文摘

(1)本研究旨在证明因果的参与肾素血管紧张素系统(RAS)在血管炎症和氧化应激(OS)在代谢综合征(MS)的实验模型通过果糖政府自发性高血压大鼠(FFHR) 12周。(2)慢性坎地沙坦治疗(C)(10毫克/公斤/天过去6周)或4 oh-tempol (T) (10⁻³饮用水中更易与L过去6周)逆转代谢变量和收缩压的增量。此外,慢性C治疗恢复心血管重塑而不是t(3)此外,慢性治疗C能够完全扭转NF -的表达κB和VCAM-1,但T只减少了表达式。C CINC2 proatherogenic细胞因子的表达,减少CINC3, VEGF,瘦素,tnf,和MCP-1也显著降低MIP-3, beta-NGF, INF-gamma在维管组织的实验模型。T无法大幅修改这些细胞因子的表达。(4)数据显示RAS的参与在不同血管炎性蛋白的表达水平,允许建立一个微环境适合创建、永存,成长,和不稳定的血管损伤。

1。介绍

炎症是一种无处不在的病理过程,是多种心血管疾病的发展核心。许多血管疾病,如动脉粥样硬化、再狭窄和移植血管病变是慢性,渐进过程启动和传播当地的大型和中型动脉炎症(1]。这种炎症是由多种细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞,内皮细胞(EC)和血管平滑肌细胞(VSMC)。多种细胞类型,参与血管炎症已经进化到产生共同的细胞因子和特定的膜受体允许他们传输到细胞的影响,允许这些不同类型的细胞交流的表达和识别多个支持和抗炎细胞因子。因此,细胞因子及其受体的货币是炎症,并代表有吸引力的目标治疗模式在众多血管炎性疾病。

合成和识别的细胞因子和受体血管和炎症细胞允许这两个系统之间的双向沟通,表明,在特定的条件下,我们可以考虑血管细胞作为一个扩展的参与者的适应性免疫反应。在协同与其他细胞因子和细胞因子通常法案经常分享受体亚基结合成为或其他细胞因子与受体形成。细胞因子可以开多个,经常同时,细胞过程包括有丝分裂发生、发展、基因表达、纤维化和趋化作用[2]。促炎细胞因子通常导致核转录因子的激活——(NF -κB),作为一个“总开关”,众多基因的转录,表达的可能是适当的,在宿主防御,或适应不良,如慢性血管疾病(3- - - - - -5]。

动脉粥样硬化的炎症性质促使广泛调查血管炎症过程,因此,促炎的信号机制在血管壁已经研究的很透彻6- - - - - -9]。利益被放在理解潜在的保护作用阻断肾素-血管紧张素系统(RAS)和氧化系统在血管壁10]。类似的研究确实存在,但非常强调血管紧张素的作用和氧化应激代谢综合征血管重建病理生理学。

自发性高血压大鼠(月)提供了一个模型,允许研究原发性高血压的遗传高血压。富含碳水化合物的饮食管理的老鼠可以诱导胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血脂异常、中度高血压。慢性那些吃了果糖的老鼠(FFR)提供一个有用的实验模型,研究形成代谢综合征的因素之间的相互作用。这个组合模型(FFHR)代表高血压个体现代西方饮食富含精制糖(11]。我们假设这双重实验模型可以适合人类病理学推断结果。

假说表明,RAS和氧自由基是积极参与不同分子的激活炎性细胞因子,NF -κB, VCAM-1生成微环境,使心血管重构。

2。方法

2.1。动物和实验设计

所有程序都执行根据动物实验机构的指导方针;协议提交和批准的机构委员会实验动物使用和护理(CICUAL) Medicine-UNCuyo学院的。Thirty-day-old男性纯种京都大鼠(WKY)和月标准商业食物饮食随意,住在一个房间的条件下温度(20°C)和湿度控制,用12小时光/暗周期12周实验期间。坎地沙坦(C)和4 oh-tempol (T)是管理各自的组织在过去的六个星期。(我)控制(W): WKY收到食物和饮用水(DW)随意。(2)月:收到食物和DW随意。(3)那些吃了果糖的老鼠(FFR): WKY收到10% (w / v)果糖(Parafarm,布宜诺斯艾利斯,阿根廷)解决方案在DW 12周。(IV)那些吃了果糖的高血压大鼠(FFHR):月收到10% (w / v)果糖溶液在DW 12周。(V)FFHR + C: FFHR接收10毫克/公斤C食道内政府。(VI)FFHR + T:接待10³在DW随意M T。

