文摘

客观的。本研究的目的是调查如果脱屑口腔上皮细胞(DOECs)表达表皮生长因子(EGF),如果这些细胞从而可能导致唾液EGF的内容。背景。DOECs最近港口抗菌肽LL-37,提议,他们也可以存储其他重要的生物唾多肽/蛋白质。EGF肽是一种生长因子,维持上皮完整性中起着至关重要的作用,促进上皮愈合。表皮生长因子是由唾液腺,但尚不清楚是否DOECs包含表皮生长因子,从而促进唾液EGF水平。材料和方法。DOECs被隔绝如果全唾液收集从四个健康志愿者。EGF蛋白表达决心在细胞溶解产物点污点和ELISA。细胞角蛋白细胞分布,扩散Ki67标志,并通过免疫细胞化学EGF免疫反应性进行了评估。表皮生长因子基因表达被qPCR调查。在DOECs EGF的表达转录和蛋白质相比,在人工培养的角化细胞细胞系(HaCaT)细胞。结果。发现EGF蛋白表达在DOEC细胞溶解产物点污点和ELISA。细胞质在DOECs观察EGF免疫反应性强,尽管一些细胞显示只对EGF免疫反应性的弱信号。此外,除了含有DOECs EGF蛋白,也表达了对EGF的成绩单。有趣的是,ELISA分析显示,在DOECs EGF蛋白含量都高于在HaCaT细胞。ELISA分析还透露,EGF浓度大约是在整个唾液DOECs相比高出10倍。EGF转录表达低约50%在HaCaT细胞刺激高(10%)相比(0.1%)胎牛血清的浓度低,代表长出来和growth-restricted条件,分别,这意味着增长刺激产生负面的反馈在HaCaT细胞表皮生长因子基因活性。结论。这里,我们首次展示DOECs表达EGF,认为这些细胞有助于唾液EGF含量,因此可能发挥作用在牙龈上皮修复和伤口愈合。

1。介绍

脱屑上皮细胞和白细胞,主要是中性粒细胞,构成人类全唾液的细胞成分(1- - - - - -4]。值得注意的是,白细胞的数量很低在唾液从个人健康的齿龈,因此,脱屑上皮细胞代表整体的主要细胞类型从健康人唾液收集2]。脱屑口腔上皮细胞(DOECs)是大型细胞,它们显示在上皮细胞形态典型的迹象如小核和细胞质(大5,6]。我们以前证明DOECs港人类抗菌肽LL-37,表明这些细胞也可以合成和/或作为其他生物重要的容器唾肽和蛋白质(6,7]。

表皮生长因子(EGF)是由53个氨基酸组成的肽分子量的蛋白水解产生的6 kDa乳沟185 kDa proform [8]。它是公认的乳沟185 kDa EGF proform生成许多较小的产品(40 - 100 kDa),但进一步形成了成熟的过程,循环6 kDa EGF肽并不完全理解。EGF表达在许多不同的细胞类型,它存在于体液如血浆、尿液和唾液(9- - - - - -11]。肽最初从组织中提取分离的小鼠颌下腺,发现促进门牙喷发和刺激新生小鼠眼睑打开科恩(12]。从那时起,EGF已经证明人类颌下和腮腺组织(13,14]。没有性别差异的报道在人类整个唾液EGF水平,此外,任何更改在唾液EGF浓度与咀嚼(10,14]。有趣的是,它最近报道,人类培养角化细胞细胞系(HaCaT)细胞表达EGF信使rna和蛋白质,他们显示基底,EGF的本构释放介质(15]。HaCaT细胞是高度增殖的角化细胞,容易文化,因此,他们适用于研究基因和蛋白质调控在细胞培养实验。

EGF作为生长因子,刺激上皮细胞增殖通过绑定和质膜受体的激活表皮生长因子受体(16,17]。配体结合后,表皮生长因子受体被激活,EGF、EGFR复杂具有酪氨酸激酶活性代表早期介入下游EGFR信号级联(16- - - - - -19]。已经提出,唾液EGF保持食管粘膜的完整性和促进愈合和修复胃肠粘膜,因此,唾液EGF可能发挥口头proproliferative效果也更胃肠道的远端部分(10,20.,21]。

