文摘

目的。我们调查的长期影响暴露于集中生长因子(cgf)牙髓干细胞的再生性质(DPSCs)的存在和缺乏脂多糖(LPS)作为促炎的代理。方法。DPSCs CGF是培养在不同浓度的有限合伙人(0.1、1和10µg / ml) 21天。然后,利用MTT和化验,检查细胞生存能力和迁移。成骨的刺激评估了碱性磷酸酶(ALP)染色和天狼星红染色,分别确定高山活动和胶原蛋白水平。成骨的标记的表达水平量化使用中存在的方法。单向方差分析(方差分析)和图基HSD测试被用于分析不同组。结果。长期治疗的DPSCs cgf减少LPS-induced细胞死亡。此外,作为和有限合伙人(1µg / ml),无论是单独或组合,提高了DPSC迁徙能力和显著增加引起成骨的刺激通过upregulation胶原蛋白水平和高山的活动。此外,cgf显著调节RUNX2、DSPP OCN,和OPN mRNA水平(如成骨的标记),而有限合伙人(1µg / ml)只有OCN超表达明显增加。结论。CGF我们的发现证据表明,可能是一个有前途的代理在长期慢性炎症诱发完成复杂的治疗。

1。介绍

炎症牙髓和根尖牙周炎是常见的慢性炎性口腔疾病主要是由微生物感染引起1,2]。为了应对微生物产品、纸浆可以刺激免疫反应,发生在纸浆炎症3]。尽管它对牙髓的不利影响,低度炎症对完成复杂的治疗是至关重要的。促炎的监管者刺激牙髓干细胞(DPSC)分化odontoblast-like细胞并导致矿化的牙4,5]。然而,严重的炎症可防止组织的再生,这两相的生物反应称为炎症毒物兴奋效应(6]。尽管各种治疗方法(例如,apexification和顶端屏障技术),慢性炎症往往仍在纸浆,诱导正常组织的不断损失和损害天生的修复能力(7]。这些问题表明发展中重要性的牙髓再生的新途径,从而重建pulp-dentin结构正常的功能在维持牙髓活力。

干细胞被认为是一种珍贵的资源开发和再生组织由于其特定的功能,如自我更新、分化、和可塑性8]。成年干细胞的活动是受先天遗传编程和刺激/抑制性信号来自环境。这些细胞在出生后出现不健康或受伤组织再生(9]。值得注意的是,DPSCs代表丰富的多功能间叶细胞祖细胞,帮助替换成丢失(10]。虽然这些细胞表明高multipotency和增殖能力,缺点在这些细胞的临床应用报道。生物医学工程创新支架和生物材料可以改善这些干细胞的细胞生存、分化和治疗效果在牙髓再生(11]。

集中生长因子(cgf)是最新一代的血小板浓缩产品的致密纤维蛋白矩阵包含各种生长因子,包括血小板源生长factor-BB (PDGF-BB),转化生长因子β1 (TGF -β1),胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)、血管内皮生长因子(VEGF)和基本的纤维母细胞生长因子(bFGF)。bioscaffold, cgf参与干细胞的依恋,增殖,分化和调控组织再生过程(12]。cgf调节众多在干细胞生物学过程,如骨髓基质细胞,间充质干细胞,牙周韧带细胞。特别是CGF治疗促进了牙原性的和DPSCs体外成骨的潜力,展示在牙髓再生具有重要意义13]。此外,cgf可能施加的影响组织再生,osteoclastogenesis,和骨形成在脂多糖(LPS)引起的炎症调节促炎细胞因子的表达,如白细胞介素- 6 (il - 6)、il - 1β和肿瘤坏死因子-α在DPSCs [14]。

