评估对口腔粘膜细胞因子释放细胞系文化(TR146)刺激中性粒细胞弹性蛋白酶与遗传病相关的疾病

文摘

目的。细胞因子和趋化因子可能参与了遗传病的口腔溃疡的发作的疾病。我们研究的目的是评估促炎细胞因子和趋化因子的细胞毒性影响重建口腔粘膜细胞系(TR146)处理不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)。客观的。为此,口腔粘膜的文化模型(石)准备从细胞系来源于口腔颊黏膜的鳞状细胞癌(TR146)处理不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶。文化是培养4 - 24小时间隔和设计如下:文化+人工唾液作为消极的控制;文化+ 0.01% SLS(十二烷基硫酸钠)作为积极的控制;和文化+ NE(10、50、100和200海里)作为治疗组。材料和方法。我们使用夹心ELISA技术孤立il - 1β(白介素1β)、引发和TNF -α(肿瘤坏死因子)。结果。我们没有发现重要的引发和TNF水平α当处理不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶在4 - 24小时孵化。的il - 1β水平略高时处理100和200海里不24小时后观察孵化虽然显著高水平在4小时后孵化东北约100海里。因此,我们发现增加il - 1的水平β当口腔粘膜刺激重建模型与不同浓度的NE(石)。这是一个初步在体外研究;然而,需要进一步的研究来评估时释放细胞因子和趋化因子的细胞毒性效应不对待。此外,高浓度的不建议刺激对石释放细胞因子和趋化因子。

1。介绍

多系统复杂疾病的口疮的性口炎、生殖器溃疡,和虹膜炎被定义为遗传病的疾病(BD) [1]。BD患者描述的风险明显高于白血病,淋巴瘤,口咽癌,甲状腺癌,前列腺癌(2]。没有研究,恶性BD转换为口腔鳞状细胞癌已被报道。因此,我们包括口腔鳞状细胞癌细胞系的研究和评估对口腔粘膜细胞因子释放细胞系文化刺激中性粒细胞弹性蛋白酶与双相障碍有关。评估的影响中性粒细胞弹性蛋白酶在BD使用OSCC细胞行本研究小说。它是一种免疫介导的全身性血管炎和特点是复发性口腔溃疡、生殖器溃疡复发,皮肤损伤葡萄膜炎(3),类风湿性关节炎4)、克罗恩氏病和系统性红斑狼疮(SLE) [5]。神经系统(复发6)和血管疾病的最常见的后果是导致眼部炎症BD (7]。流行病学研究显示,高频率的这种疾病在土耳其,伊拉克,伊朗,朝鲜,日本的人口。这种疾病的发病率在男性比女性更常见的比率2 - 10:1 (8]。最可能的效应机制建议HLA-B51 antigen-implicated T淋巴细胞内稳态(9];HLA-Cw 1602基因标记识别10];使用细小病毒B19等传染性病原体,链球菌spp。(例如,美国sanguis,美国粪,链球菌,唾液链球菌),幽门螺杆菌,包柔氏螺旋体burgdorferi,人类单纯疱疹病毒6 (HSV-6)和肝炎的A, B, C和E病毒(11];使用α烯醇酶蛋白的靶蛋白血清anti-endothelial细胞抗体(AECAs) [12),热休克蛋白(13),和自身抗原;刺激B细胞拥有心磷脂抗体(14];内皮功能紊乱的错乱;诱导氧化应激和不平衡在凝血和纤溶配置文件;和错乱的中性粒细胞和单核细胞15]。

一般来说,炎症反应是由活跃丝氨酸蛋白酶处理增长因素,表面受体和信号分子。从中性粒细胞丝氨酸蛋白酶嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(NSPs)驻留在中性粒细胞颗粒和单核细胞溶酶体16]。中性粒细胞弹性蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,被称为中介的血管和组织损伤。然而,其不恰当的释放与炎性疾病包括慢性阻塞性肺疾病、再灌注损伤、生殖道炎症,炎症肠(17]。大量研究表明NE抑制剂对neutrophil-mediated组织损伤的保护作用[18]。

BD患者中性粒细胞多动症研究之前(19]。双相障碍患者的中性粒细胞弹性蛋白酶浓度高,导致组织损伤;因此,本研究的目的是评估上皮细胞的损伤后4 -通过测量细胞因子il - 1和24小时孵化β引发和TNF -α时释放刺激重建口腔粘膜细胞系模型与不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)。

2。材料和方法

文化是来自SkinEthic(亚历山大·弗莱明Episkin 4街69366 -里昂Cedex 7,法国),和0.5厘米²上皮重组了空运的文化改变了人类角质细胞12天在惰性聚碳酸酯定义化学介质过滤器(厚度在第五天是135年的文化μ米(象征价值))。

