文摘
背景。高血压导致心脏重构和肾损害的进展。反过来,肾交感神经hyperactivation表明交感神经系统活动,导致血压升高增加在某些病人。本研究的目的是观察肾神经去神经对血压的影响和靶器官的变化在两个高血压大鼠模型。方法。高血压大鼠随机分为一个肾脏去神经(RDN)组和虚假的操作组。Wistar-Kyoto同龄的大鼠(WKY)被设置为基线组。在继发性高血压模型中,SD大鼠随机分为5组。每周测量血压和体重,直到他们被安乐死。结果。两个老鼠模型经历了RDN的关键时间点。在这些时间点,心脏和肾脏收集对去甲肾上腺素和血管紧张素ⅱ测量和组织学分析。结论。RDN之前执行高血压的发展表现出显著的抗高血压作用继发性高血压模型。
1。背景
高血压是与增加交感神经激活有关,可能导致心脏重构和肾损害的进展1]。虽然药物治疗可以降低血压和高血压患者的心血管事件的发病率,一些患者仍不能受益于药物治疗(2]。肾交感神经切除(RDN)减少肾交感神经传出和传入神经的活动。RDN作为介入方法目标提高交感神经系统活动得到了相当大的兴趣,因为它导致了降低血压(BP)在某些不受控制的高血压患者(3,4]。有复杂的临床证据支持RDN作为有效的降压治疗。一些随机对照试验(5- - - - - -7)支持过程的安全性和有效性,但是一些较小规模的研究,以及随机、假对照SYMPLICITY HTN-3审判,未能显示RDN的优越性与医疗相比单独(8]。潜在的病理生理的概念,强烈支持的各种实验模型的高血压9- - - - - -11]。手术RDN肥胖,预防自发性高血压大鼠的进步提高BP和的肾损伤进展和心脏重塑(12]。根据不同的高血压发病机制,主要有两种类型的hypertension-primary高血压和继发性高血压。合适的,高血压动物模型与长期随访将大大有助于进一步评估英国石油公司的影响和其他代理详细的标记效果,如组织学RDN和肾去甲肾上腺素含量(13]。因此,本研究的目的是观察RDN对血压的影响和靶器官的变化在两个不同的高血压大鼠模型。
2。方法
2.1。动物
男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(重量:200 - 220克)是由河北医科大学实验动物中心提供。大鼠随机分为5组(所有的样本大小相等,n= 20):对照组,虚假的集团,two-kidney一段视频中(2 k1c), two-kidney一段视频中加上肾脏去神经(2 k1c + RDN)和two-kidney一段视频中为6周+肾脏去神经(2 k1c + 6 RDN)。SD大鼠随机牺牲在第一个,第七,十四,十八周2 k1c手术后在五个不同的组。Twelve-week-old自发性高血压大鼠(月n= 24)被随机分为肾脏去神经组(RDN组)和虚假的操作组(虚假的组)。Wistar-Kyoto (WKY)同龄的大鼠(n= 12)被设置为基线组。月老鼠,SD大鼠,WKY大鼠被托管在清洁水平环境中,光/暗周期12/12 h, 50% - -60%的相对湿度,环境温度22°C-25°C, 4 - 5每笼老鼠,和免费的食物和水。四个月的老鼠被随机牺牲在一个星期,术后8周、12周在三个不同的组。英国石油(BP)和体重(g)测定手术前和手术后每个星期直到前一天安乐死两大鼠模型。两只老鼠模型接受RDN在手术切除的关键时间点与应用程序和化学消融方法(使用苯酚10%乙醇溶液)。伦理委员会批准的所有实验程序是河北医科大学第二医院。动物的使用和护理符合机构的指导方针。
2.1.1。收缩压(SBP)测量
在所有的老鼠,收缩压(SBP)使用tail-cuff测量无创方法(LE 5001;PanLab,巴塞罗那,西班牙),如前所述14]。SBP的价值观三个血压测量的平均在10毫米汞柱。SBP是监测在治疗,最后测量获得前6小时老鼠被杀。
2.1.2。肾神经去神经
两个肾都接近通过内侧全身麻醉下剖腹手术切口腹膜后和1.5% - -2.5%异氟烷。两个肾脏手术去除神经支配通过削减所有可见肾门周围神经和剥离大约2 - 4毫米的肾动脉的动脉外膜。该地区当时滋润苯酚/乙醇溶液为20分钟。虚假的外科手术,肾曝光和不干预,执行在所有其他动物(SD-sham、SHR-sham和WKY控制老鼠)(15]。
2.1.3。2 k1c肾血管性高血压