在实验周期结束时,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤ip),血液采集标本和动脉和器官无菌切除了测量。

2.2。血压测量

收缩压(SBP)是在有意识的监控间接prewarmed稍微克制老鼠tail-cuff方法和记录在一个草模型7测谎仪(美国马草仪器有限公司、昆西)。老鼠训练的仪器测量前几次。

2.3。生化决定

2.3.1。HOMA指数和腹腔内葡萄糖耐量试验

空腹血浆胰岛素化验了ACS: 180 se自动化学发光系统(德国拜耳)。血浆葡萄糖水平化验使用商业比色法(维纳实验室。、阿根廷)。内稳态模型评估(HOMA)作为指标来衡量胰岛素抵抗的程度;这是使用以下公式计算:[胰岛素(μU /毫升)×葡萄糖(更易/ L) / 22.5] [12]。

实验周期结束前三天,一个葡萄糖耐量试验(GTT)执行。大鼠禁食过夜略与戊巴比妥麻醉,和葡萄糖(2 g / Kg ip)管理。血液样本被tail-bleeding(0) 30、60、90分钟后注入决定血浆葡萄糖浓度。曲线下的面积计算,更易与L / 90分钟。

2.3.2。血脂的评估

最后实验周期血样来自动物,在禁食12小时。血浆总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯评估使用photocolorimetric酶方法(阿根廷罗萨里奥,维纳实验室)。数据表达更易与L。

2.4。氧化应激决定

2.4.1。测量等离子体硫代巴比土Acid-Reactive物质(TBARS)

为了演示的效果增加氧化应激在血管层,血浆脂质过氧化作用是评估TBARS浓度。这种方法是基于血浆丙二醛之间的反应,脂质过氧化的产物,和硫代巴比土酸,之前已经介绍了13]。没有校正样品蛋白质含量是必要的,因为样品的性质(14]。

2.5。测量血管NAD (P) H-Oxidase活动

lucigenin-derived化学发光分析是用来确定NAD (P)在一段胸主动脉H-oxidase活动,如前所述[13]。评估NAD (P) H-oxidase活动,NADPH (500μmol / L)立即补充说,化学发光测量液体闪烁计数器(LKB Wallac模型1219 Rack-Beta闪烁计数器,芬兰)设置在out-of-coincidence模式。Time-adjusted和normalized-to-tissue-weight闪烁计数器是用于计算。在没有重复进行了测量,存在二亚苯基iodinium (DPI) (10 - 6 mol / L),抑制flavin-containing酶,包括NAD (P) H-oxidase [15,16]。

2.6。以挪士活动在心脏和动脉组织匀浆

Ca的活动^{2 +}/ calmodulin-dependent内皮一氧化氮合酶(以挪士)测定肠系膜动脉匀浆和左心室心肌组织,由L - [3 h]精氨酸转化为L - [3 h] citruline。根据蛋白质含量值修正匀浆(布拉德福德方法)和培养时间和表达dpm /毫克蛋白/分钟。从每个独立处理动物获得的材料(16]。

2.7。相对心脏重量

为了评估心脏肥大,我们测量相对心脏重量(RHW)。短暂、心脏与大血管分离,掉进一个缓冲盐溶液(PBS),用卫生纸将弄脏血,重。总心脏重量修正根据心脏重量的比值(毫克)和100克的体重在杀人。

2.8。组织保存

组织标本的组织病理学被处理之前已经报道过(17]。老鼠用于这些样本观察。麻醉动物灌注简要PBS (298 mOsmol /公斤H₂O, pH值7.40,4°C)来清除血液。肠系膜动脉灌注是体内相同的解决方案通过肠系膜动脉在5分钟。组织学研究动脉灌注也有4%多聚甲醛溶液10分钟由石蜡和固定。五μ米厚的组织切片是横向跨越肠系膜组织微观状态(Microm嗯,德国)和组织学研究处理。类似的程序申请心脏组织保护,通过主动脉逆行灌注。

2.9。定量Histomorphometry确定心脏肥大

Histomorphological分析进行切片(免费)外壁的心脏的左心室(LV)。心肌细胞面积的估计是由部分沾马森三色的解决方案。肌纤维横截面的区域被选中。纤维的轮廓是手工绘制。myocardiocyte总面积是表示为平方微米(μ米²)。

2.10。动脉结构

动脉壁结构的变化进行评估通过测量媒体层肠系膜动脉。解剖肠系膜血管床在10%甲醛固定,脱水,嵌入在石蜡,后来切片机。切片染色,检查之前已经描述(17]。Nontransverse脾动脉被排除在调查。媒体比(即腔。,internal diameter to medial thickness) (M/L) was then calculated. Fifty slices from each animal were processed were analyzed to obtain an average value for each rat. Average values were then used for final analysis.

