文摘
低强度激光照射(莉莉)被发现促进骨骼肌的再生在活的有机体内但细胞机制并不完全理解。成人骨骼肌成肌细胞,通常静止和灭活,是一种肌原性的祖细胞和视为主要候选人负责肌肉再生。本研究的目的是研究丽丽的影响增长潜力和培养的成肌细胞的细胞循环发展。主要成肌细胞与大鼠后肢在缺乏营养培养基培养了36个小时,然后由氦氖激光照射在一个特定的能量密度。免疫组织化学和流量仪分析表明激光辐照可以增加细胞增殖标志物的表达和细胞亚群增殖阶段与未照射对照组相比。同时,细胞循环调控蛋白的表达laser-treated肌母细胞明显调节unirradiated细胞相比,表明丽丽可以促进静止的再入肌母细胞到细胞分裂周期。将可能影响这些结果表明,丽丽在某些促进其增殖,从而导致骨骼肌再生后创伤和肌痛的疾病。
1。介绍
激光已广泛应用于生物和医学领域多年1,2]。低强度激光照射(莉莉)通常与milliwatt-grade激光输出功率,可以生产特殊biomodulation疾病治疗效果还没有不可逆损伤组织(3- - - - - -5]。丽丽在临床治疗方面取得了积极影响伤口愈合,慢性疼痛,骨折康复等等(6- - - - - -8]。研究已经证明,丽丽可以显著提高骨骼肌的再生过程在哺乳动物和两栖动物9,10]。然而,可能的细胞和分子机制仍不清楚。
在传统的组织病理学,成熟的骨骼肌包含postmitotic肌肉纤维,他们自己有非常有限的重构能力(9]。在正常情况下,成年哺乳动物骨骼肌组织是一种稳定的原子核的营业额很少。然而,骨骼肌损伤和与外部刺激,有非凡的能力启动修复过程涉及多种细胞反应的激活。这个重建过程主要是通过肌原性的前兆,也称为成肌细胞,躺下的基底膜肌肉纤维和可以复制自己在产后肌肉增长添加myonuclei扩大肌肉纤维(11,12]。然而,在成人骨骼肌成肌细胞的数量很少,他们中的大多数在静止和非活动状态,使组织再生和功能修复肌肉拉伤后非常困难。研究人员发现,某些生长因子的作用下,在受伤的成人骨骼肌成肌细胞可以激活进入细胞周期和增殖分化形成新的肌纤维,从而维护和恢复肌肉的完整性和质量13]。
以前,这是表明,相对于未照射控制,丽丽受伤的网站的显著加速的骨骼肌组织修复和再生(9,10]。尽管LILI-promoted肌肉再生已经充分研究在活的有机体内,问题仍然存在,尤其是关于这种治疗在成肌细胞的直接影响在体外和休眠的biomodulatory机制成肌细胞丽丽被激活后参与肌肉再生。因此,在这个实验中,我们使用成肌细胞培养在体外探索丽丽的影响成肌细胞的增殖潜力和细胞循环发展,进一步找出细胞循环调节蛋白参与这个过程,试图提供证据的丽丽在临床实践中的应用。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和鉴定
主要成肌细胞来自下肢肌肉的新生儿Wistar鼠和培养在火腿的不会混合营养补充20%胎牛血清(的边后卫)和孵化有限公司2纯度的浓缩铀(5%)37°C潮湿的气氛。在最初的几个段落的主要文化,成肌细胞被preplating浓缩方法。采用免疫识别成肌细胞是由使用肌间线蛋白的单克隆抗体,阳性中间丝蛋白,筛选下激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)。
2.2。激光辐照协议
在这个实验中,氦氖激光的波长632.8海里。激光辐照之前,成肌细胞最初播种在细胞培养板4×10的密度4细胞/毫升。在理想的时间点,在室温下辐照在黑暗中进行。激光辐照是文化板块从上面通过光学透镜的组合。细胞样本之间的距离和镜头调整使激光束直径与文化板块的宽度相同。辐照对细胞的功率密度是衡量6 mW /厘米2辐照时间是基于我们的preexperiment设置为3分钟。未照射控制细胞受到实验条件相同的辐照细胞,除了辐照。
2.3。细胞预处理和分组
