文摘

只在晚期口腔癌常诊断由于缺乏可靠的疾病标记。本研究的目的是确定epithelial-specific人类calmodulin-like蛋白质(CALML3)可以作为口腔肿瘤发展的各个阶段的标志。免疫组织化学分析使用一个affinity-purified CALML3抗体进行活检确诊口腔组织样本代表这些阶段。共有90个组织标本来自52个病人。每个标本分析肤浅和基底粘膜细胞层的整体染色和染色的细胞立地。CALML3强烈表达良性口腔粘膜细胞表达的差别与对这些鳞状细胞发展为浸润性癌。基于Cochran-Armitage测试的趋势,表现在细胞核和细胞质膜显著降低与疾病严重程度增加。卡方检验表明,良性组织标本,有更显著的表达而发育不良/ CIS和侵入性标本。发育不良/ CIS组织表达明显多于侵入性组织。我们得出这样的结论:CALML3良性口腔粘膜细胞中表达的差别有统计上显著的趋势对这些肿瘤发生发生。 CALML3 may thus be a sensitive new marker for oral cancer screening.

1。介绍

大约30000新病例的癌症在口腔及口咽在美国每年确诊,对应于所有恶性肿瘤的3%左右。虽然明显检测由于口腔的可访问性,口腔癌发病率和死亡率很高,因为它通常是在一个高级阶段时最后临床可见。因此,结合各个阶段的五年存活率只有51%。癌症包括口腔、口咽鳞状细胞癌(90%以上1- - - - - -3]。多达40%的人被诊断为鳞状细胞癌发展转移性肿瘤或第二原发肿瘤附近的器官在稍后的时间。

早期诊断口腔和咽鳞状细胞癌更有利的预后至关重要。口腔及口咽鳞状细胞癌容易进行常规筛查,但可靠的检测在早期阶段需要健壮的标记,很容易分析。传统方法检测口腔上皮细胞恶性肿瘤包括入侵和经常痛苦的活组织检查。作为诊断工具或预后标记,是否开发一个简单的潜力,微创口腔癌筛查的方法将是很有价值的。

人类calmodulin-like蛋白质CALML3(同义词:CLP, calmodulin-related蛋白NB-1)是148 -氨基-酸钙传感器蛋白质残留无处不在的钙调蛋白密切相关(4,5]。然而,与钙调蛋白相比,CALML3是特定于组织的,似乎表示几乎只在正常分化上皮细胞如乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、肾,和皮肤6]。在一项研究中比较正常减少乳房成形术标本档案乳腺癌标本,罗杰斯et al。7]发现CALML3表达高水平在正常乳腺上皮细胞,发生在79%到88%的差别显著CALML3对这些浸润性导管癌和小叶癌标本。作者得出结论,是常见的乳腺肿瘤发生,差别CALML3对这些CALML3表达式可以作为一个状态标志为良性的状态(7]。

我们曾发现CALML3 mRNA转录水平表达,可以通过免疫组织化学检测在正常口腔黏膜组织。相比之下,有一个显著的减少免疫染色区域的恶性转化(8]。这里我们进行了免疫组织化学分析比较CALML3表达组织样本代表口腔肿瘤进展的不同阶段是否有一个显著的趋势在疾病进展CALML3表达的变化。此外,直接比较CALML3各个类别之间的表达式都是良性的,发育不良,原位癌和浸润性鳞状细胞癌。

2。材料和方法

2.1。组织标本

下IRB-approved协议754 - 04,梅奥诊所组织注册表是寻找病人经历了口腔手术活检。数据库是将组织标本分为4类:良性鳞状上皮(包括轻微的反应性增生),鳞状上皮发育不良,鳞状细胞癌原位(CIS)和浸润性鳞状细胞癌。浸润性鳞状细胞癌是进一步分类等级(9]。数据库是相互参照患者给予研究同意。他走时彩色幻灯片的外科手术进行评估和最合适的组织块为每种情况下处理CALML3疣状。员工外科病理学家(Thomas j . Sebo)证实了每个样本的诊断。样品被淘汰如果有任何可疑的诊断或者部分的质量较差。

