文摘

结直肠癌是第三个最常见的诊断癌症。在治疗探索,光动力疗法(PDT)是一种治疗感兴趣的,因为它带来了理想的优点如癌症细胞的亲和力。本研究旨在确定之间的关系定位的磺化酞菁锌( 光敏剂(PS)及其相关的细胞死亡通路在体外在结直肠癌细胞系(DLD-1和CaCo-2)。可见观察形态学变化PDT治疗细胞24小时后。活性氧(ROS)检测和可视化1 h PDT之后。 在溶酶体和部分主要是局部的线粒体。FITC染色膜联蛋白V明显下降的百分比可行的PDT DLD-1和CaCo-2细胞24小时后,凋亡细胞数量的增加。此外,有一个显著增加组织蛋白酶D和细胞色素C在1和24小时。总之, 显示的能力在PDT治疗细胞诱导凋亡细胞死亡的特征。

1。介绍

癌症被定义为一组疾病的细胞凋亡和增殖之间的不平衡率。异常细胞的快速增殖可能是由于各种因素从基因到外部因素,如化学物质或饮食(1]。结直肠癌是在一流癌症,全世界有很高的死亡率(1]。它发生的遗传和表观遗传变化正常的腺上皮细胞为浸润性癌(2]。结直肠癌的治疗仍然是一个挑战,由于高转移性疾病的发病率和复发率(3),以及非癌变细胞毒性化疗药物引起的。结肠切除术,化疗和辐射被认为是主要的治疗方法。然而,有人担心这些疗法通常导致贫困的生活质量,降低总体生存率,抵抗治疗(4,5]。因此,有必要开发其他的治疗策略,可能提高生活的质量,最终提高存活率。

光动力疗法(PDT)一直在调查中作为替代治疗方式辅助化疗或放化疗。PDT利用三部分组成,即光波长介于650和750海里,光敏药物(称为光敏剂、PS)细胞内定位的能力,和分子氧,使得形态有效6]。相对形态比手术,放疗,化疗,因为它是一种微创治疗。除了是一种微创治疗,一个好的PS应具备低暗(不活跃)和行政毒性(7]。此外,编制PS具有高度的亲和力癌细胞由于高含量的低密度脂蛋白(LDL)受体在癌症细胞增强吸收PS (8- - - - - -10]。PDT是一个烧蚀能量需要过程,利用天然或合成光敏结构,并能够吸收能量以光的形式。Castano et al。7)建议理想的PS红近红外光谱吸收光线,更短的波长有较低的组织穿透能力(11,12]。

尽管PDT被发现在一个世纪以前,它已经成为一个感兴趣的领域与进步的发展和进步,尤其是对PSs的发展。光动力反应发生在PS被激活从光的吸收能量的形式(在一个特定的波长)光子,从而产生活性氧(ROS)从而导致光动力反应(13]。光与PS交互的最重要因素之一,决定治疗的疗效[14]。光动力反应可以通过两个已知发生光化学通路。第一个途径,通常称为I型,产生自由基和活性氧通过PS三重态之间的电子转移和周围分子。II型反应产生单线态氧 通过从PS基态能量转移到周围的氧气分子(7,15]。两种途径可以同时发生,虽然比可能取决于PS的类型,结合底物的亲和力,和氧气和基质浓度。然而,II型反应被认为是最常见的途径负责细胞死亡(14,16- - - - - -18]。

氧化应激引起的PDT导致膜脂质过氧化作用或断裂和DNA损伤,可能导致细胞凋亡或坏死(19]。细胞凋亡发生通过一系列细胞内和细胞外的生化环境。溶酶体和线粒体膜性细胞器至关重要,在细胞死亡动力学也发挥了作用。PSs目标线粒体被认为是更有效的,而不是那些在其他细胞器定位(20.,21相信他们可以直接诱导细胞凋亡。然而,针对PSs的溶酶体也被成为优秀的候选人(22,23]。溶酶体酸性环境和主机水解酶有可能降低蛋白质和整个单元在泄漏(24]。在研究溶酶体水解酶是属于组织蛋白酶D天门冬氨酰蛋白酶(25]。除了它的催化作用,组织蛋白酶D还参与细胞凋亡。当细胞毒性因素引发的,这取决于环境,它能诱导细胞凋亡或抑制(26,27]。溶酶体膜的透化作用可以通过氧化应激激活通常会导致线粒体外膜不稳定和半胱天冬酶激活通过溢出的酸性内容或催化酶(28,29日]。随后,这可能会导致泄漏从线粒体细胞色素C到胞质,从而激活还存在。

