文摘

光动力疗法(PDT)对癌症治疗涉及病理学吸收的敏化光致辐照产生细胞毒性活性氧。敏化的纳米颗粒作为载体的使用是一个很有前景的方法,由于其体积小,独特的物理化学性质,和简单的/不同的功能化。在当前的工作中,我们报告在活的有机体内PDT疗效评估这些nanoconstructs在人类乳腺癌的小鼠模型,后一个(一次性)纳米颗粒以及光致辐照剂量。Palladium-porphyrin (PdTPP)接种瘤内通过注入水悬浮液的自由PdTPP或MSN-conjugated PdTPP (MSN-PdTPP)剂量的50μg。老鼠被暴露在一个光致辐照会话总能量为80 J。一次性PDT治疗一个月后,明显能减少肿瘤的生长观察MSN-Pd比PdTPP人群对待动物。电子显微镜的肿瘤标本在不同时间点显示优秀MSN-PdTPP收获时被癌细胞吸收之免疫分析表明显著增加凋亡反应MSN-PdTPP对待动物相对于PdTPP控制。总的来说,这些发现表明,相当多的改进PDT功效可以很容易地实现通过使用nanoparticle-based敏化。

1。介绍

光动力疗法(PDT)已经演变近年来治疗的医疗条件,包括湿黄斑变性、皮肤疾病(如痤疮、酒渣鼻、牛皮癣),和某些类型的癌症包括肺癌和食管癌(1- - - - - -6]。它本质上是一种焦疗法比外科微创方法,比全身化疗副作用较少。在今天使用的最普遍的形式的PDT是基于细胞毒性的photogeneration,活性氧在肿瘤组织通过的光刺激外生photosensitizing代理(PSs)。光敏剂,在地面(单线态)状态,吸收一个光子,促进PS短暂的兴奋单重态。因为激动的单重态是如此短暂,PS几乎没有机会能源或电子转移到附近的其他分子,而是经历系统穿越离开的兴奋,寿命更长,三重态。随后PS衰变回到其初始地面(单线态)状态,它将能量转移到附近的地面(三联体)状态分子氧,提高后者第一激发单重态(7,8]。最敏化在临床使用已经优化/选择高,激发单重态的量子效率和递归生成单线态氧的大量氧气,而不是接受热衰变(通过内部转换)或荧光发射9,10]。

目前使用最广泛的PSs卟啉。卟啉类化合物的光致辐照选择性波长的可见光(450 - 700 nm)导致氧气分子的光化学转换(³O₂)为单线态氧(¹O₂),一个特别有效的细胞毒性剂导致细胞凋亡或坏死(11]。在传统的癌症,PDT光敏剂药物管理病人,然后被动地积累在肿瘤组织中,尽管一些PSs内在倾向针对血管的内皮细胞。参与组织然后选择性地激活光敏剂的光照射的诱导细胞死亡。敏化经过多年的发展,最大限度地发挥其效能,同时减少他们的全身毒性。不幸的是,到目前为止,绝大多数的敏化仍然具有多重限制,包括高疏水性,重大self-aggregation,和每个限制肿瘤选择性差,PDT效率和临床效益(12,13]。因此,开发了大量的努力化合物改善“产能”。

提高PS交付的一个方法是纳米颗粒- (NP)介导的运输。相比传统的无屏蔽的交付,NP-assisted转让PSs的优势提供一个exoplatform共轭聚合物的PS循环半衰期延长,从而提高PS积累漏水的脉管系统的肿瘤通过增强渗透性和保留效应(EPR) (14- - - - - -19]。封装的PSs NPs还绕过了PS self-aggregation,使高密度PS交付。NP PSs还允许转让的有效,吸光生色团在靠近PSs,以便大大促进PSs的能量转移,从而显著提高整体光动力效率(20.- - - - - -26]。一种纳米粒子特别是最近获得了相当大的兴趣在癌症化疗和使用PDT:介孔二氧化硅纳米粒子(msn) [27- - - - - -32]。

msn是生物相容性、容易内源性和容易修改后合成共轭的目标在他们的外表面(半个33- - - - - -39]。msn的独特的拓扑结构也为他们提供了三个不同的领域,可以独立功能化:硅框架,六角形纳米通道/毛孔,和纳米颗粒的外层表面。因此,msn尤其适合的任务将联合诊断/治疗的基本功能(即。,theranostic) platform in a single particle, with (1) separate domains for contrast agents that enable traceable imaging of PS targeting, (2) PS payloads for therapeutic intervention, and (3) biomolecular ligands for highly targeted PS delivery.