本研究的目的是探讨EGF的表达在DOECs隔绝如果人类全唾液评估如果口腔上皮细胞可能导致唾液EGF的内容。在这里,我们表明,DOECs表达EGF信使rna和蛋白质,而且,我们表明,由人类角化细胞EGF的表达成绩单HaCaT细胞与经济增长负相关的刺激。综上所述,这些研究结果表明,DOECs促进整个唾液EGF含量,表明DOECs可能采取行动,保护牙龈上皮结构和功能。

2。材料和方法

2.1。隔离DOECs HaCaT细胞从全唾液和文化

如果全唾液收集从四个系统健康,不吸烟的志愿者(27-60岁),和DOECs孤立如前所述[6]。志愿者的牙周状况和使用的药物。所有四个人(三名女性和一位男性)提供知情同意,并按照瑞典接受了手术治疗伦理审查机关指示和世界医学协会1964年赫尔辛基宣言。从每个细胞被孤立在多个场合保持DOECs供应充足。志愿者口角两毫升唾液塑料管在早上大约9点钟,至少一个小时后进食。唾液的样品稀释1:4 0.1%二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich)准备在磷酸盐(PBS Gibco)解聚黏蛋白,降低粘度允许DOECs隔离。唾液样本与60尼龙网过滤器过滤μ米孔隙大小(默克密理博),然后轻轻离心机速度慢(82 )在20°C 5分钟颗粒细胞。细胞颗粒洗一次PBS和下面的段落中描述的细胞数。对于每个个体,唾液中的细胞(细胞/毫升)数量约为400000(捐赠1),400000(捐助2),50000(供体3),和180000年(供体4)。唾液细胞密度的变化观察不同时间的样品为每个单独的集合,但个体之间的比例关系是一致的。DOECs被用于测定总蛋白浓度,点污点分析、免疫细胞化学、ELISA分析和qPCR中描述下面的段落。

人类角化细胞细胞系HaCaT细胞从CLS细胞系购买服务GmbH是一家和DMEM /火腿的F12培养基培养(1:1,擤鼻涕)补充10%胎牛血清(的边后卫,Biochrom)和抗生素(50 U /毫升青霉素和50μg / ml链霉素,Biochrom)。在培养皿中培养的细胞(VWR)和文化板块(Sarstedt)和保存在一个水套细胞孵化器在37°C下5%的股份有限公司₂在空气中。他们使胰蛋白酶化(0.25% trypsin-EDTA解决方案,Sigma-Aldrich),然后到达融合交汇于60 - 80%,用于实验。评估增长和扩散表皮生长因子表达的影响,实验下growth-restricted(0.1%的边后卫)或长出来的边后卫(10%)的条件。HaCaT细胞用于测量总蛋白浓度,ELISA分析和qPCR如以下部分所述。

2.2。细胞计数和血清总蛋白浓度测定

DOECs HaCaT细胞和锥虫蓝染色(Sigma-Aldrich)和计算使用自动细胞计数(卢娜、标识生物系统)。测定总蛋白浓度,DOECs HaCaT细胞被洗在PBS, HaCaT细胞刮掉底部的文化在冰冷的PBS使用细胞刮刀(Sarstedt)和离心机(82 ,4°C, 5分钟)。DOEC HaCaT细胞溶解产物被声波降解法在冰冷的PBS (2×10 (s)和总蛋白质含量在整个细胞溶解产物和唾液决心使用Bio-Rad直流蛋白质分析工具包(Bio-Rad)。每个样本重复进行了分析。

2.3。点污点

DOECs细胞溶解在SDS样本缓冲区,和细胞溶解产物都用2×10 s。细胞溶解产物保存在冰前10分钟,煮5分钟离心(16000 )在4°C,持续15分钟。上层清液收集,总蛋白浓度是确定每个样本(Bio-Rad直流蛋白质化验设备)在每个点保证平等的加载。对于每一个点,1μl细胞溶解产物被加载到一个硝基膜。0.5%酪蛋白的膜被封锁Tris-buffered盐水(Bio-Rad) 2 h,孵化隔夜的兔多克隆抗体EGF(罗福斯生物制品,目录# nbp1 - 198006 - ss)的稀释1:1200年,然后用辣根孵化peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白的稀释1:5000 2 h(细胞信号传导、目录号7074)和西方毫微微化学发光试剂(热费希尔科学)。EGF免疫反应性是可视化使用LI-COR奥德赛FC仪器(LI-COR生物科学)。