细胞吸收的PS是为了药物基本因素是有效的,其细胞内定位网站可以帮助理解细胞死亡的分子单线态氧的模式可能主要由PDT首选的细胞器。锌酞菁(ZnPcs)理想的PDT应用品质据说是可见的红色区域的密集的光吸收和高单线态和三线态生产(30.]。巴尔等人使用铝制磺化酞菁(AlSPc)治疗dimethylhydrazine-induced Wistar鼠结肠癌。他们报道的重要根除结肠粘膜肿瘤坏死和进一步表明,它可能是有用的作为一个单独的辅助治疗,因为他们怀疑PDT等深层肿瘤有宽宏大量的影响结肠癌在活的有机体内(31日]。使用bacteriopherophorbide Woodhams等人进行了一项研究(Tookad)建立光动力疗法(PDT)结肠粘膜的连帽李斯特老鼠32]。他们报道短药物光区间作为一个优势;然而,治疗诱导坏死伴有炎症反应PDT[三天后32]。

在这项研究中,我们试图确定之间的相关性磺化酞菁锌的本地化网站( )在结直肠癌细胞(DLD-1和CaCo-2), PDT后诱导的细胞死亡方式。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

这项研究是学术道德委员会批准的健康科学学院,在约翰内斯堡大学伦理审批AEC81/2009数量。使用商业上获得的结直肠癌细胞(写明ATCC HTB-37 CaCo-2和DLD-1写明ATCC ccl - 221)。CaCo-2细胞培养在杜尔贝科修改鹰的媒体(DMEM、Sigma-Aldrich D6429)为1.2 g / L碳酸钠,补充10%胎牛血清(Gibco的边后卫,306.00301),不必要的氨基酸(NEAA Gibco, 11140), 0.5毫米丙酮酸钠(Gibco, 11360), 2.5毫米谷酰胺(Gibco, 25030),抗生素(penicillin-streptomycin Gibco, 15140), 1%和1%抗真菌(Gibco两性霉素b, 104813)。DLD-1细胞培养在杜尔贝科的修改鹰的媒体和火腿的营养混合物F-12 (DMEM / F12 Sigma-Aldrich D6421),至于CaCo-2补充细胞。文化有限公司保持在5%2和85%的湿度在37°C。一旦细胞融合达到80 - 90%,他们收获和播种密度 3毫升媒体进入无菌培养皿中,直径3.4厘米。细胞被允许附加在一夜之间。

2.2。PDT实验

的ZnPcS混合用于这项研究包含各种磺基组已报告提高溶解度(33]。ZnPcS光化学、光物理性质混合在磷酸缓冲盐(PBS)测定的化学,南非罗德斯大学。 荧光量子产率 的0.16;三重态量子产率 的0.53;单线态氧的量子产率 是0.45,三重态寿命 2.95μ年代(33]。细胞被分为三个对照组:未经处理的细胞,也就是说,细胞接受辐照和PS,接收激光辐照(5 J /厘米2接收独自PS (ZnPcS)和细胞混合20)的浓度μm .测试组PS和辐照(PDT)。细胞没有收到激光辐照是虚假的辐照。细胞连接后,他们在汉克的平衡盐溶液冲洗(哈佛商学院、表达载体、10 - 543 f)和新媒体被添加到卷的前1毫升 或照射。细胞被辐照在黑暗中从上面在一个开放的培养皿,使用连续二极管激光器发光的波长680 nm;细胞被辐照的影响5 J /厘米2,因为它是确定最佳剂量反应研究(34]。结合20μ米 的影响5 J /厘米2使用基于与细胞凋亡的形态学变化以及损失的细胞生存能力超出40%,讨论Manoto et al。34]。激光辐照参数列在下表中1。生物反应进行评估后进一步孵化1或24小时。