以前,我们的开发和报道在体外携带荧光的顺序描述的MSN造影剂ATTO647N嵌入到MSN的硅跟踪框架,cRGDyK肽共轭到MSN的外观为目标整合素的表达,光敏剂Pd-porphyrin (PdTPP)共价连接在MSN防护纳米通道的光动力治疗(40- - - - - -42]。在此我们报告我们的结果在活的有机体内PDT MSNs-PdTPP使用小鼠模型的研究对人类乳腺癌和一次性光激励方案1)。

2。方法

2.1。材料

Tetraethoxysilane (teo) cetyltrimethylammonium溴铵(CTAB)、乙醇、氢氧化铵(30%)、N, N-dimethylformamide (DMF)和3-Aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)购买直接从穿越。Di (N-succinimidyl)碳酸盐(DSC)和N, N-diisopropylethylamine得到从西格玛化工有限公司

2.2。msn的准备

张志贤合成msn的溶胶-凝胶法co-condensation如下。首先,CTAB溶解在NH (0.58 g)₄哦(0.51,300毫升)在40°C。搅拌1小时后,稀释teo 5毫升乙醇(0.2)补充说,解决方案是激起了一个额外的4 h。然后,高浓度的teo(1.0 5.0毫升乙醇)剧烈搅拌下添加一个额外的小时。解决方案是在黑暗中在40°C 20 h。收集的样本随后离心法在12000 rpm 20分钟,洗,redispersing固体反复用去离子水和乙醇。表面活性剂模板在0.3 g的NH被提取₄没有₃和50毫升乙醇溶液在65°C下回流12 h。

2.3。制备MSN-PdTPP

随着表面活性剂模板被删除收益率msn, 50毫克PdTPP和150毫克di (N-succinimidyl)与100年碳酸盐(DSC)涨跌互现μ在N, L N, N-diisopropylethylamine (99.5%) N-dimethylformamide (DMF)(20毫升)解决方案2 h。与200年激活PdTPP当时的反应μL了1 h和纯化PD-10列(Amersham生物科学)。msn PdTPP装载的数量是由测量吸光度在400 nm, PdTPP索瑞特乐队。msn的大量PdTPP w.t.从而确定为5.5%。

2.4。描述

MSN的形态样品的特点是通过TEM(日立h - 7650),在加速电压80 kV操作。表面积和孔隙大小测定N₂adsorption-desorption等温线测量在77 K尽快测微的2010。样本可以排除在托和120°C约6小时之前进行吸附实验。孔隙大小分布曲线得到的分析解吸等温线的一部分使用BJH (Barrett-Joyner-Halenda)方法。稳态吸收光谱是DU800紫外光谱仪(贝克曼)。莫尔文Zetasizer Nano是用来测量电动电势的MSN样品在溶液pH值7.4。

2.5。单线态氧的测量

我们使用DPBF(8毫米)乙腈溶液测量单氧代。2毫升DPBF的解决方案是添加到PdTPP彻底和MSN-PdTPP样本和混合。混合物是通过激光辐照在532纳米操作mW厘米⁻²。DPBF的吸收光谱检测到400海里每20秒。

2.6。细胞培养

人类乳腺癌细胞mda - mb - 231 rpmi - 1640年维持介质(美国纽约Gibco-BRL) heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫)(美国犹他州Hyclone)和补充了青霉素100单位/毫升和100年μg / mL链霉素在37°C公司为5%₂。