2.11。sds - page及免疫印迹分析

肠系膜组织在PBS和蛋白质提取洗冷20毫米Tris-HCl, pH值7.4,150毫米生理盐水、10%甘油、1% Triton x - 100,蛋白酶抑制剂混合物(P2714σ)。声波降解法后15秒(3 * 10的间隔)和提取30分钟在4°C,样品提取被离心澄清14000 g×20分钟,立即使用或储存在−20°C。蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶平板上分离和转移到0.22 -μm硝化纤维素膜(通用电气公司,德国)。非特异性反应在室温下被孵化1 h在5%脱脂奶粉溶解在洗涤缓冲(PBS、pH值7.6和0.2%渐变20)。墨迹是孵化anti-p65和anti-VCAM-1抗体(0.2μg / mL在屏蔽解决方案)在室温下60分钟。辣根anti-rabbit-IgG peroxidase-conjugated山羊和猪anti-goat-IgG溶解在阻断缓冲区被用作二次抗体(0.25μ在室温下g / mL, 45分钟)。第一和第二抗体过剩被洗涤5 * 5分钟在堵塞的解决方案。检测是通过增强化学发光系统(ABC, Dako系统)和随后的接触柯达X-AR电影(柯达)30年代。

2.12。免疫组织化学和数字共焦显微镜(包含IHC)

转录因子的确定(WB)

兔子anti-rat NF -κB p65亚基(Rel),糖抗体是获得微孔International Inc .(荷兰阿姆斯特丹)(AB1604b),和山羊anti-rat VCAM-1 (C-19)抗体从圣克鲁斯生物技术有限公司获得圣克鲁兹(美国)(sc - 1504)。组织部分被削减时3μ米厚度从石蜡包埋块。Deparaffinized部分被用来确定炎症反应。组织permeabilized 1% Triton x - 100年15分钟,冲洗PBS和阻塞无菌过滤10%正常兔血清20分钟。所有抗体解microfuged使用前20分钟。抗体是1:1000稀释。初级孵化项目持续了1小时21°C,紧随其后的是广泛的PBS Triton x - 100,洗6次为5分钟。二次抗体,anti-rabbit免疫球蛋白TR,抗体免疫球蛋白FITC (Sigma-Aldrich)仅在PBS稀释按照制造商的指示。

图像采集与尼康EZ-C1 3.00软件尼康Diaphot TMD对荧光显微镜装备与氙灯和过滤轮子(萨特仪器,诺瓦托、钙、美国),荧光过滤器(美国VT浓度,伯瑞特波罗),冷却电荷耦合器件相机(美国纽约库克,Tonawanda),和步进电机(丹佛市智能成像的创新公司,美国)。deconvolved Multifluor图像合并,重整使用EZ-C1 3.00缩略图软件。

2.13。高灵敏度测量C反应蛋白(hs-CRP)浓度

等离子体HS-CRP浓度测定用比浊测定(1650年拜耳Advia AG Leverkiusen)。数据表达mg / L。

2.14。“ChemiArray”细胞因子测定

细胞因子表达被ChemiArray评估系统(鼠抗体数组)(Chemicon国际(美国):中性粒细胞趋化细胞因子2和3 (CINC-2和CINC-3), CX3CL1,单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白质3α(MIP-3α),神经生长因子β(beta-NGF),组织抑制剂metalloproteinase-1 (TIMP-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、集落刺激因子(gm - csf)、干扰素γ(INF -γ)、白介素1 (il - 1α和βα,il - 1β)、白介素4、6和10 (il - 4、il - 6、il - 10) LIX、瘦素、肿瘤坏死因子-α(TNF -α)。我们继续,根据制造商的指示,阻止非特异性反应在室温下通过孵化1 h根据有益的解决方案。膜被孵化的解决方案A和B在室温下60分钟。辣根peroxidase-conjugated制造商提供的抗体。多余的一级或二级抗体后被删除或5洗5分钟的清洗解决方案。与化学发光检测进行系统和随后的接触柯达X-AR电影(柯达)30年代。Citokines分布在膜根据地图(表1)。