表1
激光辐照参数。
2.3。细胞形态

PS或PDT对细胞形态的影响决定使用一个倒置光学显微镜(Wirsam,奥林巴斯CKX41)。一旦数字图像记录,使用1毫升/ 25厘米细胞使胰蛋白酶化2TrypLE表达(表达载体,12605 - 028)和resuspended哈佛商学院(除非另有说明)进行进一步化验。

2.4。活性氧(ROS)检测

氧化应激引起的 由激光激活时显示定性与carboxy-H由细胞荧光染色法2DCFDA活性氧检测设备(表达载体,图像,I36007)。细胞培养在封面的过失与温暖的哈佛商学院和洗满25岁μM carboxy-H2DCFDA工作方案和孵化为30分钟37°C在黑暗中。此后,细胞被洗了三次与哈佛商学院和核和0.1毫克/毫升的DAPI复染色(4′6-diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich, D9564) 1分钟,洗净。ROS积极控制准备根据协议规定的制造商。简单地说,ROS在CaCo-2诱导细胞通过增加100μ米的叔丁基氢过氧化物(TBHP)持续时间1 h在37°C。细胞收到无论是PDT治疗,TBHP,激光辐照作为消极的控制。细胞被染色后活性氧检测1 h PDT通过遵循相同的程序如上所述。荧光是可视化使用卡尔蔡司Axio观察者Z1荧光显微镜。由carboxy-H生产氧化2DCFDA被使用 和DAPI 过滤器。

2.5。细胞内定位

荧光成像技术被用来确定细胞内定位 。简单地说,细胞培养在无菌盖放置在3.4厘米直径文化菜肴。细胞被冲洗与温暖的哈佛商学院在孵化1μ米 在媒体补充1 h。本地化的网站 确定使用荧光标记细胞内的细胞器。线粒体,细胞被沾染了50 nM MitoTracker绿色调频(表达载体,M7514)和75 nM LysoTracker绿色DND-26(表达载体,L7526)是用于溶酶体。细胞培养在黑暗中15分钟。核与DAPI复染色。荧光是可视化使用卡尔蔡司Axio观察者Z1荧光显微镜(34]。

2.6。溶酶体组织蛋白酶D

溶酶体蛋白酶组织蛋白酶D测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Biocombiotech, Cusabio生物技术,CSB-E09221h)。标准,空白(媒体),或浮在表面的实验细胞被添加到各自的威尔斯100年第四卷μl .板培养2 h在37°C。井是吸气和100年μL biotin-antibodyworking的解决方案是添加到每个和孵化1 h在37°C。每个好吸气和洗洗涤缓冲三次。辣根过氧化物(合)抗生物素蛋白被添加到每个工作的解决方案,和板是孵化1 h 37°C。板是吸气,洗了三次,然后tetramethylbenzidine(三甲)基质添加和孵化为30分钟37°C。停止的解决方案是添加和板读在450 nm吸光度使用维克多3 multilabel标(优秀)。

2.7。胞质细胞色素C

胞质人类细胞色素C以ELISA (Biocombiotech、eBioscience BMS263 / BMS263TEN)。细胞溶解产物准备根据制造商的协议。短暂,细胞被离心机在137 g×15分钟,洗冷PBS。细胞被resuspended裂解缓冲浓度为1.5×106每1毫升,在室温下孵化1 h和温柔颤抖(10 rpm)使用一个轨道振动器(Labotech, Heidolph Polymax 1040)。细胞被离心机在200 g×15分钟。上层清液稀释50倍在分析缓冲区。井用400μL洗涤缓冲开始之前。样品和标准被添加到各自的井和biotin-conjugate补充道。板是在室温下孵化2 h,然后清洗。Streptavidin-HRP添加在室温下和孵化1 h。此后,板的清洗和三甲基质添加了大约10分钟,反应停止。吸光度是阅读450海里使用维克多[3]multilabel标(优秀)。

2.8。FITC膜联蛋白V

确定的细胞死亡(坏死或凋亡)模式,FITC膜联蛋白V使用染色和荧光读取使用流式细胞分析仪(FACSAria)。FITC膜联蛋白V结合使用propidium碘(PI)的重要污点坏死细胞。细胞被洗涤分离染色细胞在500年与冷PBS和resuspended两倍μL 1 x化验绑定缓冲。一卷100μL是转移到5毫升文化管和孵化5μL (FITC膜联蛋白V和另一个5μL(π。涡流和孵化的细胞混合5分钟在冰上远离直射光。400μL 1 x绑定缓冲被添加到所有的样品和分析FACSAria流式细胞分析仪通过阅读000事件。