2.7。在体外PDT

共有5000名乳腺癌mda - mb - 231细胞被播种在96孔和孵化24 h。细胞治疗10、25和50μg / mL PdTPP或在无血清培养基MSN-PdTPP 1 h在黑暗的37°C,分别。细胞被WST-1估计可行性分析。WST-1化验,四唑盐WST-1 {4 - [3 - (4-lodophenyl) 2 (4-nitrophenyl) 2 h-5-tetrazolio] 1, 3-benzene disulfonate}在活细胞中被线粒体脱氢酶裂解产生甲瓒。治疗后1 h,上层的删除和添加到100μ信用证无血清培养基和10μ信用证以及细胞增殖试剂WST-1(罗氏)。孵化后WST-1 4 h,盘子都摇动了1分钟,测量光的吸光度在450 nm使用ELISA读者(M200无限,TECAN)。运行6个标本为每个浓度,每个实验被重复三次。PDT,细胞使用波长532纳米的激光辐照操作mW厘米⁻²能量的1.2、2.5或5 J的PdTPP或MSN-PdTPP治疗后血清培养基的1 h在37°C。

2.8。肿瘤异种移植动物模型

人类乳腺癌细胞mda - mb - 231 (细胞/ 200μL无菌生理盐水)皮下注射男性裸体小鼠的两大腿背地区(ν/ν;20 - 25克;6 - 8周的年龄;BioLasco台湾有限公司)。肿瘤生长曲线得到每天使用数显卡尺测量肿瘤直径一旦膨胀引起的肿瘤细胞注射部位(肿瘤大小~变得可见毫米³)。肿瘤体积(毫米³)是计算使用formla: 0.523×(长×宽×厚度)和评估每周两次一个月。所有涉及实验动物进行按照制度动物保健和使用委员会的指导方针。

2.9。在活的有机体内双光子激发PDT

在活的有机体内当肿瘤体积的PDT实验达到约毫米³。老鼠被分成十二组动物减少组体重和肿瘤大小的变化。带有裸体小鼠麻醉和瘤内注射治疗PdTPP或MSN-PdTPP 50浓度μg。一个小时后注射,老鼠受到80 J的波长532纳米的激光辐照光的平均功率,交付给皮肤是235兆瓦。对照组小鼠瘤内注射盐水有或没有收到照射,分别。老鼠监控最大的28天。长度、宽度和厚度的肿瘤是由数字卡尺测量和评估每周两次一个月。所有小鼠安乐死的第28天,肿瘤被进一步研究。

2.10。组织准备组织病理学和免疫组织化学

在实验结束时,彻底的老鼠尸体剖检后立即实施安乐死。肿瘤样本的质量是嵌入在10月(Tissue-Tek)和存储在冰箱−20°C。样本切割10点μ米厚度,然后与苏木精和伊红染色()),caspase-3 (abcam)和TUNEL染色(罗氏公司,原位细胞死亡检测设备)通过光学显微镜检查。

)染色,冻存组织部分固定在4%多聚甲醛和苏木精和伊红染色。染色后,部分脱水,安装和观察。

caspase-3染色,部分从低温贮藏组织孵化为3% (v / v)过氧化氢在甲醇15分钟和3% BSA 1 h阻断内源性氧化物酶和非特异性结合。部分被孵化与多克隆抗体活性caspase-3(1: 500)在稀释缓冲(1%的牛血清白蛋白,0.1% Tween-20 PBS)一夜之间在4°C。部分下孵化了山羊anti-rabbit合二次抗体(杰克逊,1:10000)在PBS 1 h。检测caspase-3阳性细胞是通过Diaminobenzidine (DAB)免疫组织化学,其次是与腮苏木精复染色。

TUNEL染色,部分固定在4%多聚甲醛在3%过氧化氢在甲醇和阻塞了15分钟。下一个标本是孵化透化作用的解决方案(0.1% triton x - 100和0.1%柠檬酸钠在PBS)冰2分钟。TUNEL反应混合物添加和孵化在黑暗中1 h在37°C。PBS冲洗后,样品被孵化与converter-POD 30分钟在37°C。apoptosed细胞的检测是通过使用用免疫组织化学,其次是与腮苏木精复染色。

2.11。透射电子显微镜成像的肿瘤组织

电子显微镜,肿瘤组织标本在戊二醛固定在一夜之间,与PBS缓冲(2.5%)。组织被洗3 PBS的变化和后缀1 h包含OsO在一个解决方案₄与PBS缓冲(2%)。样本下洗3 dH的变化₂O和脱水逐步在乙醇。组织使用Spurr聚合树脂15个小时的68°C。嵌入的标本被在70纳米薄片,在日立h - 7650透射电子显微镜观察操作在80千伏。