共有90名患者组织标本来自52 62手术。本研究的目的,假设是由多个标本相同的病人是独立的。标本相同的病人通常是来自不同病变的网站在一个以上的手术日期。在52例,31(60%)是男性,整体平均年龄在诊断时是64年(SD, 15;中位数,67;范围内,6个月- 87年)。在90年组织标本,30(33%)诊断为良性,发育不良的6例(7%),12例(13%)为原位癌,浸润性鳞状细胞癌42例(47%)。42个样本的诊断为鳞状细胞癌,2例(5%)是1级,11(26%)二年级,三年级27(64%),2(5%)等级4。其他数据记录包括位置的标本(舌头,嘴,右,左,等等)和类型的手术(切除与活检)。

2.2。免疫组织化学

一代、亲和纯化和表征的兔多克隆抗体(TG7)描述了对人类CALML3 [7]。这些抗体(由Cocalico Inc . Reamstown)识别相应的肽CALML3 c端残留127年至148年的(CALML3之间最不同的地区和钙调蛋白)。Affinity-purified抗体显示CALML3[优秀的敏感性和特异性5,7]。石蜡包埋组织标本切的厚度6μ米,安装在带正电的幻灯片,deparaffinized,治疗H₂O₂/甲醇阻断内源性过氧化物酶活动本质上描述(10,11]。1毫米的标本接收燥热引起抗原决定基检索EDTA的pH值8.0 20分钟。非特异性蛋白质链接网站被封锁在正常山羊血清磷酸盐5%生理盐水(PBS) / 0.05% Tween-20 1 h,和部分被连续应用孵化项目中每个)(1 - 2小时在室温下affinity-purified CALML3抗体TG7 (40μg / mL Tween-20/1%正常山羊血清在PBS / 0.05%),生物素化的山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 200年在PBS / 0.05% Tween-20/1%正常山羊血清,DAKO, Carpinteria, CA),和辣根peroxidase-conjugated链霉亲和素(1:300年,DAKO Carpinteria)本质上描述(7]。幻灯片是冲洗3×5分钟在PBS / 0.05% Tween-20孵化项目。3-amino-9-ethylcarbazole的部分被孵化的H₂O₂与苏木精复染色和盖玻片安装。

两个观察者(员工外科病理学家(Thomas j . Sebo)和颌面部镶牙专家布鲁克斯(Michael d .)评估CALML3的标本进行表达。染色观察并记录模式和强度为所有类别的样本(良性、发育不良/原位癌和浸润性鳞状细胞癌)。所有幻灯片都是评估在同一放大。对于每一个标本,3 - 5个独立的领域的观点分析了2粘膜细胞层:表层细胞和基底细胞。分析细胞染色的隔间进一步细分为细胞质膜(CM)、细胞质(C)和核(N),染色分级分制评分:0:没有(不染色背景之上的消极控制孵化anti-CALML3免疫球蛋白与CALML3 preabsorbed [6]),1:弱(上面几乎没有背景,没有很强的染色细胞在特定地区),2:中级(温和的染色有不同程度的亚细胞染色),3:强烈的(强烈的染色不同的细胞定位)。细胞质膜、细胞质和细胞核为每个粘膜细胞地区单独分配一个年级。

分配一个年级的每个标本类型遵循一些基本和逻辑规则。首先,鳞状细胞最初评估使用两个低放大镜头(总放大2.5倍和5.0倍的力量25 x和50 x)获得一个一般意义上的染色强度的鳞状细胞在幻灯片上。其次,对细胞质膜染色,细胞表现出圆周膜染色或没有膜染色。第三,膜染色,除了细胞质染色,通常最显而易见的中间层的鳞状上皮粘膜细胞。细胞达到实际的表面层,例如,良性粘膜,成为夷为平地,能够区分细胞质染色和细胞质膜染色是有限的。

总是,组织样本中没有CALML3鳞状细胞的染色检测可以很快被分配一个等级的0(无染色)。在表面的鳞状细胞染色的情况,这种情况发生在25% - -50%的材料。相反,强(3 +)CALML3疣可以使用同样的方法容易确定在5% - -30%的情况下材料。在评估定位基底鳞状细胞,染色不可能很快被发现在50%至100%的情况下材料,而强(3 +)染色是非常罕见的(大约2%)。