2.15。试剂

除非另外注明,试剂从西格玛化工有限公司购买,密苏里州,美国。

2.16。统计和数据分析

数据表示为±SEM。数据的统计学意义比较所有组是由单向方差分析评估Bonferroni测试后紧随其后。一个双边P值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。生化决定

我们对实验模型进行分类评估代谢的不同群体。果糖诱导慢性管理几个变化的风险因素包括集群中的特征女士HOMA指数和区域之间的比较下GTT曲线证明FFR FFHR发达葡萄糖耐受不良,证明的显著增加HOMA指数和区域控制老鼠相比(表值2)。

另一方面,FFR和FFHR组的动物也表现出显著差异水平的hdl胆固醇(甘油三酯和胆固醇)相比,其控制(表2)。月,FFR FFHR集团也表现出显著差异水平的hs-CRP WKY相比。FFHR集团hs-CRP水平高于其他组(表2)。

慢性C治疗显著降低HOMA指数和地区GTT曲线;也减少甘油三酸酯水平和脂蛋白胆固醇,扭转此外女士T组成的参数部分,但显著降低这些变量。C值显著降低hsCRP,而T降低他们只是部分。见表2。

3.2。血压测量

表2也显示了SBP的时间进程沿着实验周期变化。第六周,SBP FFHR和月显著增加与对照组相比,也有压力的增加FFR组,低但仍然重要。

C规范化SBP控制值和T SBP部分减少值。C在降低SBP的更有效的和强大的。可能是高血压状态在这个实验模型,虽然它有内皮功能障碍的一个组成部分,应包括血管紧张素1受体(AT1R)在底层机制。

3.3。氧化应激决定

血管氧化状态的测量评估生产超氧化物酶活性及其对血浆脂质过氧化作用的影响。表3表明NAD (P) H-oxidase活动明显高于在主动脉FFHR相比其他组。等离子体TBARS值如表所示3。等离子体TBARS浓度也显著大于FFR的萎缩,FFHR比控制。

此外,动脉以挪士活动提出的模型进行了分析,如表所示3:FFHR显著降低酶活性,导致降低生产和顺向一氧化氮(NO)的生物利用度。

这些结果证实,这些实验模型,本质上FFHR,产生显著的过氧化物生产和没有生物利用度下降。T是有效降低过氧化物生产减少NAD (P)的活动H-oxidase和TBARS,并且也能够正常活动(表以挪士3)。此外C,可能通过抑制NAD (P) H-oxidase的活动,也能够实现这些效果,正常化内皮氧化状态(表3)。

3.4。定量确定心脏和血管Histomorphometry肥大

RHW和myocardiocyte面积都明显高于FFR的萎缩,和FFHR比控制老鼠,展示这些实验模型(表中心肌肥厚3)。的结果M / L比例计算肠系膜动脉如表所示2。FFHR总是显示显著降低M / L从WKY比率相比,相应的动脉;这个结果也注册FFR和月组。

慢性T治疗显著降低心肌肥厚和血管重建,表明氧化应激,通过激活不同的机制,积极参与心血管重构的过程。

然而,在₁由C R封锁更有效减少这些变量。结果表明,细胞内的职位₁R激活是心脏和血管重建的基础流程,不仅引起的氧化应激机制,但也增长因素。

3.5。转录因子的确定

如表所示4肠系膜动脉,一些炎症标记物进行评估,以及nf -κB的表达和VCAM-1,转录后的产品之一,积极参与血管炎症。分子都是由包含IHC决定。这些分子的表达在FFHR组和对照组相比显著增加。在表4,对面板显示了这些抗体的世行的代表形象。肠系膜动脉的平均光密度明显增加从FFHR和FFR组织匀浆相比,他们的控制。它可以观察到的分布β肌动蛋白标记所有组相似。

此外,它包含IHC获得的图像中可以看到在这些实验组织的血管壁。FFHR显示大量增加在NF -κB表达层面的EC和VSMC,也表示VCAM-1皮下的水平。

C完全降低激活和NF -核易位κB (p65分数)和VCAM-1表达式。另一方面,T没能显著降低NF -的激活κB和VCAM-1表达,即使最初的描述这个分子是ROS的激活。这可以解释,因为在FFHR,核因子NF -κB生产更重要的是通过生成的过氧化物AT1R激活。这一发现非常重要,因为阻塞₁R在血管水平显著降低血管炎症。这也可能是一个决定性因素在减少血管重建,正如前面所示。

3.6。细胞因子测定由“ChemiArray系统”