坏死的果肉是由微生物引起的,如革兰氏阴性细菌(15]。有限合伙人,因为这些细菌细胞壁的主要分子,利用模型炎症的主要有毒因子参与bacteria-induced免疫反应(16]。如前所述,控制这种情况与bioscaffolds诱导髓再生至关重要。cgf据说炎症和再生之间的优化平衡反应受感染的纸浆和影响扩散,分化和迁移LPS-stimulated髓干细胞(14]。然而,cgf的长期疗效的矿化DPSCs尚未研究。临床使用的目的,有必要探索CGF的效率在类似的临床条件不成熟的情况下坏死引起的牙齿由于炎症代谢产品的细菌。因此,体外研究评估CGF的长期影响扩散,迁移和分化培养下DPSCs LPS-induced炎症。

2。材料和方法

2.1。的制备方法

本实验研究伦理委员会批准大不里士大学医学科学IR.TBZMED.VCR.REC.1399.392代码。从每一位候选人获得知情同意后,新鲜的静脉血液样本(10毫升)自愿捐赠的健康成人(n= 5)。血液样本被放置在无菌管无抗凝立即解决方案和离心机按照下列过程:30年代加速度,2分钟692 g, 4分钟547克,4分钟692克,855克3分钟,36个年代减速(MEDIFUGE™, Silfradentsrl,索非亚,意大利)。离心后,四层(从上:血清纤维蛋白淡黄色的外套,CGF,和红细胞(红血球))观察管。CGF凝块被删除从管使用无菌镊子和周围分离阶段显微剪刀。随后,凝块混合,设置在一个无菌纱布抛弃多余的血清,然后,CGF凝块剁碎,均质,并放置在−1 h 80°C;之后,他们在3000转离心10分钟在室温下。优越的液体(cgf)使用0.22 mm筛过无菌注射器过滤器(Memberan, CA)和把−80°C到使用。(17]。

2.2。细胞培养

牙髓干细胞(DPSCs)从伊朗获得生物资源中心(德黑兰,伊朗)。细胞培养在低糖DMEM(杜尔贝科的修改鹰介质)含10%胎牛血清的边后卫和penicillin-streptomycin 1%。这些细胞被维护在一个孵化器在37°C和5%的公司₂。所有实验后进行连续3 - 5细胞通道。DPSCs被分成六组所表1。

2.3。SEM分析样品制备

收集影响第三磨牙进行扫描电镜分析。牙齿分别插入并存储在10%甲醛塑料小瓶,直到使用。样本分段纵向在水中冷却金刚石锯旋转在500 rpm (Isomet,比勒有限公司,虚张声势,湖,美国)。每个牙切片1毫米厚度使用一个线性精密切割机(图1)。安装后每个牙片载玻片,样品沉浸在5.25% NaOCl 24小时消毒。标本冲洗和浸泡在1×磷酸盐(PBS)一周去除残留的代理和存储在无血清培养基中。然后,DPSCs 1×10的密度³细胞/被播种在每个盘。细胞治疗21天,然后固定在2.5%戊二醛溶液在4°C(美国Sigma-Aldrich) 1小时前被梯度乙醇脱水。对待DPSCs观察使用扫描电子显微镜(扫描电镜;TESCAN MIRA3 FEG)。

2.4。ELISA试验

ELISA试验是用来检测和量化蛋白质水平的TNF -α治疗组。特定的抗体对肿瘤坏死因子-α预镀到microwells。孵化后,蛋白质被涂布抗体捕获和样本洗广泛。抗体检测捕获的蛋白质,另一个特定的蛋白质补充道。然后,辣根过氧化物酶(合)共轭抗体被加入到开发信号,其次是tetramethylbenzidine(三甲)试剂。含有硫酸的解决方案是添加到样品颜色停止开发,和颜色强度说明绑定蛋白测量数量在450海里。