2.4。免疫细胞化学

DOECs分散在PBS、计算和使用cytospin离心450转移到显微镜载玻片6分钟(每点5000个细胞)。在盖玻片HaCaT细胞培养。这些细胞被固定在4%多聚甲醛(Polysciences) 10分钟,permeabilized 0.2% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich) 10分钟,然后用2%牛血清白蛋白孵化(Sigma-Aldrich) 2 h阻止未指明的结合位点。细胞被孵化一夜之间在4°C兔多克隆抗体EGF(罗福斯生物制品、目录号nbp1 - 198006)的稀释1:10 0,兔多克隆抗体Ki67 (Abcam、目录号ab15580)的稀释1:50 0,和鼠标单克隆细胞角蛋白抗体(Dako、目录号M082101-2)的稀释1:400,其次是孵化1 h和anti-rabbit anti-mouse免疫球蛋白共轭ALexa萤石488(热费希尔科学)检测的免疫反应性的信号。盖玻片被安装在显微镜幻灯片使用安装介质含有核DAPI标记(Fluoroshield Sigma-Aldrich)。免疫反应性和DAPI染色法是评估使用荧光显微镜(奥林巴斯BX60)以适当的过滤器设置。消极的控制,主要的抗体被省略了。 No immunoreactivity was observed after omission of the primary antibody.

2.5。ELISA

DOEC HaCaT细胞颗粒分散在冰冷的PBS。使用自动卢娜的细胞计数细胞计数器,之后用(2×10 (s)。细胞溶解产物离心机(1310 ,4°C, 5分钟),收集上清液进行ELISA分析。ELISA分析也表现在如果全唾液。使用Quantikine ELISA进行ELISA人类EGF免疫测定推荐的制造商(研发系统、目录号DEG00)。数据归一化细胞的数量和总蛋白浓度(Bio-Rad直流蛋白质化验设备)。每个样本重复进行了分析。

2.6。实时定量rt - pcr

DOECs HaCaT细胞细胞溶解在QIAzol裂解试剂和RLT裂解缓冲,分别从试剂盒(),和RNA提取和纯化使用RNeasy工具包和QIAcube平台根据制造商的指示(试剂盒)。DNase 1在场中提取和纯化的RNA根据指令(试剂盒)。RNA浓度和质量研究通过使用NanoDrop 2000 c分光光度计(热费希尔科学)。QIAzol已成功被用作细胞裂解试剂RNA的提取和纯化细胞颗粒的人类全唾液(22]。基因表达决心与一步qPCR StepOne +实时热循环(应用生物系统公司)使用QuantiFast SYBR绿色rt - pcr试剂盒(试剂盒)和QuantiTect底漆化验,和基因表达应用δ计算周期阈值(Ct)方法和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)或18 s核糖体RNA基因(18岁)作为参考根据Pfaffl [23]。每个样本重复进行了分析。引物对EGF (Hs_EGF_1_SG) GAPDH (Hs_GAPDH_2_SG)和18 s (Hs_RRN18S_1_SG)购买的试剂盒。没有或不足在消极控制放大观察RNA被RNase-free取代水(试剂盒)。所有目标的Ct值RNase-free水和RNA样本DOECs和HaCaT细胞呈现在表1。

2.7。统计数据

总结数据意味着±SEM。统计学意义是由学生的双尾计算t测试单两组之间的比较(GraphPad Prism9和GraphPad软件)。值小于0.05被认为表示统计学意义。

3所示。结果

3.1。点状披露EGF免疫反应性在DOEC细胞溶解产物

在第一个实验中,我们准备好的细胞溶解产物DOECs收集到三的四个人包括在这项研究中使用点污点和评估这些溶解产物的免疫反应性。点污点分析,观察EGF免疫反应性细胞中获得所有三个个体,而空白是消极预测(图1)。

3.2。DOECs细胞质表达EGF免疫反应性

在接下来的实验中,我们评估了EGF表达DOECs免疫细胞化学。相同的细胞双使用核核标记DAPI染色和EGF免疫反应性。见图2,DOECs大细胞和小核,像之前描述的那样广泛的细胞质(6]。强劲的EGF免疫反应性检测在许多细胞的细胞质中,而一些细胞胞质信号(数字显示疲软2(一个)- - - - - -2 (c))。表皮生长因子的免疫反应性的信号是分布在整个EGF阳性细胞的细胞质(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。很弱或没有核观察EGF免疫反应性(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。没有免疫反应性观察EGF后遗漏的主要EGF抗体(数字2 (d)和2 (e))。DOECs由口腔角质细胞,在接下来的实验中,我们比较EGF蛋白和基因表达与人类的角化细胞的细胞系DOECs HaCaT细胞。首先,我们评估表达式DOECs和HaCaT细胞角化细胞标志物细胞角蛋白的特征。胞质细胞角蛋白的免疫反应性是观察DOECs和HaCaT细胞,但一些DOECs只显示弱染色(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。

