文摘
本研究的目的是调查的影响基本成纤维细胞生长因子(bFGF)治疗培养牙龈成纤维细胞的增殖和凋亡(GFs)。人类GFs分离腭牙龈组织的16名健康的志愿者从9岁到35岁。培养GFs受到细胞增殖的分析ELISA试验,通过rt - pcr分析,基因表达和细胞凋亡能力caspase-3化验。i型胶原蛋白的细胞增殖活性和基因表达和caspase-3活动显著增强了治疗bFGF在培养GFs。此外,在培养GFs caspase-3年轻的活动主题显著高于GFs的成年人。结果表明:bFGF显著增强的i型胶原基因表达从人类牙龈组织培养的成纤维细胞。它还表明,bFGF调节牙周纤维母细胞的凋亡,效果更高的年轻学科,表明一个重要的角色bFGF的预防在伤口愈合疤痕形成。
1。介绍
碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)是一个基因家族的成员结构相关的多肽生长因子,和它的功能是介导的高亲和性受体(1]。众所周知,bFGF是一种多功能细胞因子参与伤口愈合的过程中,细胞增殖和细胞凋亡2- - - - - -4]。
伤口愈合可分为连续三次,部分重叠的阶段:炎症、扩散,和组织重建5]。巨噬细胞扮演关键的角色之间的过渡伤口炎症和修复,因为这个细胞进行组织碎片和释放大量的生物活性物质,包括像bFGF生长因子。在重构阶段,血管的数量下降和成纤维细胞的凋亡,导致疤痕组织与低细胞密度(6]。
细胞凋亡是一个必要的事件维持动能不断更新的动态平衡口腔黏膜和皮肤等组织,并建议在结缔组织修复中起关键作用。然而,细胞凋亡是经常参与致病的途径(7]。关于bFGF治疗诱导细胞凋亡的机制,它最近被证明bFGF细胞凋亡中起着重要的作用在神经视网膜的发展。成纤维细胞的细胞凋亡治疗bFGF在这两方面都加强了在活的有机体内和在体外实验(8,9]。bFGF在牙科,据报道,增强人类牙周韧带(PDL)细胞的增殖在小猎犬的狗10,11]。然而,由bFGF细胞凋亡机制的增强,年龄差距仍然不清楚。
本研究的目的是调查bFGF的影响治疗的新陈代谢培养GFs从different-aged主机特别引用caspase-3的表达式。这些结果支持我们的假设,在受伤部位bFGF的时间激活导致有效的肉芽组织成纤维细胞凋亡,这一过程是伤口重构的起始阶段。
2。材料和方法
2.1。手术疤痕形成和bFGF的注入
在这个实验中,40-male-Wistar老鼠6岁和12周。老鼠同样分为两组:bFGF注射组和对照组。批准的协议是广岛大学动物保健和使用委员会。疤痕形成,两国三分之一的矩形条硬腭mucoperiosteum切除在全身麻醉诱导戊巴比妥钠腹腔注射(1毫克/公斤的戊巴比妥钠,Dainabot,大阪,日本)。暴露的骨头表面擦了一个棉花球完全删除骨膜。五天之后切除,10μL bFGF的解决方案(20毫克bFGF / 10μL盐水)和10μL PBS的注入操作区域,分别。
2.2。组织学制备
在切除后10天,头部切除下深麻醉乙醚浸和固定。标本被脱钙22.5% ethylenediaminetetraacetate (EDTA)和嵌入在石蜡,和串行额部分的7μ米厚度的准备,沾ApopTag +过氧化物酶原位细胞凋亡检测工具(Billerica的微孔,MA),并通过光学显微镜观察。
2.3。细胞隔离和文化
许可在这一系列的实验研究是广岛大学的伦理委员会的准许。人类GFs从健康的腭牙龈组织分离获得16个病人之前和期间矫正治疗范围从9岁到35岁根据前面描述的方法(12]。被分成16个条目从9到12岁年轻组(;2男6女)和成人集团从26到35岁(;1男7女)。获得知情同意的患者之前实验的开始。
外植体培养在100毫米菜(康宁,纽约,纽约)与10毫升杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;Nissui药业有限公司、东京、日本)含有10%的边后卫(Mitsubishi-Kasei、东京、日本),32个U /毫升青霉素(σ,圣路易斯,密苏里州),60μg / mL卡那霉素(Meiji-Seika、东京、日本),和250 ng / mL两性霉素B (ICN生物医学Inc .,极光,哦),在5%公司的氛围2在湿润孵化器在37°C。媒介改变了每隔一天,直到细胞汇合的。5日至8日通过细胞分离出16个不同的牙龈组织用于以下实验。所有结果的女朋友16个人。
2.4。细胞增殖实验