老鼠被放置在左侧侧卧位和1.5% - -2.5%异氟烷麻醉。尽量减少侵入性方法肾、背中线的了一个口子。安装工人脊柱牵引的肌肉暴露了肾脏,从而使肾动脉和静脉的识别。一线夹与内部0.25毫米直径周围放置左肾动脉,导致部分闭塞的肾灌注。将剪辑之后,侧面切口缝合。后立即手术,动物收到一个适当剂量的抗生素(青霉素160000单位/鼠肌内)。2 k1c + RDN组,上述操作后,然后我们进行了肾神经去神经的操作。虚假的组,肾是接近2 k1c组中使用相同的机制。肾脏被曝光,但银夹没有放置。
2.1.4。心脏LVMI测量
老鼠被安乐死,他们的心被收集。左心室(LV)分离,重。LV重量比体重计算左心室质量指数(LVMI)。
2.1.5节讨论。酶联免疫吸附试验
静脉血样采集的关键时间点(月:周1 8和12;SD:周1、7、14、18)。在月的老鼠,NE和Angⅱ的浓度测量在1周,8周、12周。在SD大鼠,NE和Angⅱ的浓度测量在1周,7周,14周,分别和postrenal 18周神经去神经。等离子体是通过离心法全血在4°C(在3000转10分钟);这种等离子体样本存储在−80°C到ELISA测试执行。去甲肾上腺素(NE)和血管紧张素ⅱ(Angⅱ)水平在10周使用ELISA试剂盒进行了测试。所有程序都按照指示书(Cloud-Clone集团CEA907Ge和CEA005Ra)。
2.1.6。组织学
心脏和肾脏样本收获的关键时间点。左心房(LA)组织是与心脏和4%多聚甲醛固定,然后嵌入石蜡。心室横向切成两部分。心室的嵌入在石蜡标本,包括顶点是储存在−80°C。部分削减从心脏被苏木精和伊红染色试剂())。为两国的肾脏,程序是相同的。部分从石蜡块沾着他走时。五个部分每个样本是随机挑选的,和五个微观领域(×400)每节选择进行分析。胶原蛋白体积分数(CVF,表示为纤维化面积的百分比)被用来评估肝纤维化的程度由ImagePro + 6.0软件,如前所述。
2.1.7。西方墨点法
膜蛋白提取从LV和肾组织进行使用Mem-PER膜蛋白提取试剂盒(美国皮尔斯化学,罗克福德,IL)根据制造商的指示。短暂,LV和肾脏组织暂停1毫升冰冷里帕裂解缓冲(50更易/ L Tris-HCl, pH值7.4,150更易与L氯化钠0.25%钠脱氧胆酸盐,0.1%诺乃清洁剂p 40,和0.1%钠十二烷基硫酸盐(SDS), 1更易/ L EDTA, 1更易与L Na3签证官4,1更易/ L二硫苏糖醇,1更易与L phenylmethylsulphonyl氟化物为1分钟)和均质专业组织均质器(美国职业科学,谢尔顿,CT)在最高设置。离心后10分钟8000克、蛋白质浓度测定使用修改后的洛瑞蛋白质分析。平等的膜或总蛋白质样本在12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜与适当的稀释anticollagen孵化我(Abcam 1: 1000年,美国),anticollagen III (Abcam 1: 1000年,美国),antimyosin重链(Abcam 1: 2000年,美国),和反β圣克鲁斯肌动蛋白(1:1000年,美国)抗体在一夜之间在4°C。样本孵化的碱性磷酸二次抗体1 h在室温下的ttb(渐变20 500更易/ L氯化钠,0.05%,50更易与L Tris-HCl和pH值7.5)和加工化学发光检测根据制造商的指示(圣克鲁斯生物技术)。所有乐队都是评估通过与量测密度术一个V4.6.2软件(BioRad、大力神、钙、美国)。乐队感兴趣的是归一化β肌动蛋白和数据提出了相对密度比率。
2.1.8。统计数据
提出了连续数据平均值±标准误差。两组比较,数据进行了分析t测试。为多个比较,数据分析了单向方差分析(方差分析)测试之后至少显著差异测试。重复测量在多个时间点分析重复测量方差分析测试。使用SPSS 13.0软件进行统计分析。一个的价值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。RDN对体重的影响
3.1.1。在月RDN对体重的影响
月的老鼠,体重没有显著差异之间的RDN组和虚假的组对应点的时间。然而,这两个群体的查阅明显低于WKY组( )(图1(一))。
(一)
(b)
3.1.2。在SDs RDN对体重的影响