模拟初始成肌细胞的生理状态在活的有机体内和排除未知因素的可能影响血清,成肌细胞和血清饥饿进行预处理,以便我们能更准确地分析激光辐照对成肌细胞的影响。简而言之,成肌细胞通道后一夜之间首先培养生长介质中含20%的边后卫,然后切换到36小时的无血清培养基。的细胞呈现静止和同步在G0 / G1期通过血清饥饿被裁判以10%的边后卫(以下称为“10%的边后卫集团”下面的一样)或辐照如上所述(激光组)。细胞serum-refed和辐照被设置为负控制(对照组)。在激光和对照组血清饥饿后,成肌细胞继续保留在无血清培养基。同时细胞培养在血清中有20%的边后卫没有任何治疗(饥饿和辐照)作为积极的控制(20%的边后卫集团)在这项研究。
2.4。流仪测定
成肌细胞收获激光照射后24 h或血清重新喂料。与75%乙醇固定后,细胞消化了DNase-free磷酸盐(PBS)包含5中核糖核酸酶μg / mL propidium碘进行DNA染色。propidium碘荧光和正向光散射检测到一个流式细胞分析仪配备CELLQuest软件。细胞的百分比在G0 / G1和S / G2 / M期细胞周期的计算,分别。
2.5。免疫组织化学
成肌细胞和4%多聚甲醛固定,然后用鼠标孵化马伯增殖细胞核抗原(PCNA)在4°C 20小时。与PBS彻底冲洗后,细胞与生物素化的孵化山羊anti-mouse免疫球蛋白和HRP-conjugated链霉亲和素先后。过氧化物酶反应是使用原子能委员会执行色原体和在显微镜下检查。三个独立的每个条件进行实验,共有至少100细胞数为每个标本。
2.6。西方墨点法
辐照后/重新喂料,细胞收获迅速在预期的时间点,和总蛋白提取与裂解缓冲。提取量化蛋白质化验设备,分次6% SDS /页面,然后转移到一个聚膜。阻塞后,膜被孵化用鼠标马伯细胞周期蛋白和细胞周期素D,分别,然后处理山羊anti-mouse免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶。免疫复合物膜被使用diaminobenzidine可视化系统。的相对灰度值对应的乐队和β肌动蛋白进行比较和semiquantified图像分析软件。
2.7。统计分析
所有的实验数据都来自实验至少重复三次,除非另有指示。统计分析是由以及。一个统计的概率被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。成肌细胞的生长特性
丰富主要成肌细胞显示显著的增殖潜力。纯粹的成肌细胞文化已经扩大超出30人口倍增。没有检测到增长率或细胞形态学的变化即使广泛扩散在体外。因为非凡的增长潜力的主要成肌细胞在这些文化条件下,上述serum-starved预处理成为可能并不是由数量有限的可用的细胞。用于激光照射的细胞通道3 - 6倍,除非另有指示。
3.2。丽丽在成肌细胞PCNA表达的影响
PCNA增殖细胞核抗原,细胞染色体的DNA复制的必要组件。其合成和表达与细胞增殖周期有关。增殖细胞核抗原表达的量化是一种简单可行的方法,评估细胞增殖活动。在这项研究中,PCNA的表达通过免疫组织化学方法检测(包含IHC)使用半定量的分析和评估。我们的结果表明,激光辐照后24小时,激光组的PCNA表达显著高于对照组和10%的边后卫组但低于20%的边后卫组(图1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。丽丽对成肌细胞的增殖指数的影响
增殖指数(PI)被定义为细胞的总数在细胞周期的所有阶段(G0、G1, G2,和M阶段)的数量除以细胞进入分裂(年代,G2,和M期);也就是说,π= (S + G2 / M) / (G0 / G1 + S + G2 / M)。扩散指数反映了增殖细胞的百分比在S期和G2 / M期细胞周期与PCNA表达分析,可以用来给一个更完整的理解成肌细胞的生长特性。如数据所示2和3,激光照射后24小时或serum-refeeding肌母细胞(约42%)在S期和G2 / M期细胞周期与成肌细胞相比对照组(小于12%),而值略低于20%的边后卫的成肌细胞组(大约65%)。结果表明更多的成肌细胞进入增殖期后莉莉,这是符合上述数据。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。丽丽对成肌细胞的细胞循环调控蛋白的表达