GFs扩散是评估使用细胞增殖ELISA BrdU工具包(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)。简单地说,GFs使胰蛋白酶化,播种密度为1.0×103细胞/在125μL DMEM i型胶原蛋白(10μg / mL)涂层96孔板(猎鹰,Flanklin湖泊,新泽西),一夜之间和孵化。与PBS GFs洗了三次,然后孵化有或没有bFGF (0.5、1.0 ng / mL) (Peprotech、巴黎、法国)培养基的边后卫为1%。GFs 1%的边后卫的培养基作为消极的控制。GFs孵化了3,5,7,9天。GFs洗了三次PBS和10μL (5μg / mL 5-bromo-2′脱氧尿苷被添加到每个培养2小时。在孵化后,光密度测量的波长570 nm的Bio-Rad标仪(型号550,Bio-Rad大力神,CA)。GFs在不完全培养基培养没有bFGF作为消极的控制,和GFs独自bFGF在处理不完整的每个实验中被用作积极控制。72小时后,ELISA试验进行,GFs的扩散比较的比例相对于消极的控制。
2.5。定量实时聚合酶链反应分析
的mRNA水平fibronectin-1和i型胶原蛋白进行定量实时PCR分析使用LightCycler系统(罗氏诊断)和QuantiTectTM SYBR绿色PCR大师(试剂盒、东京、日本)。GFs被播种密度的6×104细胞/ 6-well板块(Falcon)。媒介融合改变了每隔一天直到80%。当细胞汇合的80%,GFs孵化了bFGF (Peprotech) 0.5或1.0 ng / mL 24小时,然后用PBS洗过。总RNA提取使用试剂盒从细胞培养试剂(Gibco BRL,马里兰州)。合成第一链cDNA从1μ使用作梦交易Ace - g总RNAα(Toyobo,大阪,日本)。表1显示了引物的序列。fibronectin-1和i型胶原蛋白的信号进行评估以定性的方式,相对于3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)信号。规范化的Ct值是表示相对于控制。
2.6。Caspase-3化验
GFs被播种密度1×103细胞/ 96孔板(Falcon)。媒介改变了每隔一天到70%或100%的融合。当细胞汇合的70%或100%,GFs孵化了bFGF (Peprotech) 0.5或1.0 ng / mL 6日到24日小时然后洗与PBS过度。洗后用PBS、PBS包括NucView 488 Caspase-3衬底(Biotium、圣旧金山,CA) 20μL是添加到每个和孵化为1小时37°C。Caspase-3激活是由荧光测量使用荧光板的读者(模型:下午SX;PerkinElmer,日本横滨)的波长520 nm。
2.7。统计分析
实验重复至少一式三份。均值和标准差计算从获得的数据,和不同的方式被使用学生的检查- - - - - -测试或单向方差分析(方差分析),后跟一个矫正的多重比较检验的显著水平或。
3所示。结果
明显高于年轻组,核扩散活动展示了与成人相比,小组在5至7天(图1(一))。同时,到达峰值的日子是缩短5天从第七天bFGF的治疗(数字1 (b)和1 (c))。1.0 ng / mL bFGF治疗后,年轻人和成年人之间的显著差异在细胞增殖组第五天(图所示1 (c))。
(一)
(b)
(c)
fibronectin-1基因表达不是bFGF的治疗(图发生了显著变化2(一个))。另一方面,增加的i型胶原基因表达显著诱导治疗bFGF在年轻和成人群体。此外,i型胶原基因表达明显(bFGF的表达)上调年轻组比成人组(图2 (b))。
(一)
(b)
caspase-3活动显著增强了bFGF治疗12小时融合在人类GFs在100%,而bFGF治疗没有显著影响caspase-3活动在人类GFs 70%融合(图3(一个))。特别是0.5 ng / mL bFGF增强caspase-3水平GFs的年轻组比成人组;然而当人类GFs处理1.0 ng / mL bFGF, caspase-3的活动几乎是相同的年轻人和成人群体之间。(图3 (b))。同时,GFs caspase-3活动时间的方式融合增加了100%,到达了一个高原在12小时(图3 (b))。
(一)
(b)
