文摘

Nanogold或功能化金纳米粒子在医学科学(国民生产总值)无数应用程序。国民生产总值的面积广泛应用于nanodiagnostics和纳米疗法。国民生产总值在分类中的应用研究还没有研究相对于其广泛的医学应用。国民生产总值有很大的潜在领域的综合分类。我们已经意识到国民生产总值可用于视觉检测基于分子特征的动物物种。在这方面,我们有合成金纳米粒子(< 20海里),已经开发出一种方法基于硫醇盐DNA寡核苷酸和小型国民生产总值之间的相互作用,DNA寡核苷酸和目标DNA分子之间的相互作用,和self-aggregating属性下的小型国民生产总值高盐浓度导致可见的颜色变化。利用这些分子间和水条件下颗粒间的相互作用,在目前的工作中,我们演示了我们的应用程序通过使用DNA寡核苷酸探针设计对苹果蠹蛾的线粒体基因组的一部分Cydia pomonella。该方法准确,快速,易于使用的一次设计,可以作为一个额外的工具以及DNA条码技术。这个工具可以用来区分神秘物种,识别morphovariants已知物种的饮食分析和识别害虫检疫设施没有任何需要执行重复的DNA测序。我们建议设计和选择一个非常具体的特异性DNA探针在增加是至关重要的过程。现在的工作可能被认为是一个努力介绍纳米技术作为一个新的学科广泛的综合分类法与古生物学等学科领域,胚胎学、解剖学、动物行为学、生态学、生物化学,分子生物学已经很长一段时间有关。

1。介绍

物种识别分类的核心领域。如今,它已经成为一种趋势识别和研究一种使用形态学和分子数据。特别是当描述昆虫物种,线粒体dna的方法很受欢迎。线粒体DNA DNA条码技术是其中最偏爱的分子工具在现代昆虫分类。对通用引物的设计与线粒体细胞色素氧化酶(mtCO-I)基因领域革命性的分类(1,2]。系统发育分析基于线粒体和核基因的序列提供了一个更高的分辨率在跟踪国际米兰和种内的异同3]。在DNA条码技术作为一种常见的做法,一段mtCO-I放大使用通用引物扩增子的测序和序列分析postsequencing [2]。扩增和测序每个标本的DNA是不可能的。形态相似的标本可能并不总是属于同一物种,但它听起来像一个冗余,nonfeasible,耗时的任务放大和所有标本的DNA序列(当标本的数量非常高)属于同一个物种。应对这种情况,我们已经开发出一种方法,可以快速检测一种基于其分子签名。这个工具将有助于减少重复测序,可以用来验证条形码在资源有限的设置。我们的方法利用功能化金纳米粒子(国民生产总值)和其独特的属性。有一个海啸的文学处理的金纳米粒子在不同领域中的应用生物科学,但我们甚至找不到一个研究处理高等动物的国民生产总值在分类中的应用研究,甚至高等植物。国民生产总值有巨大应用nanodiagnostics和纳米疗法(4,5]。Nanodiagnostic工具基于国民生产总值包括等离子体共振生物传感器、dot-immunoassay,免疫色谱法,不同的同相方法4]。目前工作,我们已经使用,有一些修改,同相的方法,包括互动硫醇盐ssDNA(小单链DNA分子)和小型功能化国民生产总值,硫醇盐之间的交互ssDNA-GNP复合物和目标DNA分子,和颜色变化的解决方案由于聚合粒子高离子强度的条件下6- - - - - -8]。因为基因组序列的公布黑腹果蝇2000年,这是第一个昆虫基因组被测序,大量不同的昆虫基因组已经测序并详细研究[9,10]。而不是大量的昆虫基因组数据的可用性在公共领域,是最多样化的类群与最多的物种在整个动物王国,大量的昆虫物种的基因组信息仍然是不可用的。核基因组的规模远远大于线粒体基因组的大小。它使线粒体基因组被测序用更少的时间和更少的预算和更容易分析。近年来,更多的昆虫线粒体基因组被测序,研究相比,他们的核基因组。线粒体基因组是最广泛研究昆虫基因组系统(11]。因此,在目前的研究中,我们选择了一小段昆虫线粒体基因组的设计一个独特的寡核苷酸作为我们调查的一部分。这个方法被发现准确,快速,易于使用的一次设计,可以作为一个额外的工具以及DNA条码技术。