口腔粘膜的文化模型(石)(准备从细胞系来源于口腔颊黏膜的鳞状细胞癌(TR146))买来SkinEthic实验室(亚历山大·弗莱明Episkin 4街69366 -里昂Cedex 7,法国)。琼脂SkinEthic文化发货,到达,维护媒体和文化被允许达到室温1小时;之后,文化和媒体都被转移到一个层流罩。500年μl维护媒介转移到每个好24-well板,和文化被使用无菌镊子从琼脂板被清洗和存储在70%的乙醇。每个文化插入涂抹到滤纸上去除任何残留的琼脂,然后将被插入到24-well板包含维护中、放在孵化器在37°C, 5%的公司₂在湿润的气氛中过夜。

3所示。文化石和治疗

文化石处理如下:

脱石+ 200µl人工唾液(人工唾液获得从Orthan公司)作为消极的控制。脱石+ 200µl 0.01% SLS 10毫升(0.1 g SLS磷酸盐缓冲剂)作为阳性对照。石处理10 nM, 50 nM, 100 nM和200 nM NE担任测试组。文化上层清液都放入6-well板块包含1毫升新鲜的维护中,随后接受人工唾液,0.01% SLS, 10, 50100和200 nM中性粒细胞弹性蛋白酶和孵化4和24小时37°C。24小时后,底层中收集和储存在−80°C进行分析。

4所示。检测细胞因子

引发的水平,il - 1β和肿瘤坏死因子-α文化的上层清液由商业酶联免疫吸附测定化验(夹心ELISA技术)特定的细胞因子。文化的上层清液样本稀释使用。示例中的细胞因子浓度测定比较浓度获得重组的浓度标准并行运行,提供的手册的指示。

5。统计分析

结果意味着±SE。统计学意义和从正面和负面的控制差异值是评价学生t以及。统计概率的 , ,和被认为是重要的。

单向方差分析与事后t以及被用来比较组之间的比例和平均值和多重比较被认为是显著的。

6。结果

6.1。检测治疗后引发石和NE后4 - 24小时孵化

蒙脱石10 nM的治疗后,50 nM, 100 nM和200 nM NE 4小时无显著结果而消极/积极的控制。然而,观察显著增加引发的水平相比石与100 nM和200 nM NE(表24小时后积极控制1)。


参数	NE 10海里	东北50纳米	东北100海里	东北200海里	消极的控制(盐水)	积极的控制(SLS 1%)

引发(pg. /毫升)24小时的潜伏期	- - - - - -	- - - - - -	2501.85^{d __}±610.27	2540年^{e __}±360.27	2366.38±164.08	6265.93±356.96	ns / __
引发(pg. /毫升)4小时的潜伏期	202.32±45.16	257.43±47.33	214.34±30.35	231.83±57.44	189.89±37.12	63.98±150.50	ns / ns

; ; 。ns =无意义的,/ __ =较负控制/与阳性对照相比,b / b†=比较消极的控制和10 nM NE / 10 nM NE的积极控制相比,c / c†=比较消极的控制和50 nM NE / 50 nM NE的积极控制相比,d / d†=相比相比,负控制东北100海里/积极的控制与东北约100海里,e / e的负控制__ =相比与东北200海里/东北约200海里的积极控制相比,g / g†= 10 nM东北100海里相比相比NE(阴性对照组)/ 10 nM东北100海里(阳性对照组),相比我/ __ = 50 nM东北100海里NE(负对照组)相比/ 50 nM NE(阳性对照组)东北约100海里。

6.2。检测il - 1β治疗后脱石和NE后4 - 24小时孵化

显著升高il - 1的水平β观察治疗后脱石与100 ( )24小时后东北约200海里的孵化与消极/积极控制(相比 )(图1);同样,增加il - 1的水平β也观察到治疗后脱石后4小时向东北100海里的孵化与消极/积极控制(相比 )(图2)(表2)。


参数	NE 10海里	东北50纳米	东北100海里	东北200海里	消极的控制(盐水)	积极的控制(SLS 1%)

il - 1β(pg. /毫升)24小时的潜伏期	- - - - - -	- - - - - -	1.31^{d / d __}±0.06	1.33^{e / e __}±0.02	0.99±0.07	±0.21	一个/ __
il - 1β(pg. /毫升)4小时的潜伏期	46.02^{ns / b __}±4.45	2.42^{ns / c __}±0.23	2.42^{dgi g / d†††}±0.21	1.92^{e __}±0.08	2.53±0.25	±4.45	一个/ __