2.5。细胞增殖实验

使用MTT测定细胞生存能力评估。DPSCs 2×10的密度³细胞/孵化24小时在96 -孔板包含DMEM和10%的边后卫。细胞暴露于CGF,有限合伙人(0.1、1或10µg / ml),或1的组合μg / mL有限合伙人,和1×名。在21天的学习期间,每两天文化传媒是刷新。细胞没有任何治疗被认为是对照组。孵化后,MTT方法(2毫克MTT粉1毫升PBS)添加到井和盘子被保持在4小时的孵化器。然后,解决办法是删除。甲瓒晶体溶解,0.1毫升二甲亚砜(DMSO)被添加到每个盘子都摇动了,在黑暗中在100转10分钟。光密度(OD)测量使用标仪(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)规模450海里。比较不同组的结果后,浓度为1×名被选中作进一步实验。

2.6。伤口愈合实验

愈合试验是用来评估细胞流动性通过治疗方法在有限合伙人的存在。细胞被播种到24-well板的密度1×10⁵细胞/好,培养24小时。然后,细胞治疗与前面提到的治疗21天6组。文化媒体每两天更换一次。细胞没有任何治疗被认为是对照组。21天,人工缺口是在单层细胞使用黄色吸管技巧和保持12 h。细胞迁移到伤口区域的图像捕获在0 h和12 h后伤口创建使用一个倒置显微镜(Optika,日前,意大利)。伤口愈合面积测量的方法在以下公式:

2.7。检测碱性磷酸酶活性

碱性磷酸酶(ALP)是最常见的建议生化标记为成骨细胞活动。DPSCs暴露在三种不同浓度的CGF有限合伙人和/或在6组21天。骨细胞分化培养基(Bonbiotech、伊朗)用不同的治疗方法是改变每两天。高山染色,之后删除从井中,这些细胞被固定在70%乙醇一小时。然后,细胞与去离子水清洗三次,溶液5-bromo-4-chloro-3-indolyl四唑磷酸盐(Beyotime、上海、中国)被添加到每个。这些细胞被洗了几次,然后拍照。同时,定量探索,10%氯化十六烷吡啶(Sigma-Aldrich)被用来提取染料的量。吸光度测量在562 nm标仪(美国Winooski BioTek)。

2.8。检测胶原蛋白(天狼星红染色)

天狼星红染色是用来评估的CGF胶原培养后的光盘,和/或有限合伙人在6组21天。井在picro-Sirius红染色一小时。然后,两个变化的细胞被洗水酸化。剧烈的震动导致水从幻灯片之前删除样本100%的乙醇脱水三个变化。样本清洗在二甲苯和放置在一个树脂介质。最后,经过多次洗涤步骤,样品拍摄。

2.9。实时定量PCR分析(存在)

得到细胞RNA治疗组使用RiboEX试剂(GeneAll生物技术,韩国首尔)按照制造商的指示。在该测试中,细胞没有任何治疗和治疗的成骨的介质(OM)被认为是正面和负面的控制,分别。的浓度和质量rna测量使用NanoDrop2000分光光度计(美国马热科学、沃尔瑟姆)。RNA提取后,通过执行逆转录BIOFACT(韩国)工具来评估目标基因的信使RNA表达水平根据协议由制造商提供。信使rna表达水平的牙本质基质蛋白1 (DMP-1),象牙质sialophosphoprotein (DSPP),骨桥蛋白(OPN) runt-related转录因子2 (Runx2)和骨钙素(OCN),实时PCR进行使用SYBR预混料交货Taq(豆类生物,大津,志贺,日本)以下循环条件下在LightCycler®系统(罗氏诊断,曼海姆,德国):在95°C初始变性10分钟,45 95°C的周期10年代,和1分钟60°C。反应混合物总量为20μL,包括8μL (ddH₂啊,1μL (cDNA (1000 ng), 1μL的正向和反向引物(4 pmol)和10μL (SYBR®绿色实时PCR掌握混合。通过比较相对基因表达计算2^−∆∆CT方法。目标基因的mRNA表达规范化GAPDH作为内生的参考基因。总结了引物序列表2。

2.10。统计分析

组之间的差异被发现使用方差分析(方差分析),和一个值低于0.01显示统计学意义。个体差异群体之间进行评估使用图基的诚实的显著差异(HSD)测试( )。报告所有值的平均值±标准偏差(SD)一式三份的实验。圣地亚哥GraphPad棱镜6 (GraphPad CA)和ImageJ用于统计分析。