2.9。统计分析

每个实验重复了四次( )。生化检测,都是在重复和平均使用的结果。统计分析使用SigmaPlot软件8.0版本(Systat软件)和均值,标准差,标准误差,显著变化计算。学生 以及和单向方差分析进行确定统计区别对照组和实验组。统计差异图所示(*) (* *) ,(* * *) 和色散酒吧代表标准误差。

3所示。结果与讨论

3.1。细胞形态

控制细胞没有任何形态的变化在1和(图24小时的潜伏期1)。1 h孵化后,PDT治疗CaCo-2细胞形态学改变而出现控制细胞。PDT治疗细胞出现不均匀,膜的完整性丧失,尽管仍然完好无损;这不是观察DLD-1细胞系。此外,24 h后发现明显变化,细胞出现固缩的,完整的膜,凝聚核。一些细胞分离培养板和失去了原始的形态学特征相比孵化1 h和控制细胞。


图1
形态学DLD-1和CaCo-2细胞后1或PDT后24小时。PDT 1 h后孵化后,没有明显可见DLD-1和CaCo-2细胞的差异,但是,在某种程度上,细胞显示membranal不规则。24小时孵化后,PDT细胞出现萎缩和圆形和分离。

我们以前表明DLD-1结直肠癌细胞敏感 孤独和PDT使用相同的PS (34]。DLD-1和CaCo-2控制细胞的形态学特征(未经处理的;5 J /厘米2或 )保持不变。然而,细胞形态的变化,接受了PDT治疗与凋亡的功能在细胞培养皿表面分离,细胞萎缩,和一个完整的膜(34]。尽管如此,基于这些形态发现,它不是决定性的,绝对细胞发生凋亡。

3.2。活性氧(ROS)检测

羟基自由基等活性氧( 哦)和过氧化氢(H2O2)通常生成少量的细胞生物由于有氧新陈代谢34]。然而,ROS浓度的增加引起的氧化应激导致细胞损伤,和ROS感应也涉及细胞凋亡35,36]。ROS细胞系中检测到,与PDT治疗不同的细胞质中的绿色荧光(图所示2)。PDT治疗细胞显示ROS荧光强度相似的积极控制,从而证明,PDT后光致氧化。在此基础上观察,我们可以预期,最终细胞损伤将遵循已知活性氧杀死细胞的氧化脂质膜和生物分子37,38]。这是与时间有关的损失所示的细胞生存能力PDT治疗细胞导致细胞死亡(40%以上34]。


图2
ROS生产定性与carboxy-H被染色的细胞2DCFDA显示为绿色荧光如果出现如箭头所指出的那样。核与DAPI复染色(蓝色)。
3.3。细胞内定位

众所周知,PS的本地化网站的重要性,因为它是表明,初始伤害会发生(20.,39]。当细胞被可视化使用荧光显微镜, 主要是局部溶酶体和线粒体(图在较小程度上3)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
细胞内定位 PS DLD-1和CaCo-2细胞。PS局部溶酶体在两种细胞系中被合并红色和绿色颜色如箭头所指出的那样。在线粒体中,有一个不确定的定位模式。然而,橙色意味着线粒体有PS,如箭头指出的那样。核与DAPI染色(蓝色)。

罗·凯塞尔和从他们的研究推断,PS的亚细胞定位是在PDT细胞死亡机制的主要决定因素。自PS主要用于本研究定位在溶酶体和线粒体中最小,这是暗示 化学性质或收费这一目标线粒体和溶酶体(40]。罗·凯塞尔进行的一项研究,使用了两个基于锌酞菁PSs在人类宫颈鳞状细胞癌(海拉)和小鼠结肠腺癌(CT26)细胞;一个是阳离子和阴离子(41]。阳离子卟啉PS是更有效的比阴离子PS前局部溶酶体和线粒体。他们在浓度进一步提高疗效报道2到10μ阳离子PS和10米,50μ阴离子的M PS,激活的影响10 J /厘米2。然而,CT26细胞初始浓度不够敏感的5μM阳离子PS与20激活J /厘米2,虽然海拉细胞敏感41]。因为我们的结果配合Mroz et al。结果,它可能表明结肠腺癌的PDT使用酞菁可能需要为了呈现高剂量治疗有益,只要PS显著低暗毒性。

