l -抗坏血酸对人牙龈成纤维细胞体外创面愈合行为的浓度依赖性影响

摘要

维生素C或l -抗坏血酸在体内具有多种功能，特别是通过参与胶原形成所需的羟基化反应来促进组织损伤的愈合。系统服用维生素C对牙龈成纤维细胞增殖和功能有重要作用。局部或冲洗服用维生素C是否会改变牙龈成纤维细胞伤口的愈合行为尚不清楚。本研究旨在探讨维生素C对牙龈成纤维细胞行为的影响在体外伤口愈合模型。用含不同浓度维生素C的培养基冲洗从牙龈组织分离的人牙龈成纤维细胞，用划痕试验测定维生素C的冲洗对体外创面愈合的影响。分别采用transwell迁移法、MTT法和real-time RT-PCR分析细胞迁移、细胞活力和细胞外基质基因表达。我们发现用10或20µg/ml维生素C显著增加成纤维细胞迁移( ）.然而，在细胞活力和体外创面愈合试验中没有发现明显的影响。相反，用50µg/ml维生素C明显延迟创面愈合( ）.实时荧光定量PCR证实50µg/ml维生素C可显著增加成纤维细胞COL1、FN、IL-6和bFGF的表达。数据表明，用维生素C (10/20µG /ml)加速成纤维细胞迁移。然而,50µg/ml维生素C可增加COL1、FN、IL-6和bFGF的表达，这些表达与成纤维细胞创面愈合活性有关。处方维生素C时，应确定适当的时间和给药方法，以最大限度地发挥其效益。

1.介绍

正常的创面愈合可分为四个阶段，并有重叠的阶段:止血、炎症、增生和重塑[1- - - - - -4］．伤口愈合开始于血块，在止血阶段，血块会将伤口封死。血小板和炎症细胞是最先到达的细胞，它们提供重要细胞(如成纤维细胞和内皮细胞)流入损伤部位所需的关键功能和信号。在第一周内，血凝块几乎完全被成纤维细胞产生的肉芽组织所取代[1，2，5］．

成纤维细胞通过向创面迁移、增殖，随后合成细胞因子和细胞外基质(ECM)，使创面收缩和重塑，在创面愈合中发挥重要作用[5，6］．成纤维细胞通过产生胶原蛋白和非胶原细胞外基质蛋白(如纤维连接蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖)来产生ECM [7］．成纤维细胞创面愈合活性受多种生长因子、细胞因子和趋化因子调控，包括成纤维细胞生长因子、白细胞介素(ILs)、血管内皮生长因子(VEGF)和转化生长因子-家族(TGF-)β) ［1，8］．

维生素C或l -抗坏血酸是一种水溶性维生素，具有多种生化功能，包括在胶原蛋白和肉碱合成所必需的羟基化反应中起重要作用，多形核白细胞的吞噬作用，几种间充质细胞类型的分化作用，以及清除活性氧的抗氧化剂[9- - - - - -12］．此外，维生素C还可调节肿瘤生长和血管生成[13］．维生素C是人体必需的营养物质，因为维生素C不能在人体内合成[9］．维生素C是修复软性和硬性损伤组织所必需的[14］．一些研究表明维生素C促进成纤维细胞增殖[1，15］．与来自老年人的纤维母细胞相比，来自婴儿的纤维母细胞具有更大的细胞增殖潜力;然而，维生素C刺激了婴儿和老年人成纤维细胞的增殖。维生素C诱导正常人成纤维细胞I型胶原蛋白表达的剂量依赖性增加，并增强细胞外基质收缩[16］．临床研究表明，全身维生素C可以加速手术和拔牙窝伤口的愈合[17- - - - - -20.］．然而，维生素C促进口腔组织愈合的机制以及是否间歇性局部服用维生素C刺激牙龈成纤维细胞和调节伤口愈合的机制仍未解决。我们假设，与全身口服或静脉注射形式的维生素C相比，冲洗或间歇局部给药可能显示不同的效果。因此，本研究的目的是研究间歇性局部暴露人牙龈成纤维细胞是否促进维生素C在体外通过诱导细胞活力和迁移促进创面愈合，并通过诱导细胞外基质和胶原合成促进成纤维细胞创面愈合活性。