2。材料和方法

2.1。材料

三水合三氯化金(HAuCl₄.3H₂O)、二水柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)、硼氢化钠(NaBH₄)、硫酸镁(MgSO₄)、溴化乙锭和琼脂糖从西格玛奥德里奇被购买。所有缓冲区都手动准备使用化学物质的分析级。GeneRular 1 kb的DNA梯是购自热科学。微量吸液管技巧,离心管,以及PCR管从Tarsons购买。

2.2。物种选择

苹果蠹蛾的Cydia pomonella是用于我们的研究。寡核苷酸探针和引物的设计与线粒体DNA的一段。棉铃虫蛾Helicoverpa armigera被用作控制。完整的线粒体基因组序列的两种经济重要的飞蛾是公开的和很好的特点。因此,我们首选这些物种的研究。

2.3。线粒体基因组的分析

完整的线粒体基因组序列Cydia pomonella从NCBI检索(国家生物技术信息中心)基因组数据库FASTA格式(代表“高速”)。图形环形和线性映射的线粒体基因组是准备使用OGDRAW从这个序列(Organellar基因组画)和水(线粒体基因组注释服务器)划分基因的位置和方向的开放阅读框架(图1(一))[12,13]。相同的策略控制之后,Helicoverpa armigera(补充图1)。

2.4。线粒体DNA提取

首先,从幼虫组织的线粒体分离Cydia pomonella和Helicoverpa armigera使用先前描述的细胞器隔离协议(14]。在每种情况下,只有一个毛毛虫用于线粒体隔离。分离线粒体的每个物种被用来分离线粒体DNA (15]。96年孤立使用DNeasy血液和组织配套试剂盒。对于每一个物种,线粒体DNA隔离多次执行,所有样本汇集在一起,真空干燥除去多余的水分更好的浓度。孤立的线粒体DNA是由热科学量化使用NanoDrop 2000分光光度计。

2.5。设计的寡核苷酸探针

多个引物对线粒体全基因组序列的生成Cydia pomonella使用NCBI Primer-BLAST(基本局部比对搜索工具)。这些引物,最独特oligonucletide序列选择通过运行NCBI BLAST使用每个引物序列。的序列被认为是“最独特”展览中的至少跨物种序列相似性序列顺序鳞翅目爆炸的结果。这个序列被发现线粒体基因组的缺席近几年来,这是用作控制。这寡核苷酸与硫醇基标记(sh) 5′末端,使其与国民生产总值的结合作为探针(补充图2)。5′thiol-modified寡核苷酸合成25 nM范围内根据标准程序和欧陆坊在冻干的形式提供。

2.6。描述的寡核苷酸探针

寡核苷酸探针的特性,PCR进行。寡核苷酸探针本身作为一个正向引物和反向引物扩增1332基地的线粒体基因组序列Cydia pomonella(图1 (b))。反向引物选择在分析其属性使用IDT OligoAnalyzer对正向引物(16)(补充图2)。引物合成在25 nM范围内根据标准程序和被欧陆坊冻干的形式提供。使用的线粒体DNA进行PCRCydia pomonella作为一个模板。线粒体DNA的Helicoverpa armigera是用作控制。PCR产品运行在0.8%的琼脂糖凝胶含有溴化乙锭可视化紫外线照射下使用凝胶的文档系统。

2.7。合成的国民生产总值

金纳米粒子合成使用两步化学还原方法(其次是减少稳定)17]。短暂的10毫升的1毫米的黄金三水合三氯化(HAuCl₄.3H₂O)解决方案是在一个锥形瓶用银箔和保持电磁搅拌器搅拌。这个解决方案,400年μl 500年μ克/毫升溶液ice-chilled硼氢化钠(NaBH₄)添加drop-wise,持续30秒。然后,200年μl 5%的柠檬酸三钠的溶液二水合物(Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)补充说,留给另一个30秒。Citrate-capped形成的国民生产总值。在这两步方法,减少被添加NaBH实现₄,稳定是由Na₃C₆H₅O₇.2H₂O(图2(一个))。

2.8。描述的国民生产总值

大小分布分析国民生产总值的10倍稀释刚做好的样品是由动态光散射(DLS)使用Zetasizer(英国莫尔文仪器,莫尔文)配备了5 mW氦氖激光器。形态特征,一滴相同的样本是倒在300 -网状碳涂层在室温下铜网格和干之前加载到成像的透射电子显微镜(TEM),这是通过使用一个高分辨率透射电镜(TECNAI T20G2, TEM,范,Inc .,希尔斯堡惨案,或者美国)在200千伏。同一样品的吸光度是决定使用一个进化220紫外可见分光光度计(热科学)。样品的颜色也被记录下来。的摩尔浓度计算的国民生产总值也使用样品的吸光度计算在450 nm,如上和消光系数的值决定的国民生产总值在450海里,为具体的粒度,之前报道(18]。这个计算提供了一个平均的估计的摩尔浓度计算的国民生产总值。