在所有学习小组在SD大鼠,没有基线体重和体重的差异导致后一个星期2 k1c手术 。第七,14日和18周,体重的增加在虚假的组和2 k1c + RDN组表现出无显著差异。然而,查阅2 k1c的老鼠明显低于那些虚假的集团;同样,体重显著差异之间被2 k1c + 6 rdn集团和虚假的集团 。体重没有显著差异被认为2 k1c组和2 k1c + 6之间的rdn ,如图1 (b)。
3.2。收缩压(SBP)和神经体液的激活在月和SDs
3.2.1之上。SBP和神经体液的激活在萎缩
没有统计的差异之间的SBP RDN术前和虚假的团体。然而,RDN的SBP和虚假的组明显高于WKY组 。SBP的RDN组明显低于骗局的组手术后从星期1到5 。没有统计学差异之间的SBP RDN第六周后和虚假的团体 。SBP的虚假的集团保持在一个较高的水平,也没有重大变化后第三周后手术 。RDN的SBP和虚假的组高于WKY组在预设的时间 (图2(一个))。Angⅱ血浆浓度和NE(数字2 (b)和22 (c))增加月老鼠。RDN过程显著降低等离子体中的NE和Angⅱ的浓度在第一周。然而,消失在第八周下降期间没有区别观察之间的虚假和RDN组 。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2.2。血压在SDs (SBP)和神经体液的激活
没有不同的基线血压各学习小组 。时的实验中,SBP的虚假的组和2 k1c + RDN组没有显著差异 。SBP的2 k1c组显著高于虚假的组 。第七,14日和18周,2 k1c之间没有显著差异,2 k1c + 6 rdn组织观察 。尽管SBP的2 k1c + 6的rdn组低于2 k1c小组第七,14日和18周(231.22±14.23毫米汞柱和211.56±12.25毫米汞柱,211.56±12.25毫米汞柱和216.11±11.48毫米汞柱,和221.22±5.04毫米汞柱和212.33±6.17毫米汞柱,分别),它们之间没有显著差异(图2 (d))。
在第七周,NE和Angⅱ水平的2 k1c组相比增加了虚假的组 。与2 k1c组相比,RDN可以显著降低NE和Angⅱ的浓度,如果老鼠接受RDN同时和2 k1c程序。与2 k1c组相比,东北的浓度和Angⅱ2 k1c + 6 rdn组下降;然而,观察两组之间无显著差异 。在十八周,每组NE和Ang II的水平一致的水平观察到14周(数字2 (e)和2 (f))。
3.3。RDN对心脏重塑的影响
3.3.1。LVMI测量
(1)LVMI测量在萎缩。没有统计RDN组LVMI测量差异和虚假的小组第一,第八,十二周后手术 。然而,在WKY LVMI明显低于RDN和虚假的组 (图3(一个))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(2)在SDs LVMI测量。2 k1c组LVMI测量在十四和十八周显著增加。与2 k1c组相比,RDN组表现出减少LVMI测量当老鼠同时接受RDN和2 k1c程序 。然而,与2 k1c组相比,RDN没有扮演一个角色在LVMI测量2 k1c + 6 RDN组 。也观察到类似的结果在每组(图18周3 (d))。
(3)心肌细胞组织学形态和蛋白表达。在大鼠模型,不同程度的心肌细胞的损伤,与对照组相比,并没有表现出这些特点。某种程度的损害包括心肌肥厚,无序,心肌间质水肿,部分心肌细胞溶菌作用(清楚周围的结构)。此外,RDN没有显著减弱心脏肥大和纤维化的形成,与英国石油公司(BP)的变化。
与对照组相比,心肌蛋白的表达αmhc、COL1A1 COL3A1大幅升高的萎缩和2 k1c组。只有2 k1c + RDN组,RDN显著减毒蛋白的表达αmhc、COL1A1 COL3A1与虚假的集团(数据相比3 (b),3 (c),3 (e),3 (f))。
3.4。装修RDN对肾脏的影响等
3.4.1。肾脏重构在月
减少RDN萎缩肾交感神经支配的老鼠没有阻力指标损伤。也许可以与肾小球的衰减,半定量的得分肾小球硬化肾小球损伤显示更明显的虚假的组织与控制。虚假的组中足细胞的免疫组织化学染色显示明显损害;然而,这种损害无法减少的RDN。与对照组相比,肾的胶原蛋白基因表达我是假组显著升高。RDN没有基因表达显著减弱坳我和虚假的集团(数据相比4(一)和4 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4.2。在SDs肾脏重构