经过评估和分析相关的血管重建和炎症和增加hsCRP FFHR模型开发,我们决定研究局部细胞因子的表达(图2)。通过使用前面描述的工具,我们可以观察FFHR显著增加一些细胞因子,包括以下:CINC2, CINC3, VEGF, MIP-3, beta-NGF, VEGF,瘦素,tnf, INF-gamma和MCP-1(表3)。这一发现是第一个存在的证据在血管炎症水平的实验模型FFHR等胰岛素抵抗。其他细胞因子可测的装备,尤其是白细胞介素,无法计算,因为这项研究是集中在肠系膜组织匀浆,但不是外周血的白细胞介素。这个结果显示了pro-atherogenic细胞因子的重要地位CINC2, CINC3, VEGF,瘦素,tnf, MCP-1, TIMP-1,其他待定意义血管水平甚至MIP-3 beta-NGF和其他与antiatherogenic INF-gamma效果。

慢性T无效治疗逆转细胞因子的表达在肠系膜血管树(表中3)。

慢性治疗C能够反向控制值作为CINC2 proatherogenic细胞因子的表达,CINC3, VEGF,瘦素,beta-NGF, TIMP-1, MCP-1也显著减少MIP-3alpha, tnf, INF-gamma表达式,证明中发挥的重要作用的RAS血管炎症实验模型(表3)。

这些结果使我们能够推断出细胞因子的激活是由redox-sensitive方式和不同₁R受体是积极参与细胞因子的表达。

4所示。讨论

本研究的目的是为了测试假说表明RAS的积极参与和氧化应激激活不同的炎症分子的细胞因子,NF -κB, VCAM-1,产生一个微环境,允许心血管重塑(图1)。我们将演示的存在体液在血管炎症标志物水平和转录因子激活,还允许建立一个因果关系AT1R激活。

据我们所知,这是第一个研究表明抗炎效应和抑制AT1R改造进程,坎地沙坦,一个实验模型AT1-R女士阻塞与降级激活的血管炎性机制发现在NF -等代谢综合征模型κB表达或细胞因子激活。另一个重要发现是,超氧化物歧化酶的模拟也有类似的抗炎治疗效果与C,发现虽然较弱和没有有效地恢复血管重建。此外,超氧化物阻碍生产没有克服C保护作用。

实验模型FFHR显示高血压、血脂异常、胰岛素抵抗、血管和心脏重构,演示了通过增加hsCRP和血管炎症炎症增加了NF -κB表达、VCAM-1 proatherogenic细胞因子。VCAM-1表达的增加,如在文献中所讨论的,是一个标志的血管炎症,血管渗透性,内皮功能障碍(18]。

炎症过程中发现这个实验模型不仅局限在血管水平也是系统性的,作为槽hsCRP的表达的增加,在肝脏合成增加il - 6的反应。实验模型显示这种蛋白质的显著增加(19,20.]。

RAS的参与的数据显示在不同的血管炎性蛋白的表达水平,允许建立一个微环境适合创建、延续、发展、和unstabilization血管损伤,是一个简单的富营养的血管重建,或者动脉粥样硬化病变。

一个可能的解释是1型血管紧张素ⅱ受体所扮演的重要角色。通过其细胞内p40亚基,增加NAD (P) H-oxidase活动,产生自由基的增加,细胞外和细胞内水平,和激活不同的介质如PKC瀑布,JAK2, PI3 K, FAK和PLC。这些细胞内信号能够诱导易位p65亚基的NF -κB和AP-1激活(21)与增加细胞因子的合成,在我们的工作。这个激活也可以由氧自由基而不取决于AT1R的激活,但这个答案似乎低人一等,用更少的细胞因子的招聘。另一个重要的点是与胰岛素生长因子(IGF)关系密切的Src。这个信号有利于生长和细胞外基质的重塑,刺激生产等胞内炎症介质的NF -κB或AP-1,放大血管炎症反应22,23]。

这项研究展示了核心作用代谢综合征的病理生理学的RAS。此外,它有助于解释一些在大型临床试验中获得的结果。

这些结果分析我们的问题是超氧化物清除剂是否能恢复一氧化氮的生物利用度还是有另一种机制?这个问题回答。氧化状态不是独特的促炎的分子病理机制参与激活或血管重建,它也需要一个复杂的使者网络,能够增强和扩展内皮激活不同的级联反应不同的细胞参与血管损伤过程。RAS激活阶梯式的增长、细胞分化和促炎的机制,作为一个关键的过程中重建和血管损伤。