2.9。制备GNP-Oligonucleotide共轭

接合GNP-oligonucleotide是使用一个方法执行修改从先前的研究8,19,20.)(图3(一个))。两组共轭反应混合物准备。一组反应混合物有1μM的寡核苷酸探针1毫升的国民生产总值和另一组有一个0.5的解决方案μM的寡核苷酸探针1毫升的国民生产总值的解决方案。两个反应混合物准备敏感性的比较在检测不同浓度的配合。反应混合物都保持在轨道振动器和孵化一夜之间在50°C。每个反应混合物,磷酸盐缓冲剂、SDS和氯化钠溶液添加到获得的最终浓度10毫米(pH值7.4),0.01%(重量/体积)和0.1 M,分别,他们在一个轨道的孵化瓶50°C 48小时。孵化后,反应混合物都是离心机在4°C 15000 rpm 30分钟洗两次与洗涤缓冲紧随其后。100毫米磷酸盐缓冲盐水洗涤缓冲(PBS) (0.01% SDS和100毫米氯化钠)。GNP-oligonucleotide共轭终于resuspended在相同洗涤缓冲和储存在4°C在黑暗。

2.10。表征GNP-Oligonucleotide共轭

GNP-oligonucleotide共轭样品的吸光度测定使用一个进化220紫外可见分光光度计(热科学)的吸光度并与非结合的国民生产总值。类似的方法来描述其他工人也被使用(20.,21]。

2.11。与线粒体DNA杂交的GNP-Oligonucleotide共轭

杂交和优化基于以前的研究的生物分子进行一些修改(8,22]。杂交反应混合物是由混合20μl 50毫米的Cydia pomonella线粒体DNA和20μl GNP-oligonucleotide共轭的PCR管。杂交反应混合物被放置在孵化5分钟thermoshaker预热95°C,其次是孵化为进一步5分钟在63°C杂交。杂交后,6μl以上的混合物能整除的为6种PCR管。后来,盐浓度的优化,6个不同浓度的硫酸镁(MgSO₄),即3毫米,15毫米,30毫米,60毫米,80毫米,100毫米,被添加到每个上述反应混合物,分别。Milli-Q水用作负控制代替Cydia pomonella线粒体DNA的杂交混合物。红色或粉红色的改变表明积极的结果,而蓝色的颜色变化显示阴性结果,可观察到的视觉。评估的敏感性和特异性GNP-oligonucleotide配合也是一个优化的一部分。评估的灵敏度GNP-oligonucleotide共轭,6个不同浓度的Cydia pomonella线粒体DNA是准备使用串行稀释,即5 ng /μ10 ng / lμ20 ng / lμ30 ng / lμ40 ng / lμ50 ng / l,μl。每个DNA浓度与GNP-oligonucleotide用于杂交共轭在单独的PCR管。杂交后,一个优化MgSO的浓度₄添加的颜色解决方案被记录。消极的控制,Milli-Q水添加的DNA。同样,评估GNP-oligonucleotide共轭的特异性,50 ng /μl的线粒体DNACydia pomonella和Helicoverpa armigera在单独的PCR管与GNP-oligonucleotide共轭杂化。杂交后,一个优化MgSO的浓度₄添加的颜色解决方案被记录。

3所示。结果

3.1。线粒体DNA的量化

21 ng / Nanodrop测量提供一个值μl为Cydia pomonella线粒体DNA和18 ng /μl为Helicoverpa armigera线粒体DNA。

3.2。描述的寡核苷酸探针

凝胶图像显示成功目标后段DNA PCR的扩增。明亮的DNA带可见的PCR产物Cydia pomonella线粒体DNA模板使用。没有放大的情况下Helicoverpa armigera线粒体DNA模板,用作负控制(图1 (c))。

3.3。描述的国民生产总值

国民生产总值被发现的大小分布由Zetasizer测量(图13海里透露2 (c))。透射电镜成像显示,这些粒子是球形的形状(图2 (c))。紫外可见光谱光度测量的数据显示曲线的峰值在524 nm,最大吸收值的粒子(图2 (b))。国民生产总值的颜色被发现(图红色的解决方案2 (b))。此外,样品的吸光度1.85 450海里被发现,球形的消光系数计算的国民生产总值在450 nm 13海里发现粒径为1.39×10⁸米⁻¹厘米⁻¹从先前发表的报告18]。使用这些值,计算国民生产总值为13.3 nM的摩尔浓度。这个值是平均估计,而不是一个绝对的量。因此,对于结合实验,国民生产总值在体积(ml)的摩尔浓度。