3.3。ELISA分析表明,DOECs包含EGF蛋白

接下来,我们执行的ELISA EGF水平相比,细胞溶解产物DOECs和EGF与HaCaT细胞。EGF水平细胞溶解产物是规范化的细胞(图4(一))和总蛋白浓度(图4 (b))。ELISA分析表明,DOECs隔绝所有四个志愿者包括在这项研究包含了EGF蛋白(数字4(一)和4 (b))。有趣的是,EGF含量高出几倍的DOECs HaCaT细胞相比,都表达了每个细胞(图4(一)每毫克)和血清总蛋白(图4 (b))。此外,我们决定在如果全唾液EGF浓度比较。见图4 (c)总蛋白浓度、EGF浓度、规范化,是关于在全唾液DOECs相比高出10倍。

3.4。DOECs表达EGF的成绩单

在接下来的实验中,我们评估mRNA水平在DOECs EGF和比较他们在HaCaT表皮生长因子基因表达与细胞使用qPCR分析获得的Ct值。低和高的Ct值目标基因代表高和低的基因表达,分别。重要的是,发现表皮生长因子基因的mRNA DOECs隔绝的四个志愿者包括在研究数据5(一个),5 (d),5 (e))。值得注意的是,表皮生长因子基因的Ct值高相比,DOECs HaCaT细胞(图5(一个))。DOECs Ct值也高于HaCaT细胞的糖酵解相关GAPDH和核糖体18岁参考基因,这意味着减少代谢和细胞生存能力在DOECs(数字5 (b)和5 (c))。表皮生长因子基因表达的分析,应用Ct方法和δPfaffl方程(23),表明EGF mRNA水平,规范化GAPDH或18岁参考基因,是高DOECs相比HaCaT细胞(数字5 (d)和5 (e))。

3.5。长出来的表皮生长因子基因表达较低比Growth-Restricted HaCaT细胞

自EGF调节上皮细胞增殖和整体基因表达低DOECs HaCaT细胞相比,我们选择评估刺激增长的影响在HaCaT细胞表皮生长因子基因表达。在这些实验中,FBS-free培养基中的细胞preincubated 8 h标准化实验条件,孵化前的24小时中与低(0.1%)或高(10%)的浓度的边后卫,分别代表growth-restricted和长出来的条件。有趣的是,刺激表皮生长因子基因表达与经济增长负相关,也就是说。的边后卫浓度(图6(一))。表皮生长因子mRNA水平低约50%与10%的边后卫比细胞细胞刺激孵化的边后卫(图的0.1%6(一))。接下来,我们评估细胞数量和总蛋白浓度在细胞溶解产物确认FBS-induced HaCaT细胞增长的刺激。刺激有10%的边后卫增强细胞约50%数量和总蛋白浓度约2乘以0.1%的边后卫,证明10%的边后卫触发HaCaT细胞增殖(数据6 (b)和6 (c))。最后,我们与扩散进行免疫染色标记Ki67评估HaCaT刺激细胞增殖,以应对与0.1或10%的边后卫24 h。核染色观察Ki67的细胞刺激的边后卫(图0.1和10%7(一)- - - - - -7 (d)),但Ki67更强烈的免疫反应性的信号刺激细胞相比有10%的边后卫刺激的边后卫(数据为0.1%7(一)- - - - - -7 (d))。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们首次展示DOECs包含EGF,建议他们可以促进整个唾液的EGF含量。我们证明,使用点污点、免疫细胞化学和ELISA, DOECs包含EGF蛋白,此外,我们还表明EGF DOECs mRNA表达,因此,他们可能有表皮生长因子基因活性。值得注意的是,EGF免疫反应性是显示在DOECs主要使用两种不同的EGF抗体,一个点状和免疫细胞化学的,另一个用于ELISA分析,因此,EGF蛋白检测DOECs利用许多不同的技术和多个主要EGF抗体,加强我们的观察。如前所述,我们用不同的方法(点状、免疫细胞化学和ELISA)检测在DOECs EGF。有趣的是,我们观察到类似的EGF表达DOECs孤立于不同个体包括在这项研究中使用这些技术。免疫细胞化学允许我们评估细胞EGF的本地化,而点污点和ELISA方法来确定敏感表皮生长因子EGF免疫反应性和绝对浓度。在目前的研究中,蛋白质印迹没有用于评估EGF的表达。这种方法的优点是它分离蛋白质/多肽的电荷和大小,因此,它允许识别感兴趣的蛋白质/肽的免疫反应性高特异性。然而,由于表皮生长因子的产生是185 kDa proform处理的6 kDa EGF肽生物活性,免疫印迹产生许多EGF免疫反应性的乐队,因此,很难得出结论这是相关和重要的一个,代表一个主要缺点。