2.材料和方法

2．1．细胞培养

研究对象为18 ~ 25岁的健康青年志愿者。牙龈组织立即转移到添加了10%胎牛血清、1% l -谷氨酰胺、0.5 mg/ml庆大霉素和3 mg/ml两性霉素B的冰冷储存介质(Gibco, Life Technologies Corporation, Grand Island, NY, USA)中。每个标本用无钙和无镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次。用手术刀将牙龈组织切成1 × 2 mm的碎片，置于100 mm的培养皿中，培养皿中添加10%胎牛血清、1% l -谷氨酰胺和1%抗生素。组织样本在37°C、5% CO的湿化环境中培养₂每隔3天更换一次培养基，直至外生细胞达到合流。本研究以牙龈成纤维细胞为主的生长技术从牙龈组织中获得的整个细胞群[21］．实验采用第3 - 6代人牙龈成纤维细胞(hGFs)。患者提供了书面的知情同意，以使用遗弃的组织为研究目的。该研究方案得到了泰国朱拉隆功大学牙科学院伦理委员会的批准(hrecl - dcu 2016-097)。所有实验都使用了来自一个供体的原发性hGFs。来自三个不同捐献者的细胞被用来确认三次重复的结果。进行划痕试验、活力试验、细胞迁移试验和PCR试验。在每个实验中，一个盘子被用于一个病人或一个捐献者。所有实验组(用0、10、20或50漂洗µg/ml l -抗坏血酸)，每组3孔。在所有实验中，每组共9个样本。只有来自一个供体的数据被用来展示实验结果的图表。

2．2.划痕试验(在体外伤口愈合试验)

为评价l -抗坏血酸对hgf介导的体外创面愈合的影响，采用划痕实验。hGFs以100,000个细胞/孔(26,316个细胞/cm)的密度被播种在一个12孔的培养皿中²）.24h后，当细胞接近融合时，用无菌的1ml移液管尖在融合的细胞单层上划一条直线。碎片用PBS冲洗掉。细胞在37°C、5% CO的湿化环境中培养₂的气氛。根据我们之前研究的漂洗方案[21，用0、10、20或50冲洗细胞µg/ml l -抗坏血酸，培养7 min，每日3次。在0、12、24和48 h，使用倒置显微镜(Eclipse TS100，尼康，日本)和数码相机在每个培养板的相同位置观察和记录创面，并在每个井的底部放置一个配准标记。如前所述，使用ImageJ 1.45S软件(Wayne Rasband, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)对其余伤口区域进行分析[22］．剩余伤口面积的百分比按下式计算。

2．3.细胞生存能力分析

采用0.5 mg/ml的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT;#298-931, USB公司，克利夫兰，美国，OH)。细胞按2 × 10进行电镀⁴细胞/厘米²在两个24孔板。24 h后，用0.5 ml MTT溶液替换第1板孔中的培养基，37℃孵育30 min。将福玛赞产品溶解在由9:1二甲基二磺酸和甘氨酸缓冲液组成的增溶/停止溶液中。使用酶标仪(ELx800, BioTek, Winooski, VT, USA)在570 nm处测量光密度。2中的单元格^nd用0、10、20或50冲洗平板µg/ml l -抗坏血酸，每天3次，每次7分钟。48 h后，用MTT法检测2^nd板如上所述。将吸光度结果归一化至第1天，并进行组间比较。

2．4．Transwell迁移分析

细胞迁移试验使用24孔大小的transwell插入物进行，插入物8.0µM孔聚碳酸酯膜具0.3 cm²有效生长面积(#3422,BD Falcon™细胞培养插入，BD Biosciences, Bedford, MA, USA)。胰酶化hGFs并在无血清培养基中重悬。1×10⁵细胞在200年µ在每个插入物上播种培养基L。播种后1小时，用各自组的培养基冲洗细胞。简而言之，插入物被移动到包含700个孔的24孔板上µL(0,10,20，或50µg/ml l -抗坏血酸，静置7分钟。每天重复冲洗3次。为排除细胞增殖的影响，在无血清培养基中进行24 h的迁移实验。第二天，用棉签拭除细胞膜上表面未迁移的细胞。迁移到膜另一侧的细胞用冷甲醇固定10分钟，1.4%结晶紫染色，蒸馏水冲洗3次。使用每张插入的5个随机选择区域(x100)的显微照片评估细胞迁移，使用ImageJ 1.45S软件统计迁移的细胞数量，如前所述[23］．比较各组间迁移的细胞数。