3.4。表征GNP-Oligonucleotide共轭

紫外可见光谱光度测量的测量显示转变峰从524 nm的非结合的国民生产总值为539.50 nm的GNP-oligonucleotide共轭。这红移证实接合(图的过程3 (b))。

3.5。优化MgSO₄浓度

杂交的GNP-oligonucleotide共轭(准备使用0.5μ寡核苷酸探针)Cydia pomonella线粒体DNA是紧随其后的是添加6不同浓度MgSO₄正如上面提到的。消极的控制,Milli-Q水代替Cydia pomonella线粒体DNA。用30 mM, 60毫米,80毫米和100毫米MgSO₄,Cydia pomonella可以清楚的区分出负控制(图4(一))。100毫米被选为最优MgSO的浓度₄。

3.6。评估GNP-Oligonucleotide共轭的敏感度

在不同的浓度Cydia pomonella线粒体DNA用于杂交GNP-oligonucleotide共轭,20 ng /μ30 ng / lμ40 ng / lμ50 ng / l,μl添加MgSO后仍然是红色的₄,而其他解决方案与低浓度的DNA和DNA的消极控制在地方Milli-Q水变成了蓝色。因此,检出限20 ng /被发现μl为Cydia pomonella线粒体DNA。也,GNP-oligonucleotide轭合物,准备使用1μ用0.5 M寡核苷酸探针和其他μ寡核苷酸探针,显示类似的结果与不同浓度的目标DNA。这两个目标检测(数据配合同样敏感4 (b)和4 (c))。因此,我们选择使用0.5 GNP-oligonucleotide共轭准备μM寡核苷酸探针特异性评估这个过程。

3.7。评估GNP-Oligonucleotide共轭特异性

的特异性GNP-oligonucleotide共轭被线粒体DNA的杂交轭合物的评估Cydia pomonella和Helicoverpa armigera单独。线粒体DNA的Cydia pomonella显示成功添加MgSO后杂交₄作为解决方案仍然是红色的。解决方案包含的线粒体DNAHelicoverpa armigera添加MgSO后变成蓝色₄,表明没有杂交(图4 (d))。

4所示。讨论

每种方法都有一些优点和缺点。耗时和昂贵的,虽然被认为是黄金标准,利用DNA条码技术为每一个相似的已知物种的标本听起来像一个多余的运动。使用简单和廉价的工具由我们开发的可用于快速检测物种只是解决方案的通过观察颜色视觉的重复DNA测序过程和不使用昂贵和难以处理的工具(图4 (e))。一旦准备好,GNP-oligonucleotide共轭在室温下是稳定的近一个月,可以存储在4°C较长的时间,多种用法,使这种方法具有成本效益的如图所示由其他硫醇盐ssDNA-GNP complex-based方法之前发表(23]。这个方法可以进一步用于验证DNA条形码通过提供额外的证据在更短的时间内物种的分子的身份。本方法具有巨大的潜力与物种识别在各种应用程序。这个方法可以用来区分神秘的物种。这样的物种出现形态相似但基因不同。与此相反,一些物种表现出多态性。Morphovariants物种的形态不同,但在基因上是相同的身份。这些人可以确定使用这个方法。这种方法可以用于快速识别害虫物种隔离设施。使用这种方法,动物和植物物种被其他动物吃食物也可以识别(饮食分析)。 The method is sensitive and specific. The present method is a simple demonstration of a procedure in its preliminary stage, which could be made more robust and error-proof by adopting a few modifications, which are discussed in the subsequent paragraph.

该方法的特异性是高度依赖于独特的寡核苷酸探针序列。我们使用线粒体DNA寡核苷酸探针设计的核基因组序列大多数昆虫并不可用,大多数昆虫的DNA条码技术也依赖于mtCO-I序列。但专门设计一个独特的寡核苷酸探针基于线粒体基因组并不总是可能的,因为它体积小,没有内含子,和保护线粒体基因的分类单元。同时,横向支撑的可能性对线粒体DNA寡核苷酸探针设计与不能排除核DNA(当核基因组序列不可用)。这就是为什么我们选择性地提取线粒体DNA(不含核DNA)。核真核生物的基因组是巨大的规模和物种内以及各地差别很大。使用生物信息学工具,可以设计这样一个寡核苷酸探针的序列是一个特定的独有真核物种通过扫描整个基因组(核和线粒体)。这种独特的探头可以共轭与国民生产总值和进一步用作描述我们的方法。使用这样的探测器将使这个方法非常具体的微不足道的检测失败或错误检测的机会。同样的,该方法的敏感性,可以进一步增强使用超纯GNP -寡核苷酸共轭。 The conjugate solution prepared by us was purified (washed to remove unbound particles) using multiple rounds of centrifugation at high speed, but it cannot be ruled out as it may have negligible amounts of unbound GNPs or free oligonucleotides or both. To get an ultrapure conjugate solution with no unbound GNPs and free oligonucleotides, advanced chromatographic methods can be used after the centrifugation step. These methods can also provide estimates of the respective percentages of GNP-oligonucleotide conjugate, unbound GNPs, and free oligonucleotides in solution [8]。