3所示。结果

3.1。集中生长因子表现出优秀的Cytocompatibility

DPSCs形态和粘附的牙质光盘后与CGF有限合伙人和/或治疗后21天图所示2(一个),2 (b)。SEM分析显示更好的传播和增长的DPSCs有限合伙人0.1μg / mL,有限合伙人1μg / mL, CGF CGF,有限合伙人+组。然而,有有限的可辨认的DPSCs有限合伙人10μg / mL,表明细胞毒性更高浓度的有限合伙人的属性。通过添加方法1μ有限合伙人的g / mL,细胞粘附被提拔和细胞质扩展出现了。

3.2。的影响集中生长因子和脂多糖对肿瘤坏死因子-α在牙髓干细胞

炎症是评估每组之前和之后的21天的研究期间根据TNF -α的水平。在对照组,治疗DPSCs CGF显著( )增加了肿瘤坏死因子-α级别从4.47±0.25,6.90±0.42 pg / ml。同时,正如所料,用有限合伙人治疗细胞导致TNF -的增加α水平剂量依赖性的方式;0.1暴露的DPSCs有限合伙人µg / ml,有限合伙人1µ10 g / ml,有限合伙人µg / ml增加肿瘤坏死因子的水平α9.17±0.45 ( ),12.90±2.64 ( )和21.90±0.70 ( )分别pg / ml。然而,CGF的组合和有限合伙人1µg / ml能够促进肿瘤坏死因子-α生产8.93±0.64 pg / ml,显著( )低于有限合伙人1µ克/毫升(图3)。这些结果表明CGF稳定LPS-induced TNF -αupregulation赞成在长期条件下诱导慢性炎症。

3.3。集中生长因子和脂多糖的影响在牙髓干细胞的可行性

细胞增殖率CGF的细胞治疗期间和有限合伙人使用MTT试验研究。暴露于CGF 21天施加一个无意义的增殖率的变化DPSCs(74±12.24%)与控制(100±18.28%)。然而,细胞治疗与不同数量的有限合伙人剂量依赖性地抑制细胞增殖。与未经处理的细胞相比,0.1,1,10µ克/毫升的有限合伙人显著降低细胞生存能力43±6.65,7.40±6.65,5.78±0.56% ( ),分别。此外,当CGF和有限合伙人(1µg / ml)同时使用,细胞存活率显著(展出 )减少到50.37±6.32%,这是非常高( )比有限合伙人1µ克/毫升(图4)。图基的成对比较检验表明CGF DPSCs在有限合伙人的数量和组合组显著高于有限合伙人1µg / ml集团( )。

3.4。迁徙能力长期接触后的牙髓干细胞脂多糖和集中生长因子

划痕试验进行了探索CGF的结合能力和LPS引起长期DPSCs再生特性。如图5,尽管有限合伙人10µg / ml DPSCs的迁徙能力没有显著影响,接触这些细胞的方法,有限合伙人0.1µg / ml,有限合伙人1µg / ml显著( )迁移率增加了2.65±0.10,4.32±0.12,4.52±0.12折叠与控制(1±0.13)。此外,治疗DPSCs使用CGF的组合和有限合伙人也导致显著增加(2.068±0.06)在细胞的迁移能力。考虑这些结果,CGF的使用,单独或结合有限合伙人,在长期条件下也可以被认为是一种很有前途的战略归纳DPSCs迁移能力的再生功能。

3.5。通过集中生长因子和脂多糖成骨的模拟

高山活动进行分析探讨影响CGF的长期和LPS处理DPSCs成骨的属性。见图6(一)0.1,尽管有限合伙人µg / ml并没有显着影响的高山活动,作为有限合伙人1µ克/毫升每个导致显著( ,高山活动)分别增加了2.45±0.33,1.57±0.10折叠相比与控制。相比之下,有限合伙人10µg / ml显著( )高山活动降低了0.56±0.05折,显示其负面影响DPSCs的成骨能力。然而,CFG结合有限合伙人也可能促进高山1.36±0.13折的活动与控制。