挑战在这项研究中,所有的研究中,应用强度分级,分级进来鳞状细胞显示弱(1 +)或中级(2 +)CALML3表达式。在这些情况下,一个全面的评估染色强度低倍镜下显示染色的程度显然不能被归类为0或3 +,并仔细分析所有鳞状细胞组织样本进行了使用所有放大镜头(2.5 x 5 x 10 x, x 20和40 x的整体放大25 x, x 50, 100 x 200 x 400 x)到达成绩反映出所有鳞状细胞染色强度。因此,等级1 +(弱)表明,鳞状细胞的整体表达很软弱,只显示几乎看不见染色高于0。中间级(2 +),CALML3染色的程度感到毫无疑问存在但不一样视觉上强烈的3 +的成绩。

有时,罕见的细胞在任何给定的组织标本评分1 +和2 +显示强(3 +)或无(0)表达式。但是,没有努力是进一步分层案例材料的基础上,细胞的百分比显示一系列CALML3表达式。因此,我们的评分系统反映了总体得分CALML3染色强度。在这些实例中,两个评论家(Thomas j . Sebo和Michael d . Brooks)记录不同等级对于一个给定的情况下,rereview案件材料进行达成共识。这发生在大约10%的情况下材料。

2.3。统计方法

进行分析的目的,成绩0和1一起倒塌,报道没有/弱染色和等级2和3一起倒塌,报道中间/强大的污点。这是因为视力弱染色最密切接近无(0)染色和中间(2 +)染色最密切接近强(3 +)染色。推导出总染色分数加法的污点成绩三个细胞隔间。Cochran-Armitage测试趋势被用来评估样本的比例是否与中间/强烈的表达显著改变与疾病严重程度增加。此外,卡方检验(或确切概率法,适当地)被用来比较样本的比例和中间/强烈表达之间的良性发育不良/ CIS和侵入性组织团体。克鲁斯卡尔-沃利斯测试是用来比较总染色分数之间的三组。如果值的总体测试组差异< 0.05,然后在三组进行成对比较。分析认为,多个标本相同的病人都是独立的。所有的计算值是双面的,值小于0.05被认为是具有统计学意义。Bonferroni调整可以应用通过评估之间的成对比较三种组织类型使用一个α水平的0.0167占三个比较。使用SAS软件包进行统计分析(SAS研究所,卡里,NC)。

3所示。结果

正如我们预期从之前的研究6,8),良性粘膜健壮的疣状(数字显示1(一)和1 (b))。不同的染色是在外围(细胞质膜)和核的表面上位于上皮细胞(图1 (b))。另一方面,发育不良的样品(数字1 (c)和1 (d))和原位癌(未显示),被认为在染色强度明显下降。强大的减少(或完全缺乏)CALML3疣状的浸润性鳞状细胞癌与良性组织和发育不良/ CIS组织(数据2和3),尽管在轻度浸润性鳞状细胞癌,角质珍珠并说明温和的免疫反应性。基底细胞层总体上没有污点一样强烈更肤浅的细胞层,无统计差异被认为与基底核和胞质染色组。

表1总结了CALML3表达式结果的肤浅和基底粘膜水平,分别组织类型。因为类似的结果被发现发育异常的CIS标本,这两个组织类型为分析相结合。此外,我们发现,除了表面的细胞质膜和原子核的良性的标本,只有一小部分的其他组织地区表现出强烈的表达。因此,评估是否存在趋势表达水平与组织疾病严重程度,薄弱或没有染色的标本结合,有中级或强烈的染色(见表1)。然而,所有染色结果分解的详细总结个人组织类型是可用的。

基于Cochran-Armitage测试趋势,CALML3表达水平显著下降的疾病严重度增加以下网站:肤浅的细胞质膜(),表面核()和基底细胞质膜()。另一方面,一个显著的趋势并没有观察到表面的细胞质()和基底细胞质(),在几个发育异常的/ CIS标本比良性组织更强的表达式。基底核的网站有一个比“软弱”染色分数的任何组织类型。

