药菌株。因此,迫切需要探索替代的策略对抗病原菌。

光动力失活(PDI)是一种很有前途的方法来消除病原菌因为PDI杀死病原菌通过细胞毒性活性氧(ROS)所产生的光辐照后的光敏药物。ROS的非特异性损害不太可能导致细菌的耐药性细菌PDI (1- - - - - -4]。因此,PDI吸引我们的兴趣去探索它在对抗细菌感染中的作用。

在我们之前的研究中我们调查一些天然光敏化合物的光动力活性从传统中药(5- - - - - -7]。Hypocrellin B是一种最常探讨光敏药物从传统的中药了以bambuase(8,9]。我们的研究发现光驱动hypocrellin B可能产生细胞内ROS水平,这可能会导致大量细胞死亡和破坏的革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(5,6,10]。然而,越来越多的证据表明,革兰氏阴性细菌比革兰氏阳性细菌抵抗PDI (11]。杀死革兰氏阴性细菌很多敏被调查,包括亚甲蓝、甲苯胺蓝,酞菁,氯,卟啉,叶绿素,细菌叶绿素,富勒烯及其纳米粒子12]。在目前的研究中,我们选择大肠杆菌革兰氏阴性细菌模型,重点观察光活性的影响hypocrellin B的生长和膜透性革兰氏阴性细菌。

2。材料和方法

2.1。菌株

大肠杆菌应变DH5α是一个慷慨的礼物吴博士,P2重庆医科大学儿童医院的实验室,中国。后大肠杆菌细胞培养在一夜之间在Luria-Bertani 37°C(磅)中在200 rpm,大肠杆菌悬架(cfu /毫升,100年μL)是分布在LB-Agar盘子然后孵化16 h在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。

2.2。集落形成单位分析

大肠杆菌细胞生长对数期被离心收获(在4000 rpm, 5分钟)。细菌悬液(10⁸cfu /毫升)与不同浓度的准备和孵化hypocrellin B (0、5、10、15、20、25μ米)6-well板。孵化60分钟后在黑暗中在室温条件下,细菌悬液被蓝光辐射从一种新型LED光源的波长470 nm和60兆瓦的功率密度/厘米²。光照射后,细菌细胞连续在PBS稀释10倍。每个样本(50μL)传播在LB-Agar盘子和孵化16 h在37°C在黑暗中。集落形成单位(CFU)数和细菌生长的抑制率是由以下公式计算:生长抑制率(%)= (CFU对照组−治疗组的CFU) / CFU的对照组100%。

所有的实验都随机分为4组。

A组:虚假的控制。细菌在控制被hypocrellin B和光线照射治疗。

B组:Hypocrellin B单独治疗。组的细菌被hypocrellin B没有光照射治疗。

C组:光照射。组的细菌被LED灯辐照没有hypocrellin B治疗。

D组:激活Hypocrellin B。这个组的细菌细胞被各种浓度的孵化hypocrellin B和LED灯辐照的能量密度的12 J /厘米²。

2.3。膜透性测量

细菌细胞孵化了hypocrellin B (25μ米)60分钟在黑暗中在37°C,然后被暴露在蓝光与光剂量的12 J /厘米²。光照射后,细菌细胞被立即收获和孵化propidium碘(π,10µg /毫升)在黑暗中为20分钟。膜透性的染色观察细胞立即使用共焦激光扫描显微镜(样品形貌)和图像使用电荷耦合器件彩色相机记录。在此同时,细菌细胞也使用流式细胞术分析(SE,正欲)激发设置在488海里。

2.4。细菌形态

hypocrellin B的光激活后,细菌细胞就固定的,后缀,脱水,嵌入在环氧树脂812(电子显微镜科学、华盛顿堡、PA)和被切成超薄部分(100海里)染色在醋酸双氧铀及柠檬酸铅。用电子显微镜观察超微结构的变化(h - 600;日立、日本)。

2.5。ROS测量

hypocrellin B光激化后,细菌细胞立即收获和孵化2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA 10μM, Beyotime,江苏,中国)为20分钟37°C在黑暗中,然后用流式细胞术分析(SE,正欲)激发设置在488海里。

2.6。统计分析

所有的数据表示为平均数±标准差是Windows使用SPSS 18.0统计分析。组之间的差异进行了分析使用单向方差分析(方差分析)。一个值< 0.05被认为是显著的差异。