分类的核心是理解生物多样性。像其他学科一样,分类也显著进步从传统的morphology-based方法变成一个现代多源的方法。现代方法不能减少传统morphology-based方法的重要性,而是加强了。现代多源的方法是等各种来源的信息形态、行为,线粒体DNA,核DNA,生态学、酶、化学、生殖兼容性、细胞遗传学、生活史和全基因组扫描。这样一个源方法的支柱综合分类,合成不同的传统和现代的方法。综合分类法减少误认的可能性和其他分类错误,使得识别的过程更容易,更有效,更可靠。古生物学、胚胎学、解剖学、动物行为学、生态学、生物化学和分子生物学研究的主要领域与重要应用程序在综合分类法24,25]。而不是巨大的发展领域的综合分类,纳米技术在这一领域的应用尚未意识到,与其他受欢迎的学科。在生物科学,纳米技术正在成为一个伟大的工具与巨大的潜力。生物纳米技术在不同领域中的应用已经在探索。Nanodiagnostics(包括nanodetection nanoimaging和nanoanalytics)和纳米疗法,这是纳米的分区,是最喜欢的生物科学领域的应用纳米技术正在探索的今天26]。重点是再生医学、癌症诊断和治疗,神经工程、组织工程、biosurfectants的发展,生物医学纳米传感器,提高生物利用度和生物活性的药物,病原体检测、干细胞生物学、分子成像(27- - - - - -32]。的一些非医学应用纳米技术的发展包括农药、除草剂、化肥nanoformulations;病虫害和农药纳米传感器的设计;nanodevices对基因工程的发展,作物改良,和动物育种;增加收获作物的保质期;和建立仿生材料(33- - - - - -36]。而不是巨大的纳米技术的应用,在综合分类中的应用尚未意识到。我们认为,纳米技术也有巨大的潜力领域的综合分类。这个新领域的话语可能被称为“nanotaxonomy。“现代分类可以添加新的维度研究如果系统地探讨。

5。结论

在目前的研究中,我们报告一种新型检测方法基于他们的昆虫分子签名通过使用GNP-oligonucleotide共轭可以区分一个物种从另一个通过一个简单的颜色的变化可以通过肉眼观察到的解决方案。使用线粒体基因组序列为探针设计独特的策略。这种方法可以帮助节省时间和金钱都花在重复的条码显然类似实验标本。该方法具有灵敏度高(检出限= 20 ng /μl)和特异性。该方法的特异性可以进一步加强设计一种独家调查微不足道的跨物种相似性采用全基因组扫描通过先进的生物信息学工具辅助。目前的工作可能会被视为一个小一步缩小现有的综合分类法和纳米技术之间的差距。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和补充材料。

信息披露

这项工作提出了作为海报的Ento 21会议举办的皇家昆虫学协会(RES),伦敦,从23^{理查德·道金斯}2021年8月27日^th2021年8月。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢博士Subhash Yadav,解剖学系,全印度医学科学研究所(全),新德里,允许他们访问电镜设施和其他实验室仪器精密先进的仪器设备,全印度医学科学院,新德里,学业。作者还要感谢Yashaswee Mishra先生,贾瓦哈拉尔·尼赫鲁大学生命科学学院新德里,帮助他们与科学输入有用的研究;承认,伦敦,为他们提供机会参与和现在这个工作在Ento 21岁,感谢Beilstein-Institut其预印本服务器上上传他们的手稿,Beilstein档案(https://www.beilstein-archives.org/xiv/preprints/202215)[37]。

补充材料

补充图1。线性化的线粒体基因组地图Helicoverpa armigera。补充图2。设计的寡核苷酸探针对线粒体基因组的一部分Cydia pomonella和PCR引物的表征。DNA片段的序列被放大显示在5′,3′方向。探针的序列,也正向引物,所示红色字母,反向引物所示绿色。(补充材料)