6.3。检测肿瘤坏死因子-α治疗后脱石和NE后4 - 24小时孵化

没有明显的肿瘤坏死因子-的浓度α观察石10 nM的治疗后,50 nM, 100 nM和200 nM NE在4 - 24小时孵化与消极/积极控制相比(表吗3)。


参数	NE 10海里	东北50纳米	东北100海里	东北200海里	消极的控制(盐水)	积极的控制(SLS 1%)	P≤0.05

肿瘤坏死因子-α(pg. /毫升)24小时的潜伏期	- - - - - -	- - - - - -	14.76±1.72	23.23±3.71	22.26±4.09	141.84±51.66	ns / ns
肿瘤坏死因子-α(pg. /毫升)4小时的潜伏期	2.61±1.43	25.00±55.90	1.17±0.50	4.36±4.86	2.62±1.64	±3.16	ns / ns

; ; 。ns =无意义的,/ __ =较负控制/积极控制相比,b / b†=比较消极的控制和10 nM NE /与积极控制10 nM NE相比,c / c†=比较消极的控制和50 nM NE / 50 nM NE的积极控制相比,d / d†=相比相比,负控制东北100海里/积极的控制与东北约100海里,e / e的负控制__ =相比与东北200海里/东北约200海里的积极控制相比,g / g†= 10 nM东北100海里相比相比NE(阴性对照组)/ 10 nM东北100海里(阳性对照组),相比我/ __ = 50 nM东北100海里NE(负对照组)相比/ 50 nM NE(阳性对照组)东北约100海里。

7所示。讨论

双相障碍是一种多系统、炎症和自身免疫性疾病(20.]。炎症反应是策划的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子(肿瘤坏死因子),及il - 6 (20.]。我们研究肿瘤坏死因子的水平没有显著增加α用不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶孵化24小时后与消极/积极控制相比(表3)。类似的结果观察当石产品孵化与NE浓度不同的纳米4 h。不处理的肿瘤坏死因子的影响α还不清楚,但一些研究表明,不降解pro-TNF -α损失的活动,和其他调查显示,不释放生物活性TNF -α从其膜结合前体(21]。Robache等人研究了蛋白酶3而不是东北的TNF - pn流程体外α(22)和激活引发和il - 1β(23]。

Lorell和Eirkson研究人类嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的破坏行动肺气肿和气流阻塞(24]。il - 1β是一个关键的中介的炎症和免疫反应,和单核细胞il - 1的主要来源是什么β(25]。我们发现显著释放il - 1β当石接受100和200海里NE和孵化4 h。同样,重要的释放il - 1β也观察到当石接受100和200海里NE和孵化24小时( )(表2)。

蛋白酶3、中性粒细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶(CG)活性嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶调节炎症反应通过处理细胞因子,生长因子,表面受体和信号分子。这些NSPs不仅参与细胞内发病,还送到矩阵,通过降解蛋白质产生趋化因子和细胞因子,裂开NFƙβprogranulin,激活protease-activating受体2 (15]。

广义错乱的淋巴细胞和中性粒细胞数量观察过程中双相障碍,表现为积极的单核细胞,增加中性粒细胞浸润在皮肤和眼部病变,并增加循环蛋白质,C_{3 - 5}IgA, hepatoglobulin和α-酸性糖蛋白。激活单核细胞产生大量的促炎细胞因子:il - 1、il - 6、TNF -引发α和gm - csf(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。这些细胞因子参与,通过增强刺激PMNL与内皮细胞的相互作用,导致组织损伤启动的中性粒细胞(18]。

我们检查了蒙脱石具有不同的刺激后引发NE浓度,发现显著的结果(表1)。引发是主要负责嗜中性粒细胞趋化因子脱粒和中性粒细胞迁移到炎症网站(25),发现蛋白酶3 (26),而不是中性粒细胞弹性蛋白酶在激活引发NSPs负责。另一项研究表明,不激活表皮生长因子受体(27]和诱发引发的表达通过toll样受体4 (28)的一个研究表明,双相障碍患者同型半胱氨酸水平的升高(29日)负责从内皮细胞一氧化氮的生产过剩,导致表达化学引诱物的氧自由基,诱导il - 6,引发和TNF -α(30.,32]。

8。结论

唾液与遗传病疾病影响的病人通常产生嗜中性粒细胞弹性蛋白酶要么有或没有口腔溃疡。中性粒细胞弹性蛋白酶的失衡导致上皮损伤和产生细胞因子和趋化因子,由于溃疡预后。这是首次研究,三维多层重建口腔粘膜细胞从口腔鳞状细胞癌与不同浓度的使用和刺激中性粒细胞弹性蛋白酶评估促炎细胞因子的释放。

一个高水平的il - 1β4 - 24小时后观察孵化与石通过不同浓度的NE刺激。增加引发孵化24小时后才被发现而没有TNF -α释放被发现在4 - 24小时孵化。所以不观察到的细胞毒性效应在目前的调查;然而,还需要进一步的研究和治疗的正常细胞系和病人的唾液与不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶建议相关结果。

数据可用性

数据用于支持本研究的结果都包含在这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

作者的贡献

Erum汗博士帮助校对稿件,博士Zohaid无独有偶协助数据分析。

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