3所示。结果

3.1。集落形成单位分析

集落形成单位大肠杆菌进行治疗后的激活hypocrellin B和生长抑制率大肠杆菌细胞进行了计算。图1表现出显著的生长抑制率大肠杆菌细胞被激活在hypocrellin hypocrellin B浓度的方式()。没有显著差异显示在细胞仅靠hypocrellin单独或光线照射治疗()。

3.2。膜透性

的膜透性大肠杆菌观察细胞使用样品形貌与PI染色流式细胞术。流式细胞术显示,阳性细胞染色率π骗局组3.71%,仅在hypocrellin B治疗组2.24%,光照射组的8.04%。积极的细胞率显著增加了69.24%在光驱动hypocrellin治疗组(图2)。样品形貌也观察到更多的红色荧光中被发现大肠杆菌细胞被激活的hypocrellin B比控制细胞包括虚假的控制,hypocrellin单独治疗,单独和光线照射。之间无显著差异被发现虚假的控制,hypocrellin治疗,和光线照射(图3)。

3.3。细菌形态

使用TEM观察细菌的超微结构变化。完整的和光滑的细胞中观察到虚假的控制,hypocrellin B治疗,和光线照射(数字4(一),4 (b),4 (c)),而部分细胞质泄漏被发现在细胞被激活hypocrellin B(图4 (d))。

3.4。活性氧

活性氧(ROS)水平大肠杆菌细胞用流式细胞术分析DCFH-DA染色。流式细胞仪显示的荧光光谱变化曲线向右hypocrellin B光激活后,表明细胞内ROS水平的显著增加大肠杆菌(图5)。

4所示。讨论

传统中药历史悠久,民间医药治疗传染病。越来越多的证据表明,许多活性化合物与中国传统草药能够产生抗感染和抗炎作用13,14]。Hypocrellin B作为传统中药的活性成分了以bambuase已被证实对病原微生物有重要活动和恶性肿瘤5,6,10,11,15- - - - - -17]。我们最近的研究表明,hypocrellin B作为天然光敏剂的革兰氏阳性细菌可能造成重大的伤害金黄色葡萄球菌时细胞以及肿瘤细胞激活蓝光(5,6,10]。我们的初步研究也发现大肠杆菌细胞抗光动力作用hypocrellin B相比金黄色葡萄球菌。因此,在目前的研究中,我们选择更高浓度的hypocrellin B (0、5、10、15、20、25μ米)和更高的能量密度的蓝光(12 J /厘米²)调查的影响光驱动hypocrellin B大肠杆菌细胞。集落形成单位化验显示hypocrellin B明显光动力抑制大肠杆菌细胞。

我们以前的研究报道,蓝光可以激活hypocrellin B增加肿瘤细胞的细胞内ROS水平和革兰氏阳性细菌菌株金黄色葡萄球菌(5,6,10]。在目前的研究与DCFH-DA染色流式细胞术还显示ROS增加革兰氏阴性细菌菌株大肠杆菌细胞。我们的TEM观察到明显的细胞质泄漏大肠杆菌治疗后细胞激活hypocrellin B .流式细胞术与PI染色表明,阳性细胞染色率π显著增加69.24%在光驱动hypocrellin治疗组和共焦激光扫描显微镜也发现了红色荧光细胞激活后的πhypocrellin B,证明光活性hypocrellin B处理的膜透性增加大肠杆菌细胞。结果与我们过去的报告一致金黄色葡萄球菌光动力治疗hypocrellin B (10]。这些发现表明,非特异性损伤产生的ROS hypocrellin B的光敏作用细菌细胞损伤的一个重要原因是细菌的形态结构和一般的抑制。

总之,我们的研究发现,革兰氏阴性菌株大肠杆菌细胞耐光动力治疗hypocrellin B比革兰氏阳性细菌,但激活hypocrellin B也可以增加ROS水平大肠杆菌细胞造成损害的细菌革兰氏阴性细菌的结构和抑制增长而hypocrellin B的浓度更高和更高的能量密度的光照射在光动力治疗。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的平格兰特从香港RGC(476912),香港中文大学的直接拨款(4053026),和深圳的创新和技术基金(CXZZ20120619150627260)。作者表达自己衷心感谢Eric双关语先生,吴我博士Liangku Wong先生和柳庙对他们有用的帮助。