真核细胞的分裂周期是由一个家庭的细胞循环调节蛋白(也称为细胞周期蛋白)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复杂的细胞周期素D和细胞周期蛋白的关键分子可以触发细胞循环,从而推动细胞从静止到有丝分裂周期。周期变化的表达式是细胞循环进程同步。提出了图4发现,只有轻微的表达细胞周期素D控制细胞,而细胞周期素D蛋白质含量显示大约5倍和7倍增加辐照后30分钟/重新喂料在辐照或serum-refed细胞,分别。细胞周期蛋白的表达也诱导2 h在辐射照射后细胞表达水平是兼容的感应serum-refed细胞,而其未照射对照细胞表达几乎检测不到。这些结果表明,丽丽可以调节早期细胞循环调控基因和促进细胞循环入口在成肌细胞G0 / G1期,由此促进了细胞循环发展和增加serum-starved预处理后其增殖的潜力。
(一)
(b)
4所示。讨论
众所周知,骨骼肌修复是一个高度同步的过程涉及多种细胞反应的激活(11,14]。在这其中,肌原性的干细胞,也被称为肌母细胞,在这一过程中发挥着至关重要的作用。在成人骨骼肌成肌细胞的数量很少,大多数人通常处于休眠状态,使组织再生和功能修复困难后肌肉损伤(15]。然而,外源性生长因子等刺激的作用下,可以激活这些细胞进入细胞周期和增殖并进一步相互融合形成新的肌肉纤维,最终导致替换受伤的和快速的肌肉再生(16]。先前的结果表明,丽丽的辐照网站受伤后骨骼肌出现更多的新生儿肌纤维的形成,表明肌肉再生的主要候选人应对激光照射也可能成肌细胞(9,17]。
然而,到目前为止,许多实验室结果仍有争议的关于激光photobiomodulatory效果,和不同的辐照参数和生长条件用于各种研究复杂的问题进行有意义的比较(18- - - - - -20.]。在这项研究中,低能量氦氖激光的功率密度(632.8海里)大约6 mW /厘米2用于成肌细胞照射在体外。这种治疗剂量(功率密度和照射时间)被发现是最优的成肌细胞增殖的生物刺激,基于一系列细胞培养的初步实验。在我们preexperiment,三种不同的能量密度(6 mW /厘米21分钟、3分钟或10分钟包括0.36、1.08或3.6 J /厘米2、职责)。我们最初调查的影响,氦氖激光照射时间不同的细胞数量和肌管形成确定的最优能量密度LILI-induced生物效应。我们发现辐照3分钟可以产生最大biomodulation成肌细胞。因此,能量密度使最好的初步结果(3分钟)是本研究中使用的细胞血清饥饿,鉴于丽丽的细胞反应主要取决于最初的目标细胞的生理状态(3,4,21,22]。之前在接下来的实验中,激光照射,成肌细胞最初36 h和预处理serum-deficient介质时增加到近汇合的,然后裁判有10%的边后卫或者受到激光照射。细胞先前报道进入静止在血清饥饿只能维持生存的年轻postmitotic细胞,成肌细胞的生理状态在活的有机体内模拟和丽丽的细胞反应可以独立筛选出来。
然而,本文未照射对照成肌细胞的一个有趣的方面是,这些细胞在无血清培养条件下,保持在也显示细胞增殖,如图3。一般来说,无血清细胞培养既不能增殖像往常一样(23)等其他刺激也没有被激活的丽丽(24]。然而,使用的培养基(火腿的不会)这对成肌细胞实验在体外文化在某种程度上包含的组件根据文献[血清25),从而导致了低程度的成肌细胞的增殖指数在对照组,尽管这种采用无血清细胞增殖技术实际上是一种不正常的增殖。然而,我们的研究结果表明,这种类型的功能失调在成肌细胞增殖或增殖失衡在serum-deficient条件下可以明显改善了丽丽。如前所述,在成人骨骼肌成肌细胞通常是处于休眠状态,但一旦受伤就可以激活启动增殖周期。如果激活成肌细胞增殖以正常方式,受伤的肌肉可以自动更新自己和丽丽可以加速这个再生过程间接photobiomodulation (PBM) [4,21]。然而,如果这些细胞的功能失调的扩散(就像serum-starved条件下在体外),丽丽将直接促进成肌细胞的增殖在活的有机体内从而大大促进肌肉损伤的恢复。