2．5．实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析RNA表达

实时定量RT-PCR分析细胞外基质生产相关基因的定量表达。用0、10、20或50漂洗后分离hGFs的融合细胞(96孔板10,000个细胞/孔)µg/ml维生素C，在无血清培养液中培养7分钟，每天重复3次。使用trizol试剂(#2302700,Prime, Gaithersburg, MD, USA)分离总mRNA。裂解液加入100µL氯仿，混合，12,000 rpm离心15分钟。用250沉淀mRNAµL异丙醇，微丸溶解于无核酸酶水中。使用分光光度计(NanoDrop2000, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)测定RNA的量。利用improma - ii逆转录系统(#A3800, Promega Corporation, Madison, WI, USA)进行逆转录酶反应合成第一链cDNA，并按照制造商说明进行定量PCR。

I型胶原蛋白(COL1)、局灶粘连激酶(FAK)、纤维连接蛋白(FN)、白细胞介素-6 (IL-6G)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的PCR引物(表1)筛选细胞外基质基因表达。所有图均根据内参基因的表达进行分析和归一化;然后，使用Bio-1D软件15.03版本(Vilber Lourmat, Marne La Vallée，法国)对数据进行分析。每个供体株系重复3次独立实验，比较基因表达倍数变化。

2．6．数据分析

所有实验重复三次。数据显示为剩余伤口面积、细胞活力、细胞迁移和基因表达变化的平均值和标准差(SD)。SPSS v.21(IBM, New York, NY, USA)程序进行统计分析。数据正态性采用Kolmogorov-Smirnov检验。组间结果比较采用Kruskal-Wallis检验，显著性水平为0.05。

3.结果

划痕试验结果表明，用10或20漂洗µg/ml维生素C对体外创面愈合无明显影响。然而，在48小时，50µg/ml维生素C明显延迟创面愈合( ）.维生素C 0、10、20、50组12 h创面剩余面积百分比分别为94.49±4.9、77.92±9.93、81.25±7.27、84.45±9.28µ分别g / ml。维生素C 0、10、20和50组24 h伤口剩余面积百分比均值和标准差分别为72.16±12.32、52.59±9.94、68.91±15.23和79.25±11.41µ分别g / ml。维生素C 0、10、20和50组48 h创面剩余面积百分比均值和标准差分别为46.35±9.58、39.82±8.44、42.28±8.22和78.21±10.98µ分别为g / ml(图1）.

与创面愈合实验结果相对应，我们发现10和20µg/ml维生素C对细胞活力无显著影响。相比之下,50µg/ml维生素C显著降低细胞活力( ）.维生素C 0、10、20、50组细胞活力试验平均值和标准差分别为0.37±0.047、0.374±0.05、0.379±0.065、0.253±0.02µ分别为g / ml(图2）.

transwell测定结果显示，用10或20漂洗µg/ml维生素C增加了24 h后成纤维细胞的迁移，呈浓度依赖性( ）(图3.）.然而，当维生素C剂量增加到50时，在较低维生素C浓度下观察到的细胞迁移增强没有观察到µ克/毫升。维生素C 0、10、20和50组的平均值和标准偏差分别为125.25±17.08、233.98±27.2、341.52±21.09和160.3±55.17µ分别g / ml。

我们采用实时RT-PCR分析10、20、50次牙龈成纤维细胞冲洗后创面愈合相关基因的表达情况µg/ml维生素cµg/ml维生素C显著上调COL1、纤连蛋白、IL-6和bFGF的表达( ，0.005、0.002和0.002)。两组间FAK和VEGF表达无明显差异。维生素C 0、10、20、50组的胶原蛋白表达均值和标准差分别为0.98±0.16、1.55±0.13、1.45±0.15、2.32±0.14µ分别g / ml。维生素C 0、10、20和50组的纤维连接蛋白表达均值和标准差分别为0.88±0.12、1.07±0.07、1.21±0.2和1.66±0.17µ分别g / ml。维生素C 0、10、20、50组IL-6表达均值和标准差分别为1.03±0.12、1.28±0.15、1.77±0.18、2.26±0.17µ分别g / ml。维生素C 0、10、20和50组的FAK表达均值和标准差分别为1.01±0.26、0.91±0.20、1.10±0.27和1.32±0.23µ分别g / ml。维生素C 0、10、20、50组VEGF表达均值和标准差分别为0.73±0.28、1.08±0.20、0.95±0.15、1.05±0.18µ分别g / ml。维生素C 0、10、20、50组bFGF表达的均值和标准差分别为0.85±0.17、1.32±0.58、1.28±0.24、2.01±0.20µ分别为g / ml(图4）.