3.4。溶酶体组织蛋白酶D

在这两个时间点,组织蛋白酶D在DLD-1和CaCo-2仅接受照射的细胞(5 J /厘米2)没有导致重大改变与未经处理的控制细胞相比,表2。1 h孵化后,组织蛋白酶D释放在DLD-1显著增加细胞孵化 独自一人( )或那些收到PDT ( )相比,未经处理的控制细胞。显著变化也指出CaCo-2细胞收到PDT控制相比,未经处理或辐照(5 J /厘米2)( )和那些收到 独自一人( 1 h孵化后)。比较组织蛋白酶D在PDT治疗DLD-1和CaCo-2细胞1 h孵化显示显著增加CaCo-2细胞( )。

表2
组织蛋白酶D和胞质细胞色素C测定后1和PDT后24小时孵化。显著差异表所示表示对比PDT治疗后细胞和各自的未经处理的控制细胞孵育1 - 24小时( ; , )。组织蛋白酶D在DLD-1显著增加( )和CaCo-2 ( )后24 h后孵化相比1 h孵化。在这两种细胞系,细胞色素C是显著增加24 h后孵化与1 h孵化( )。

24小时后,DLD-1和CaCo-2 PDT治疗细胞有显著增加组织蛋白酶D版本( )相比,所有控制细胞(未经处理的5 J /厘米2和 )。此外,24小时后, 单独诱导显著增加组织蛋白酶D在CaCo-2仅接受照射的细胞相比,细胞( )。组织蛋白酶D在PDT治疗DLD-1细胞显著增加24 h后孵化1 h孵化(相比 )。此外,有显著区别DLD-1和CaCo-2 PDT治疗细胞后24 h孵化( )。

假设高浓度的活性氧在溶酶体形成,增加大量的H2O2可以扩散到溶酶体和反应和金属蛋白(含铁蛋白质)intralysosomal退化由于酸性博士铁就会减少和羟基自由基形成,促进脂质过氧化,引起溶酶体内容物泄漏(42]。因此,可能是细胞死亡机制诱导DLD-1和CaCo-2细胞从溶酶体PDT主要可以启动后。Mroz等人报道,溶酶体膜不稳定是细胞凋亡的早期事件与线粒体膜不稳定(43]。然而,即使photodamage启动溶酶体,线粒体通路负责细胞死亡作为投标的激活是由于溶酶体蛋白酶释放Kurz和他的同事们假设,在他们的研究中,还使用了酞菁PS,局部在溶酶体44]。我们的发现符合Kurz和同事的发现44]。

基于本地化的模式 ,我们认为有一个蛋白水解释放溶酶体组织蛋白酶D天冬氨酸,这是与细胞死亡(45]。氧化应激可以直接破坏溶酶体膜。被假定有限释放溶酶体内容可以引发细胞凋亡或apoptosis-like细胞死亡与广义膜破裂,可能会导致坏死(46,47]。在我们的研究中我们发现有显著释放组织蛋白酶D在PDT治疗细胞系特别是在24小时孵化。然而, 独自也引起重大泄漏后的天冬氨酸的酶1 h孵化DLD-1 CaCo-2细胞中细胞和24小时假辐照控制细胞相比,虽然在一定程度上。这可能是由于长时间的孵化与PS这可能最终导致渗透压力和可以触发膜透化作用[37]。

3.5。胞质细胞色素C

搬迁的线粒体细胞色素C细胞溶质被ELISA定量确定为了研究线粒体膜不稳定,因为它是细胞凋亡的一个特点。DLD-1细胞暴露于 独自被证明是容易光敏剂的浓度20μ米,有一个显著增加细胞色素C相比,未经处理的控制细胞1 h孵化后( ),表2。有显著搬迁的细胞色素C细胞溶质的PDT治疗DLD-1 CaCo-2细胞1和24小时孵化( 所有对照组相比)。比较的孵化时间显示有显著增加( )在细胞色素C在PDT治疗细胞(DLD-1和CaCo-2)在24 h相比1 h。当DLD-1和CaCo-2细胞孵化 仅1 h孵化后比较,有显著性差异( 细胞色素C版本中)。然而,不同的是没有看到24 h后孵化。