符合这一发现,结果来自天狼星红染色(图6 (b)与LPS)证明,细胞治疗1µg / ml也显著( )增加胶原蛋白水平1.18±0.02折叠与控制(1±0.007)。同时,暴露CGF细胞单独或结合有限合伙人1µg / ml,分别导致了重大的( )增加胶原蛋白生产由DPSCs 1.67±0.11, 1.22±0.04折叠比未经处理的细胞。然而,有限合伙人0.1µg / ml展出胶原含量无显著影响(0.95±0.01折),而有限合伙人10µg / ml减少DPSCs产生胶原蛋白的能力(0.71±0.02折, )。

进一步验证成骨的模拟治疗组,qPCR做是为了评估成骨的标记物的表达。从qPCR获得的结果说明,在长期接触中,作为单独或结合有限合伙人1µg / ml可以显著上调RNUX2的表达,DSPP, OPN和OCN DPSCs比未经处理的控制细胞和积极控制细胞OM单独对待。然而,暴露的细胞只孤立的有限合伙人显著( )增加OCN表达式(图7)。这些结果表明,CGF的长期使用和有限合伙人可以促进成骨的属性组合的DPSCs诱导高山活动和调制的表达成骨的标记。

4所示。讨论

牙髓再生的最大挑战之一,在牙科医学(18]。最近的研究表明,炎症在有限的水平是一个伟大的承诺维持牙髓活力和再生牙髓复杂。然而,控制炎症的临床设置的范围是相当具有挑战性19,20.]。等bioscaffolds CGF,炎症和再生之间的优化平衡反应受感染的纸浆(21]。CGF,纤维蛋白支架富含生长因子,被用于组织愈合研究促进附件、增殖、迁移和分化的祖细胞(21]。CGF也可以调节平衡LPS-induced炎症和再生反应DPSCs [14]。然而,没有研究已经证实这种效应的情况下类似于临床。因此,本研究旨在调查CGF的长期疗效DPSCs有无LPS-induced炎症。

的最普遍原因炎症牙髓的蛀牙和微渗漏在牙科修复,微生物感染发挥关键作用。微生物刺激导致炎症和刺激持久性的纸浆引发持续的炎症反应导致牙髓坏死(22]。常见细菌与蛀牙、革兰氏阴性细菌引起炎症反应通过有限合伙人在初选中膜(23]。有限合伙人的数量直接从感染牙根收集的范围可以从0.001到2μ克/毫升(14]。因此,基于之前的研究,三个浓度的有限合伙人(0.1、1和10μg / mL)选择创建一个有效的炎症刺激免疫反应条件。有限合伙人,促炎因子和细胞因子,如肿瘤坏死因子-α生产、il - 6和引发,并引发各种免疫反应成,牙髓组织的成纤维细胞,单核细胞(24]。尽管短期治疗与肿瘤坏死因子-α改进的克隆形成能力、迁移和分化的牙髓细胞(25),不同的时间和剂量的治疗可能有其他影响。连续暴露的牙髓细胞肿瘤坏死因子-α和il - 1β据报道超过三天损害成分化能力的细胞,这表明慢性炎性细胞因子的分泌可能防止髓修复和组织再生(14]。

符合之前的报道,这项研究的结果表明有限合伙人,TNF -有效的诱导物α,增加了TNF -α表达DPSCs在21天的研究期间。作为调节促炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α在DPSCs LPS-induced期间引发炎症反应,这可能会加速组织修复(26]。这些报告后,我们的研究结果表明,肿瘤坏死因子-α水平LPS-induced DPSCs对待CGF是显著降低而孤立的有限合伙人1μg / mL治疗。这些结果表明,方法可能会影响组织再生的控制和抑制炎症牙髓发炎细胞。