减少肾交感神经支配的RDN组阻力指标损伤。也许可以与肾小球的衰减,足细胞的免疫组织化学染色显示显著的损害在虚假的组,可以缓解只有2 k1c + RDN组而不是2 k1c + 6 RDN老鼠。与对照组相比,肾表达胶原IA的大幅升高2 k1c和2 k1c + 6 rdn组。RDN 2 k1c + RDN组显著减毒的坳IA的表达,与2 k1c集团(相比的数字4 (b)和4 (d))。
4所示。讨论
目前的研究表明,RDN之前执行高血压的发展提供重要的继发性高血压模型中的抗高血压的好处。然而,RDN无法维持这种抗高血压效应当高血压已经开发了两种大鼠模型。据我们所知,高血压的发病机制很复杂,包括原发性高血压和继发性高血压。许多研究已经证实,激活交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(老城)起到至关重要的作用在调节血压。然而,特定角色交感神经在这两个系统还不清楚。2014年,SYMPLICITY HTN-3作为第一个双盲随机试验,它未能达到降压效果的主要终点(8,16),RDN研究兴趣的下降引起的。然而,SYMPLICITY HTN-3审判也有自身的局限性;许多临床试验和动物实验表明,交感神经不仅可以调节血压瞬态,但它可能扮演重要的角色在长期的血压控制17]。因此,了解RDN的作用过程中动物模型是非常重要的。这是第一个研究观察RDN对血压的影响,在两种类型的高血压大鼠靶器官。
自发性高血压大鼠(月)是一个很好的动物模型实验性高血压可以作为临床原发性高血压。月的血压增加大鼠随着年龄的增大,达到150毫米汞柱五周大。男性月(年龄:12周)平均动脉压(MAP)平均大约170 - 180毫米汞柱。许多先前的研究已经证实了交感神经的过度激活,和老城系统发展的一个重要的角色月高血压(18,19]。因此,月是适当的动物模型研究原发性高血压。相反,2 k1c鼠模型类似于肾血管性高血压的发病机制在人类模型(17]。肾血管性高血压是最常见的继发性高血压。不仅因此,本研究的目的是评估RDN的影响在不同类型的高血压大鼠(通过一种更简单和更经济的应用高血压动物模型);本研究最重要的目的是评估的状态和角色综合老城系统和交感神经在不同类型的高血压。
许多实验表明,联合切除的肾交感神经和化学肾脏去神经表达下调的血压有效抑制肾交感神经(18,20.,21]。之前的研究表明,RDN的12个月可以有效降低血压和帮助在一个常数血压维持在正常水平22,23]。然而,一些研究报道,瞬态血压下降后12周观察RDN的SH老鼠,与血压恢复术前水平或略高水平(24,25]。这项研究的结果表明,RDN的一周后血压显著降低;与此同时,血浆中NE和Angⅱ的浓度明显低于那些虚假的组,表明两国RDN是有效的26]。随后,英国石油公司逐渐增加月RDN组和八周后,RDN操作,没有显著差异之间的血压SHR-RDN组和SHR-sham组。在整个实验期间,东北的浓度和月Angⅱ组高于同龄老鼠WKY组,表明肾交感神经活动的萎缩是在一个连续的激活状态。有趣的是,NE和Angⅱ水平月暂时减少但再次上升RDN干预后,表示RDN过程抑制不释放和老城系统来降低血压。然而,这种方法不能实现持久和稳定的降压效果。根据上述现象,可以推测的是(1)老城系统参与高血压的维护萎缩,和(2)老城系统时已被激活的开始增加在英国石油(BP)和由中枢交感神经系统维护,所以RDN无法逆转中枢交感神经激活。甚至当地老城被RDN修改,和血压不能持续减少由于无效的RDN中央维护机制。此外,以往的研究发现,肾交感神经再生发生肾交感神经的14天。因此,这项研究的结果不排除神经再生的可能性(27]。