这些结果与组织蛋白酶D在协议的结果,表示,线粒体膜被溶酶体酶不稳定。这是支持的想法提出Brunk Svensson,溶酶体蛋白酶可以造成直接损害损害线粒体膜(48]。细胞色素C的释放被认为是一个重要的事件在PDT诱导细胞凋亡产生的ROS损伤定位的网站(49,50]。

3.6。FITC膜联蛋白V

有显著增加凋亡DLD-1细胞的数量而可行的人口1 h PDT ( ),图4(一)。孵化DLD-1细胞后24 h PDT也显示凋亡细胞显著增加而可行的人口和坏死( )。同样,显著增加也看到凋亡相比人口控制细胞( )。有显著下降的百分比可行的PDT治疗CaCo-2细胞1 h孵化后相比,相同的细胞群在控制细胞( ),图4 (b)。PDT治疗CaCo-2细胞凋亡数量时可行和坏死的人口相比,在同一组,有显著增加细胞凋亡在1和PDT孵化后24小时( )。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
FITC染色膜联蛋白V用于细胞死亡模式的评估DLD-1 (a)和CaCo-2 (b)细胞。显著差异比未经处理的细胞显示为* * * 。24 h后,凋亡细胞的比例显著增加人口相比1 h孵化PDT治疗DLD-1细胞(a)。PDT治疗CaCo-2细胞(b)凋亡人口比例显著增高1和24小时孵化后各自可行或坏死细胞相比人口比例( )。

独自孵化与PS似乎是一个关键因素对细胞的毒性,延长潜伏期可能导致不必要的毒性,呈现剂量测定法治疗结直肠癌的一个基本组成部分。这是证明的FITC膜联蛋白V结果显示 活动的形式是无效的在诱导坏死或凋亡细胞死亡有相当数量的死细胞类似于未经处理的控制。激活 可能导致细胞死亡和证实,细胞死亡后PDT的主流模式是细胞凋亡。我们的研究结果表明,凋亡细胞死亡通路是由溶酶体,提示延迟线粒体细胞色素C泄漏所引起的蛋白水解酶从溶酶体组织蛋白酶D以及低pH值以应对PDT。此外,它是可能的,可以直接稳定线粒体膜ROS,形成立即本地化网站和溶酶体的酸性环境隔间。此外,这一事实 激活能引起溶酶体破裂,从而释放组织蛋白酶D,呈现 一个有趣的和有效的PS因为它可以定位在两个重要的细胞器。工作由Oleinick集团还确认,溶酶体目标酞菁PSs (Pc181)是令人惊讶的有效与线粒体靶向PSs (39]。

目前尚不清楚这些结果的亚细胞的细胞器可以负责细胞死亡开始,所以需要进行更进一步的研究以确定哪些亚细胞的细胞器负责细胞死亡信号的传播。

4所示。结论

尽管使用相同的PS在两个不同的结直肠癌细胞,这些细胞线的反应不同。很明显,CaCo-2细胞更容易比DLD-1 PDT细胞。这可以解释为不同癌症的阶段,这些细胞是在杜克大学CaCo-2细胞的B阶段(分化良好、少tumourigenic和侵入性),而DLD-1细胞是杜克大学的C阶段(转移性,涉及到一个或三个区域淋巴结)。因此癌症的阶段时应考虑进行这样的实验。我们假设 能够诱导凋亡细胞死亡是由溶酶体光致氧化。PS诱导细胞死亡的机制需要进一步研究以了解它如何触发细胞死亡,从起始点触发细胞死亡以及如何应对治疗各种癌症的阶段。

信息披露

本文提交的材料国际期刊的Photoenergy已发表和被认为是在其他地方发表。

利益冲突

作者表明,没有利益冲突有关的出版。

确认

作者致以感谢国家研究基金会(NRF),科学与工业研究理事会(CSIR)南非约翰内斯堡大学研究委员会(URC)的财政支持,以及国家激光中心(缴送工作),南非,激光的安装和维护。我们应感谢教授Tebello Nyokong的话来说(南非罗德斯大学化学系)合成和提供 。DLD-1细胞被Clem博士请捐赠一分钱(南非威特沃特斯兰德大学医学系的)。