3所示。结果与讨论

MSN表面化学的内在灵活性容易使postsynthesis,特定于应用程序的修改,例如,调整最佳的药物释放,分散稳定、细胞吸收,和附件的显像剂和靶向配体。为当前应用程序中,porphyrin-based光敏剂PdTPP是通过添加氨基酸组MSN的外表面和纳米通道的墙壁。氨基改性的MSN表面也增加的整体表面电荷nanoplatform(电动电势MSN-PdTPP: + 28.5 mV),从而提高细胞吸收和减少self-aggregation(因此自灭)。Di (N-succinimidyl)碳酸盐(DSC)耦合是用来封装PdTPP msn。MSN-PdTPP形态学特征,结合透射电子显微镜(TEM), N₂adsorption-desorption等温线测定,紫外可见光谱。TEM研究了秩序井然的,六角形多孔介孔二氧化硅的结构特征,平均颗粒直径80纳米(数字1(一)和1(b))。表面积和孔隙大小的msn和MSN-PdTPPs测定N₂adsorption-desorption等温线(测量数据1(c)和1(e))。PdTPP合并后,纳米粒子的表面积减少985²g⁻¹(MSN) 632.06米²g⁻¹(MSN-PdTPP)。MSN-PdTPP紫外吸收光谱的测量和PdTPP MSN接合大大增加PdTPP水溶性甲醇通过拥有只有轻微的差异解决方案,但是在去离子水(图显著差异1(d))——的结果PdTPP在水中的溶解度差,及其聚合扩大俗带谱。量化MSN PdTPP内容的配合是通过测量每个样品的吸光度在400 nm (PdTPP俗乐队)溶解在HF-NaF,平均PdTPP 5.5%的体重。

我们评估了一代的单线态氧(¹O₂)的光致辐照MSN-PdTPP在水中使用间接化学法:采用1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF),在400 nm的光学吸收减少单线态氧的存在。我们也测量了单线态氧生产photoirradiated免费PdTPP在水中比较(10.4μ克PdTPP,自由形式和MSN-conjugated形式)。单线态氧代MSN-PdTPP和自由PdTPP水悬浮液,加盖532 nm激光二极管光谱辐照和20秒间隔采样,如图2作为照明时间的函数。单线态氧代DPBF-only解决方案和DPBF解决轴承msn(数据未显示)作为控制。更陡峭的减少被发现的光学吸收DPBF的解决方案包含MSN-PdTPP比nanoparticle-free样本反映出前产生更高的效率¹O₂。

为在体外细胞毒性分析nanoplatforms, WST-1化验使用mda - mb - 231细胞的生存能力1 h与要么孵化项目10后,25或50μ克毫升⁻¹MSN-PdTPP或免费PdTPP-both光致辐照前后。评估最佳的照明,我们photoirradiated这些组织在三个不同的总能量(1.5、2.5和5 J)使用532纳米二极管激光器(mW /厘米²)。如图3 (b)发现,小photo-induced细胞毒性为25μg和50μg免费PdTPP治疗,81% 25的异常μ克毫升⁻¹80%,50μ克毫升⁻¹分别在5 J辐照。然而,重要的细胞毒性观察50μ克毫升⁻¹MSN-PdTPP 2.5 J和5辐照(图3 (d))。如数据所示3(一个)和3 (c)没有观察到有细胞毒性作用,自由PdTPP或光致辐照前MSN-PdTPP。

与这些承诺在体外结果,然后我们试图描述在活的有机体内效用nanoconstructs PDT通过使用男性ν/ν裸体mda - mb - 231异种移植小鼠轴承。mda - mb - 231和mda - mb - 231 - gfp肿瘤细胞(细胞/ 200μL无菌生理盐水)皮下注入背区域的左、右大腿,分别(图4)。mda - mb - 231 - gfp荧光肿瘤细胞接种肿瘤的位置和更好的可视化的验证的增长。后肿瘤已经增长到大约的体积毫米³进行比较PDT功效研究,我们首先将动物分成四组(),以减少组间体重和肿瘤大小变化。下两个对照组(有/没有光致辐照)瘤内注射120μL无菌生理盐水(0.9%氯化钠),其余两组瘤内注射50μg MSN-PdTPP或同一PdTPP-concentration PdTPP自由。一个小时后的政府,一个对照组自由PdTPP和MSN-PdTPP实验组麻醉及其肿瘤辐照在532 nm 80 J的总能量沉积。肿瘤大小和体重随后每天监控,在接下来的28天。如图5(一个),单个瘤内MSN-PdTPP和接触单发光致辐照在肿瘤体积明显更有效的减少比单发photoirradiated免费PdTPP或生理盐水/控制(图5(一个))。我们假设所观察到显著增加PDT功效提供MSN保护PS的交付产生主要来自nanoparticle-enhanced的内吞作用和顺向保留PS-combining推迟PS的间隙肿瘤部位以及避免环境恶化。