4.讨论

目前的研究表明，用10、20或50漂洗µg/ml维生素C对人牙龈成纤维细胞活力、迁移和细胞外基质蛋白表达行为的影响有差异。低剂量的维生素C (10,20µG /ml)明显诱导成纤维细胞迁移，这是一种早期伤口愈合事件，但在伤口闭合方面没有显著差异。相比之下，高剂量的维生素C (50µG /ml)通过抑制牙龈成纤维细胞活性，延缓牙龈创面愈合。实时荧光定量PCR结果表明，50µg/ml维生素C促进细胞外基质蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白、bFGF和炎症介质IL-6的生成。

用低剂量的维生素C漂洗可增强牙龈成纤维细胞的迁移，如transwell迁移分析所示。在高剂量(50µg/ml)。清洗和50个µg/ml维生素C显著降低细胞活力。因此,50µ在我们的模型中，g/ml维生素C可能导致牙龈伤口延迟愈合，因为在该浓度下细胞活力降低。然而,50µg/ml维生素C促进ECM蛋白表达。该浓度可诱导hGF活性从细胞活力和迁移到ECM的产生。我们的研究结果表明，维生素C的作用是剂量依赖的，这与Rahman等人的研究结果一致[24］．

高浓度的维生素C导致细胞活力降低，这一问题尚未解决。高浓度的维生素C可能导致较高的中酸度，这可能对细胞有毒。然而，我们测量了细胞培养基中各维生素C浓度的pH值，发现pH值没有差异;因此，我们可以在我们的模型中排除酸度的影响。与我们的结果类似，研究表明，维生素C通过未知的机制抑制许多癌细胞的增殖;然而，细胞凋亡可能参与[25，26］．因此，维生素C对细胞凋亡的诱导作用是一个值得进一步研究的有趣课题。根据我们的研究结果，高浓度的维生素C可能导致ECM的成纤维细胞产生;然而，较低浓度的维生素C诱导增殖和迁移增加。

Abrahmsohn等人证明维生素C加速拔牙窝愈合，减少术后并发症，如干窝[18］．他们建议口腔手术后的患者服用维生素C。这些作者提出，维生素C对创面愈合的全身性作用可能受到多种途径的调控，需要进一步研究。目前关于维生素C调节牙龈成纤维细胞体外创面愈合活性的研究是关于维生素C对创面愈合局部作用的首次报道。我们的研究旨在模拟使用维生素C漱口水或口服含片的形式，在口腔中慢慢溶解。我们的目标是在我们未来的研究中使用溶解的口服含片作为口腔手术患者的漂洗作用，以加速伤口愈合。因此，我们计算了6名志愿者维生素C 500 mg口服含片溶解的平均时间(6.87±0.31分钟)，在我们的研究中大约使用了7分钟的冲洗方案。因此，我们的研究旨在模拟这种情况，用不同浓度的维生素C冲洗细胞7分钟，每天3次。需要进一步的临床研究来调查在剂量依赖的情况下，局部或冲洗维生素C是否能促进拔牙窝的伤口愈合，从而改善受损患者的术后伤口愈合或加速伤口愈合，以进一步替代牙齿或进行美容重建。

维生素C促进胶原蛋白的合成。Mohammed BM等人证明，与对照组相比，给小鼠服用维生素C可增加伤口中的胶原合成[1］．Tsutsumi等人证明l -抗坏血酸2-磷酸镁盐(一种持久的l -抗坏血酸)在诱导I型胶原基因表达方面比正常的l -抗坏血酸更有效[12］．他们的结果与我们的研究结果一致。

上皮细胞和成纤维细胞分泌IL-6激活伤口愈合的炎症期[27］．IL-6也促进增殖期上皮细胞的生长[4］．在我们的研究中，我们发现用维生素c冲洗hGFs后IL-6表达增加，这可能有助于促进伤口愈合在活的有机体内．

许多研究已经调查了维生素C治疗各种癌症的效果[13，25，28］．我们的研究结果扩展了维生素C对牙龈成纤维细胞行为的影响的基础知识，我们提出维生素C作为一种补充剂，有潜力用于口腔伤口愈合。我们还需要进一步的临床研究来验证我们的体外研究结果。

5.结论

用低剂量的维生素C漂洗可明显诱导成纤维细胞迁移;然而，它们并不会产生影响在体外牙龈伤口关闭。此外，高剂量的维生素C通过抑制牙龈成纤维细胞的活力而延迟伤口愈合。相比之下，高剂量的维生素C可促进ECM蛋白和炎症细胞因子的产生。维生素C是安全的，可以在口腔手术后给患者开;但应确定合适的给药剂量和给药方法，使其效益最大化。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项研究得到了90人的支持^th朱拉隆功大学基金周年纪念。作者还感谢了凯文·汤普金斯博士;朱拉隆功大学牙科学院，负责手稿校对。

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