注射组中,60%以上的细胞在6周Wistar鼠有凝结核和细胞质减少,这是典型的细胞凋亡(图4(一)),而只有不到10%的细胞凋亡的特点在12周Wistar鼠(图4 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
bFGF被广泛称为细胞生长因子和有很强的multiplication-stimulating活动等各种细胞的成骨细胞、成纤维细胞的细胞,血管内皮细胞(13]。记录,bFGF高度提高未成熟的人类PDL细胞的增殖,同时保持干细胞的分化潜能,增加了大小克隆人类自由人民党(10,14]。bFGF的注射到皮肤伤口网站降低肉芽组织形成和增加凋亡事件的程度(15]。我们已经表明,注入bFGF鼠口感伤口网站增加凋亡事件。从这些结果,bFGF提高了成纤维细胞的细胞凋亡在活的有机体内和抑制疤痕组织的形成。
在这项研究中,bFGF加入GFs直到整个核扩散活动融合检查80%,而基因表达的细胞外基质(ECM)检查80%的融合。明显高于年轻组,核扩散活动展示了与成人相比,小组在5至7天,虽然没有9天两组之间的差异。人类GFs达到80%汇合的9天,而细胞增殖降低了。人类GFs两组之间的差异扩散只出现在扩散阶段。另一方面,bFGF治疗人类GFs的扩散增加两组,和天达到高峰是缩短5天从第七天bFGF的治疗。此外,i型胶原蛋白的基因表达增加了bFGF的加法。在先前的研究中,当迁移能力的差异是研究从胚胎成纤维细胞和老年人,迁移能力较低的比年轻的成年细胞起源细胞(16]。此外,在实验系统诱导细胞衰老,重复亚文化10和20通过细胞间的比较,证明了迁移能力的功能恶化率25%和17%在20日和10日通过细胞(16]。因此表明,与老化细胞活性降低。
此外,我们调查了bFGF细胞凋亡诱导的潜力。诱导细胞凋亡的机制,有各种凋亡信号转导途径,主要是通过死亡受体和线粒体。线粒体中扮演着重要的角色在许多形式的细胞凋亡通过释放apoptogenic因素如细胞色素c [17)和凋亡诱导因子(AIF) (18)还存在蛋白酶激活死亡称为(19]。积极效应还存在诸如caspase-3 6和7协调一组重叠的蛋白质基质的乳沟,导致细胞凋亡的形态学特征。认为肯定是诱导细胞凋亡检测的振兴,因为细胞凋亡的检测在实际的实验中观察到的反应caspase-3位于下游的最后阶段。认为细胞凋亡caspase-3增加的反应时生成。
在这项研究中,澄清的影响宿主细胞凋亡诱导能力的年龄bFGF, caspase-3的感应bFGF检查。caspase-3 GFs在不同细胞密度的反应是检查。70%汇合的GFs bFGF处理时,caspase-3活动汇合的GFs明显小于100%。此外,0.5 ng / mL bFGF显著增强的caspase-3 GFs年轻组比成人群体。然而当人类GFs处理1.0 ng / mL bFGF, caspase-3的活动几乎是相同的年轻人和成年人组之间。在先前的研究中,纤维母细胞生长因子受体(FGFR) 1基因表达降低与年龄相关[20.]。因此建议成人组bFGF细胞反应并不比年轻的群体,和这种差异bFGF的剂量有关。
据报道,bFGF有效诱导caspase-3活化和细胞凋亡在转化生长因子(TGF)β1-pretreated造粒tissue-derived成纤维细胞(GF-1) [9]。在我们的研究中,bFGF治疗人类GFs凋亡没有预处理的TGF -β1,表明bFGF直接对细胞凋亡的影响。
另一方面,我们的研究表明,注射bFGF鼠口感伤口网站增加凋亡事件。据报道,bFGF注入伤口网站在TGF -诱导迅速增加β1 (9]。因此,TGF -β1在受伤部位和bFGF水平导致成纤维细胞的细胞凋亡;这个结果可能导致增殖肉芽组织形成。
很明显,一旦细胞达到融合,凋亡活性增强。bFGF的作用的差异由于成纤维细胞的细胞密度是假定加速伤口愈合。即bFGF刺激成纤维细胞的生理活性物质排放的白血细胞和巨噬细胞在炎症期。充满了肉芽组织组织缺陷,然后增殖细胞的数量减少了细胞凋亡在重组期间,导致过度的细胞外基质(6,21]。
总之,细胞增殖和基质合成由外生bFGF在人类GFs调制。此外,建议在人类GFs细胞凋亡和老鼠口感和bFGF增加了治疗。从这些发现,bFGF细胞凋亡诱导的成纤维细胞可能导致肉芽组织形成和scar-less修复,而且这种效应bFGF可能与宿主的年龄。
利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突有关摘要报告。
承认
这工作是进行生命科学分析中心的合作,广岛大学。