卡方检验(或确切概率法,在适当的地方)是用来比较的比例与之间的一个中间或强染色标本良性的,发育不良/ CIS和侵入性组织组(表1)。良性组织标本,有更显著的CALML3表达相比,表面粘膜侵入性标本()和发育不良/ CIS标本(),揭示了总染色分数的比较(表1和图4)。这种差异在CALML3染色最为明显的细胞质膜和细胞核。发育不良/ CIS组织也有很大()的表达比浸润性表面的粘膜组织(表1和图4),这种差异最明显的证明在细胞质中(分别为50%和7.1%,)和原子核(38.9%和2.4%,)。前面列出的所有表达的比较三个组织团体之间的表面层保留统计学意义如果Bonferroni调整应用和意义是评估使用α水平0.0167而不是0.05。

表达不强的网站在基底层(表中1),尽管有证据表明在表达略有增加良性鳞状细胞的细胞质膜相比,浸润性癌(13.3%比0%,)。在分析42例鳞状细胞癌标本分别由年级,没有明显的趋势明显。

4所示。讨论

此前,失去CALML3免疫反应性与早期乳腺癌发展(7]。在这里,我们表明,尽管CALML3强烈表达了浅层次的良性口腔黏膜,口腔黏膜组织不同类型代表致癌作用的不同阶段表现出减少的CALML3表达式从良性鳞状细胞进展,发育不良的,原位癌、浸润性鳞状细胞癌。

一般来说,一种趋势,被视为疾病严重程度增加,CALML3表达减少。越分化细胞,染色的更强烈。许多良性的标本显示,细胞染色强度进一步增加从基底细胞层。基底细胞层不太成熟。随着细胞的成熟,他们分化和迁移到上层底层细胞培养。越强烈CALML3染色的外层粘膜与先前的报道是一致的,指出显著增加染色更差异化的复层上皮细胞层(6]。因此,CALML3可能在终端分化口腔角质细胞中发挥作用,提出了基底和suprabasal表皮的角质细胞在伤口愈合(12]。CALML3 calcium-sensor蛋白相关钙调蛋白,因此被认为发挥其功能通过调节特定目标蛋白质。在这其中,非传统的肌球蛋白x [13)是参与定向细胞迁移和细胞粘附,两者都是重要事件在终端角化细胞分化。CALML3的染色表面细胞的细胞质膜良性口腔黏膜可能因此反映其功能在调节MyoX集中在细胞外围(14]。钙调蛋白,CALML3有多个目标,其中一个(智商主题包含蛋白E或IQCE)最近被发现在一个酵母二者混合屏幕和可能参与DNA的蛋白质代谢(理查德·d·班尼特和伊曼纽尔E . Strehler未发表)。这样一个假定的核CALML3靶蛋白(s)可能有助于解释CALML3核染色,我们观察到表面细胞的正常口腔黏膜。然而,还需要更多的研究来确定CALML3在细胞核中的作用及其与正常上皮分化之间的关系。

目前只有少数诊断测试用于口腔癌。诊断测试的技术实施包括transepithelial刷活检/表皮剥脱的细胞学、细针吸活组织,甲苯胺蓝(15- - - - - -23]。这些技术都依赖于细胞学标记表明恶性或癌变前的细胞的存在。尽管这些测试是优于常规活检确认,因为他们是微创为患者所接受,其可靠性和有效性尚未验证(24- - - - - -26]。因为CALML3的具体表达和细胞定位显示正常的细胞功能,一个简单的诊断测试的发展潜力口腔癌使用CALML3作为标记是光明的。目前诊断筛查工具被用来可视化在正常口腔组织自体荧光损失的自体荧光指示性的组织变化或异常。的无创性筛查可以实现通过使用表皮剥脱的刷牙细胞学、minibiopsy或“swish-and-spit”过程。这将使临床医生在口腔观察可疑区域定期测试CALML3水平。CALML3表达的变化可能表明存在或口腔癌的早期发展阶段。

作者的贡献

Michael d .布鲁克斯和理查德·d·贝内特的构思和开展实验。Michael d .布鲁克斯,理查德·d·班尼特、托马斯·j·Sebo和伊曼纽尔·e·Strehler构思实验和分析数据。艾米·l·韦弗提供统计分析。史蒂文·e·埃克特和艾伦·b·卡尔为实验提供了咨询。所有作者都参与撰写了论文和最终批准的提交和发布版本。

确认

这项研究是在进行IRB-approved协议754 - 04与金融支持从梅奥研究生院和梅奥诊所,罗彻斯特,美国。