研究表明,PCNA的表达,蛋白质早期细胞循环,这是调节在G1期,可以显著影响低强度激光照射(26]。在目前的实验中,36小时后血清饥饿其次是丽丽,PCNA蛋白水平以及π值也评估主要成肌细胞。已经表明,越来越多的细胞群是由细胞组成的细胞周期的所有阶段(G1, G2,和M阶段),和评估细胞亚群在S期和G2 / M期细胞周期可用于细胞增殖评价(27]。通常情况下,没有明显的PCNA表达细胞G0 / G1期,而其表达在G1期后期大幅增加。表达式在S期达到峰值,在G2 / M期显著降低。增殖细胞核抗原表达的周期性变化以及π值,符合各个阶段的细胞DNA合成,从而能体现培养成肌细胞的增殖活动(28]。增殖细胞核抗原表达和我们的研究结果表明,成肌细胞的比例在S / G2 / M期细胞周期大大增加激光照射后24小时,表明丽丽可以推动更多的成肌细胞从静止G0 / G1期进入有丝分裂阶段,从而提高他们的扩散能力,这进一步证实了调节细胞周期素D和细胞周期蛋白的表达。
众所周知,细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白的启动因素G0 / G1转换及其诱导表达导致细胞循环发展的LILI-activated成肌细胞。先前的研究[26,29日鼠标的肌原性的细胞在低增长的条件下建立了丽丽可以刺激细胞进入细胞周期后24小时照射和诱导的细胞周期蛋白D1表达式中检测出辐射照射后细胞早在6分钟。因此,它更有可能增加增殖能力丽丽涉及细胞周期蛋白的翻译后所需的入口,通过细胞周期G1期的进展。定量免疫印迹分析在这个实验的结果显示,36 h血清撤军后,细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白只有跟踪控制细胞中表达,这表明肌母细胞被同步到G0 / G1期后血清饥饿;在很短的时间内辐照后,细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白的表达明显增加。因此,这些发现与以前的结果暗示丽丽调和成肌细胞增殖的刺激作用通过影响细胞周期中的早期事件,如早期细胞循环调控基因的诱导表达。
进一步,在初步实验中我们还发现,丽丽用不同能量密度有不同影响肌母细胞增长在体外(数据没有显示)。在这项研究中,丽丽1分钟有弱促进细胞数量和细胞循环发展;然而,激光照射10分钟能抑制成肌细胞增殖,表明biomodulatory丽丽对主要成肌细胞是剂量依赖性的影响,这也是符合丽丽的生物学特性。
在我们的实验中,辐照成肌细胞的生存和繁殖能力缺乏血清食粮与未照射细胞相比是非常出色的。激光辐照似乎类似于血清负责肌母细胞生存和增长的组件是否成肌细胞休眠在活的有机体内在G0 / G1期或逮捕在体外在某些方面,它可以代替血清肌母细胞从静止的要求重新进入细胞周期。也预示着细胞反应丽丽会削弱或缺席,如果成肌细胞最初serum-sufficient增长条件下维护而不是serum-deficient培养基,特别是考虑到这一事实,对激光photobiomodulation,最初的目标细胞的生理状态是至关重要的治疗反应(21,22,30.,31日]。
5。结论
综上所述,我们的研究表明,在文化可以促进成肌细胞从静止到细胞增殖周期在激光辐照在一定的影响。这些结果还表明,丽丽影响早期细胞循环调控基因和提高成肌细胞的增殖潜力,从而增加细胞增殖,导致肌肉再生在活的有机体内。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
陈Cui-Ping张Shao-Dan Li Yan,严明江泽民的贡献同样这项工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81171798,81171798,81230041),北京市自然科学基金(7142124)和国家基础科学和发展计划(973计划、2012 cb518105)。