我们的研究结果显示,尽管微不足道的对细胞生存的影响与控制相比,CGF显著降低LPS引起的细胞死亡在1μ在DPSCs g / mL。这些发现表明,方法可以加速DPSCs LPS-stimulated条件下的扩散。CGF可以诱导多种间充质干细胞的增殖(例如,牙周韧带干细胞(PDLSCs) DPSCs,和hTERT-E6 / E7细胞)在剂量依赖性的方式13,27- - - - - -29日];虽然可以抑制细胞增殖CGF高度集中(30.),TGF -β和蛋白水解酶可以调节这些影响。

促炎细胞因子分泌成针对有限合伙人据说是负责中性粒细胞和干细胞的迁移7]。此外,bFGF和PDGF-BB CGF的生长因子,表现出类似的DPSCs对迁移能力的影响与粒细胞集落刺激因子体外。因此,作为治疗可能导致DPSCs迁徙能力和PDLSCs通过bFGF和PDGF-BB [31日,32]。目前的研究表明,长期接触CGF和有限合伙人(1µg / ml)能有效地促进DPSCs的迁移能力;CGF和LPS结合也导致显著增加细胞迁移。因此,CGF,通过释放这些趋化因子,可能正常化LPS-induced炎症的扩散和迁移,促进DPSCs在长期慢性炎症。

必不可少的一步成牙髓干细胞分化成再生和新象牙质和毛细血管的形成。高山硬组织形成的早期标志或成骨细胞的odontoblastic分化(33]。因此,调查高山活动和成骨相关基因的表达特性,如DMP-1 DSPP, RUNX2, OPN, OCN,可以帮助识别DPSCs odonto /成骨细胞的分化。作为促进成骨的/ odontoblastic DPSCs体外分化的调节DMP-1的表达和DSPP [27]。同时,归纳方法对成骨分化的影响已被证实在人类骨髓干细胞(34]。CGF此外,据报道,增加高山活动和上调的蛋白表达水平BMP-2, Col-1, OCN, VEGF,和bFGF periosteum-derived细胞在3天,7、14、21 (35]。在目前的研究中,骨的/牙原性的基因的表达水平增加组包含成骨的介质(OM)与对照组相比。我们的研究结果支持的一项研究[36]表明牙龈药用信号细胞条件培养液增加成骨细胞的数量LPS-induced头顶Wistar鼠的骨头。我们发现RUNX2的表达水平,DSPP,和OPN CGF + LPS + OM组明显高于与LPS + OM组相比,确认方法的控制效果在LPS-treated DPSCs。CGF长期cotreatment和有限合伙人显著提升高山活动和胶原蛋白生产DPSCs而未经处理的控制细胞。进一步验证中存在的成骨的模拟表明,DSPP的表达水平,RUNX2, OPN和OCN基因显著增加长期CGF同时治疗和有限合伙人与控制。这些结果表明,CGF,单独或在有限合伙人的存在,可以通过长期接触导致DPSCs成骨的模拟。根据这项研究的结果,证明CGF的能力控制LPS-induced炎症和降低其危害DPSCs的再生,我们假设CGF的临床疗效方法游离的牙髓学的再生,尤其是在这种情况下,干细胞是暴露于慢性炎症引起的髓疾病。

5。结论

CGF基于之前的研究,我们的研究结果表明,可能有一个至关重要的作用在控制释放促炎细胞因子如TNF -α,从而调节细胞增殖、迁移和odonto /成骨分化在DPSCs长期接触有限合伙人。鉴于CGF的能力在DPSCs调节再生和成骨的属性,其治疗使用诱导pulp-complex再生是一个有趣的前景。还需要进一步的研究来完全理解如何有效地应用于CGF的牙髓组织工程。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

附加分

临床意义。的使用方法在临床pulp-complex再生是一种很有前途的前景考虑其在DPSCs再生和成骨的属性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由医学科学研究大不里士大学的副校长。