PDT治疗后28天,老鼠牺牲的肿瘤被测量(图5 (b))。之间没有长期PDT的好处被发现的差异2生理盐水对照组(有/没有光致辐照)和自由PdTPP实验(图组5(一个)),意味着肿瘤体积,在研究结束,测量毫米³(生理盐水,没有辐射,),毫米³(生理盐水,辐照,),毫米³(免费PdTPP辐照,)。瘤内注射后,免费PdTPP分子有流失倾向远离肿瘤,因此对肿瘤局部照射后nonobservable PDT效应。MSN-PdTPP集团,然而,演示了戏剧性的PDT好处在辐照后28天,平均肿瘤的体积毫米³(),也可以从一个代表性的样品图5。相比之下,MSN-PdTPP集团没有辐照证明PDT效应不显著,其肿瘤体积平均增加6倍后15天内注入和13.5倍后28天注入,分别为()。这说明一个类似肿瘤的生长曲线与生理盐水对照组。

然后我们进行苏木精和伊红())切除肿瘤的组织学染色和注射部位的组织部分,确认,血液的存在是PDT(图的特征6(一))。更精确地评估抗肿瘤反应我们的纳米颗粒PDT治疗,我们比较末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)和caspase-3免疫组织化学染色法对细胞凋亡的肿瘤从老鼠MSN-PdTPP处理纳米粒子为0 h和1 h和辐照,以及消极的控件(数字6 (b)和6 (c))。肿瘤治疗MSN-PdTPP 1 h了相当大的细胞凋亡在光致辐照后一天。彩色部分MSN-PdTPP-treated肿瘤收获后28天辐照仍然显示更大的细胞凋亡。相比之下,TUNEL和caspase-3染色的样品后立即photoirradiated MSN-PdTPP政府透露多少细胞凋亡。这些发现表明,即使MSN-PdTPP可观的一代¹O₂,PDT治疗受益强烈依赖高效nanoplatform内吞作用。

进一步描述我们的纳米颗粒的吸收癌细胞在活的有机体内我们进行了TEM mda - mb - 231肿瘤部分收获0,1,瘤内注射后6 h(图7)。如数据所示7(一)和7 (b),肿瘤治疗的TEM图像1 h与MSN-PdTPP之前证明比收获更大的纳米粒子吸收纳米颗粒后管理,与纳米粒子主要局限于细胞的外围0 h和没有明显内源性。对肿瘤的显像治疗6 h之前,然而,透露一些纳米颗粒内剩余的收获肿瘤。综上所述,我们认为最佳的内吞作用,因此最优光致辐照可能介于1和6 h后瘤内注射的纳米颗粒。

4所示。结论

在这个工作我们描述光动力治疗疗效的重要增强实现通过使用nanoparticle-based敏化,即使治疗仅限于一个感光剂剂量和一个光致辐照会话。通过共价接合大量光敏剂Pd-porphyrin到环境交际介孔二氧化硅纳米粒子的纳米通道的墙壁,我们绕过疏水性光敏剂self-aggregate和self-quench的倾向。这种保护的利益输送大量的光敏剂,我们nanoplatform内吞作用的倾向,从而积累光敏剂在肿瘤允许使用光敏剂剂量远低于自由光敏剂和更大的抗肿瘤反应。当前努力的目的是我们的表面功能化nanoplatform pathology-specific瞄准时机,进一步优化pathology-dependent /纳米粒子剂量和频率光致辐照。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者承认台湾的国家卫生研究院的资金支持(bn - 103页- 04和nm - 103页- 01)和台湾的国家科学委员会(nsc - 100 - 2911 - i - 400 - 502和nsc102 - 2113 m - 400 - 001 - my3)。