重要的是,EGF表达DOECs了蛋白质和mRNA水平。因此,它是合理的,角质细胞产生EGF,至少当他们在口腔黏膜内的自然环境。透露,重要的是,ELISA分析DOECs含有更多EGF蛋白相比,人类的角化细胞细胞系HaCaT细胞,每个细胞表达和每毫克总蛋白,这表明DOECs可能绑定和/或内化外源唾液EGF,脱皮后可能产生的唾液腺,当他们出现在唾液。此外,我们表明,唾液EGF浓度远高于整个DOECs相比,这意味着尽管DOECs可能导致总唾液EGF,比DOECs唾液EGF主要来自其他来源。

有趣的是,一些DOECs显示强烈的免疫反应性的EGF在细胞质染色,而其他人只具有弱EGF信号,暗示有两种不同人群DOECs出现在人类的唾液,由细胞富含EGF和那些含有少量的肽。重要的是,EGF免疫反应性DOECs分布在整个细胞质而不是集中到质膜和细胞的外表面,认为EGF不是绑定到细胞表面,但最好是生产和/或细胞内化。值得注意的是,我们可以得出这个结论,因为细胞permeabilized当准备免疫细胞化学。此外,我们认为它是合理的提出,DOECs自发释放肽,尽管DOECs也可能导致唾液表皮生长因子通过细胞溶菌作用的内容。

它最近被报道,HaCaT细胞表达EGF转录和蛋白质,在目前的研究中,我们确认这些发现(15]。HaCaT细胞被广泛用于研究功能性质口腔角质细胞的健康和疾病,他们被认为是代表人类角质细胞原位(24- - - - - -27]。在这里,我们表明,表皮生长因子基因表达在growth-restricted更高比长出来HaCaT细胞,这意味着表皮生长因子基因的转录活动与经济增长负相关的刺激。因此,长出来的表皮生长因子基因活性低,我们观察细胞可能反映了一个负面的反馈机制可能函数来减少EGF生产和角化细胞增殖,通过旁分泌机制。

牙龈上皮,DOECs港和EGF转移到受损区域的上皮,肽可以被释放,也有助于维护上皮细胞的完整性和增强上皮愈合(28]。有趣的是,periodontitis-associated病原体P。gingivalis已表现出抑制EGF-induced上皮细胞增殖和迁移,提供一个潜在的机制,可以负责减少在牙周炎牙龈愈合和组织损伤29日]。在这种背景下,值得注意的是,志愿者的牙周状况包括在这项研究不确定,代表了一个限制。此外,我们不评估如果他们吸毒,表示这项研究的另一个限制。值得注意的,药物可以影响唾液的体积和质量也可能DOECs的数量。自EGF刺激上皮细胞增殖,促进口腔上皮修复和改善口腔健康通过这种机制。因此,补充外源性EGF可能有利于口腔健康的影响,尽管有一个不必要的风险EGF-induced刺激上皮细胞增殖。有趣的是,减少干燥综合征患者的唾液EGF水平似乎与降低口腔health-associated生活质量(30.]。

总之,我们断定DOECs港EGF,我们建议这些细胞有助于唾液EGF含量,因此在维护牙龈上皮完整性中发挥作用和/或刺激牙龈上皮修复过程。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

亚历山德拉Aidoukovitch, Sara Bodahl,艾伦Tufvesson, Bengt-Olof尼尔森促成了本研究的设计和规划,执行实验,进行数据的分析和解释,写的手稿。所有作者都阅读和批准了最终版本的手稿。

确认

本研究支持由Folktandvarden史,阿尔弗雷德Osterlund基金会瑞典牙科学会和皇家地形学的社会。