研究表明,肾血管性高血压模型,2 k1c老鼠的血压迅速增长,伴随着海拔血浆NE和Ang II,术后4周(16,28]。2 k1c大鼠的收缩压升高手术后一周,并伴随着NE和Ang II的增加,表明肾血管性高血压模型成功建立。血压和NE和Angⅱ2 k1c + RDN组的浓度没有显著不同于虚假的组的对应的时间点。这些结果表明,同时经营RDN过程之前建立肾血管性高血压模型可能导致血压接近正常通过抑制老城的过度激活系统。他们也可能表明,肾交感神经提供一个重要的角色在肾血管性高血压的发生和发展。这符合Gouvea等人的研究结果表明,肾交感神经活动在《创世纪》中扮演一个角色和高血压的维护29日]。然而,RDN的降压效果没有出现预期的2 k1c + 6 RDN组。与2 k1c组相比,组的血压2 k1c + 6 RDN RDN过程后只有一个下降趋势。这个结果的作者讨论了两种可能的原因:(1)2 k1c肾交感神经的激活后手术,导致系统性的激活交感神经系统通过大脑中枢交感神经传入纤维。因此,RDN六周后血压不能下降过程由于过程只有阻止当地的交感神经系统和大脑中枢交感神经激活。(2)同样,交感神经再生必须考虑。穆德et al ., 2013,表明,在血压正常的老鼠,神经移植的肾脏感觉神经发生在同一时间作为肾交感神经的再生,都被完成在9到12周后RDN [30.]。在大鼠肾脏移植,一些神经移植发生移植后九个月内(31日]。上述两种机制的RDN的好处,和特定的机制需要进一步的实验证实。
之前的研究表明,高血压会导致心肌肥厚、动脉粥样硬化、心脏和肾脏的纤维化(32- - - - - -35]。的αmhc水平,作为一个心室肥大程度损伤指数,主要是在成年大鼠心室细胞。持久性负载可以诱导转换后αmhc进βmhc,导致减少的表达αmhc (36]。一些动物实验和临床试验表明,RDN可以显著改善高血压引起的左心室肥大(36- - - - - -38]。纤维化的上校,我,作为一个指标,相应增加心脏或肾脏纤维化加重(39,40]。这个观察证实,器官损伤是引起高血压心血管系统和肾脏。组织学染色的半定量的分析显示,血压越高,较重的靶器官损害,包括心肌肥厚、主动脉瓣重建和肾纤维化。值得注意的是,只有2 k1c + RDN老鼠证明没有在靶器官受损的表现。RDN看似没有影响的预防高血压靶器官损害的存在,在一级或二级高血压模型。此外,即使血压和激素水平降低到正常水平月RDN组;预期目标器官的好处并没有观察到。此外,组织学观察结果进一步证实了检测蛋白质的心脏和肾脏。这个结果可能不一致与以前的动物实验。
我们的研究的一个重要限制是不记录系统交感活动组。此外,额外的限制存在临床治疗期间,为中小学高血压模型。具体地说,本研究使用的模型已经诊断为高血压,和老城系统被激活。先前的研究已经证实了边际RDN对高血压的影响条件下的老城已经被激活。这种情况被认为是一个可能的原因为临床抑郁HTN-3试验结果。然而,值得注意的是,2 k1c + RDN组和早期干预的月组有明显对血压的影响。此外,如何维持这种效果的方法和干预时间是否可以先进仍需要进一步研究。因此,还需要大量的临床试验来评估患者的早期预防性消融的实用性家族高血压史或继发性高血压的风险很高。
5。结论
血压升高与老城的激活有关,这可能会导致级联效应,一个持续的过程,继续增加血压,从而产生持续的靶器官损害。本研究证实,老城激活预计将有积极的作用对降低血压和预防靶器官损伤如果RDN块当地的交感神经系统的激活老城在高血压模型。
缩写
| LV: | 左心室 |
| LVMI: | 左心室质量指数 |
| 地图: | 平均动脉压 |
| 不: | 去甲肾上腺素 |
| 老城: | 肾素血管紧张素醛固酮系统 |
| RDN: | 肾脏去神经 |
| RDN: | 肾交感神经支配 |
| 研发: | 肾神经去神经 |
| SBP: | 收缩压 |
| SD: | Sprague-Dawley |
| 月: | 自发性高血压大鼠 |
| WKY: | Wistar-Kyoto。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
伦理委员会批准的所有实验程序是河北医科大学第二医院。动物的使用和护理遵守制度准则。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
厕所的设计研究。D.M.L和H.J.H进行研究和写这篇文章。其他作者分析数据及新车型。所有的作者都批准了最终版本的手稿。
确认
这项工作得到了河北省自然科学基金(H2020206409),中国心血管Association-Cardiac康复和代谢疗法研究基金(2018)和中国心血管Association-Advanced基金(2018)。