文摘
纳米技术经历了一段时间的快速增长,从而导致不断增加工程纳米材料在日常生活中的应用。几种不同类型的纳米颗粒被设计是用于广泛的应用由于其高的表面体积比导致独特的物理和化学性质。到目前为止,银纳米粒子(AgNps)已经使用在许多不同的医疗设备比其他纳米材料,主要是由于其抗菌性。尽管承诺带来的优势利用AgNps在医疗应用程序中,可能与不可避免的人体接触相关的健康影响AgNps以来担心因为他们使用清楚地了解他们的特定的相互作用与生物系统尚未达到。鉴于这样的考虑,目前的工作目标是细胞内的形态分析的行为AgNps直径10 nm,特别注意他们的交互与线粒体。
1。介绍
银离子的抗菌特性是众所周知的。事实上,白银已经使用自古以来就以不同的化学形式治疗烧伤,伤口,和几个不同的病原菌引起的感染。有趣的是,几千年来,有银和银离子杀菌性能(1,2),包括(1)多级抗菌效果的几率,大大减少了阻力,因为这银的效果被认为是由于堵塞呼吸酶通路改变微生物的DNA和细胞壁(3,4];(2)针对耐多药生物有效性(5,6];(3)低系统毒性(7,8]。
在过去的十年中,各种先进的银基医疗设备已经发展的相当大的变化的结构、组成、内容和银。近年来,纳米技术提供了生产纯银纳米颗粒的方法,显著增加银离子释放的速度和其抗菌活性。
使用口腔植入部分和完全无齿的病人的康复是被广泛接受的,即使失败发生时(9]。植入物的机会整合例如可以损害intraoral存在的细菌和伴随的炎症反应。vt .骨结合的长寿植入物可以被黑客咬合的过载和/或菌斑引起peri-implantitis,根据植入几何形状和表面特征。动物研究,横向和纵向观察男人,和协会的研究表明,peri-implantitis的特点是微生物群与牙周炎(高比例的革兰氏阴性杆菌厌氧,能动的有机体,和螺旋体),但这并不一定是一个因果关系10]。然而,为了防止这种细菌转变,可以考虑以下措施:剩余牙周健康的牙齿(防止细菌易位),避免加深高口袋,和一个相对平滑桥台和植入物表面。最后,牙周炎加强吸烟与口腔卫生不良等因素也会增加的风险peri-implantitis [11]。
口腔居住着各种各样的微生物。在口腔微生物群落和存在主要是生物膜是幼童腹壁薄弱12]。这些生物膜可以负责一些当地的疾病,包括牙周和高的疾病,这可能导致牙齿或植入物的损失,分别。银纳米粒子的潜力(AgNps)减少细菌粘附牙科植体表面,防止生物膜的形成已经被许多作者研究[13,14),以减少高感染的风险。Ag)的另一个有趣的应用程序NPs在牙科相关骨移植和膜的结构和表面改性,以防止污染的风险和相关感染常见,骨扩增技术,如引导骨再生(GBR)和引导组织再生(GTR)使用15- - - - - -19]。
尽管Ag NPs的广泛使用,信息的缺乏对人类细胞的生物效应和环境仍然存在。一些作者研究的潜在毒性Ag NPs在不同的细胞系统中,包括细菌和哺乳动物细胞。这样的细胞毒性研究认为Ag NPs几个可能的机制,包括溶解或从纳米粒子释放银离子,细胞膜完整性的破坏,氧化应激,蛋白质或DNA结合和损伤,活性氧的生成和凋亡细胞死亡。毒性机制似乎取决于纳米粒子的属性,例如表面积,大小和形状,覆盖剂、表面电荷,粒子纯度,结构性扭曲,和单个粒子的生物利用度。这一观点,在以前的工作,我们的团队相比,银几个基于Ag酱产品的结构和内容,主要关注关注Acticoat [20.,21]。
Acticoat纳米晶体银敷料由两层镀银高密度聚乙烯,封闭粘胶/涤纶非织造布有孔的的核心。元素组成Acticoat超声焊接在一起。当水滋润,微观纳米晶体的金属银敷料在伤口床被释放。银具有抗菌作用,破坏细菌,包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(22]。
扫描电镜的图像本产品表明,聚乙烯纤维涂上了Ag)。涂层均匀,均匀。Ag纳米晶体的大小确定的放大50000;图像显示该粒径范围从200到450纳米。
此外,它的细胞毒性进行了测试在体外和在活的有机体内对人类。在目前的工作研究进行关注Ag纳米颗粒的细胞内的行为形式发布acticoat伤口敷料。
2。材料和方法
2.1。人类皮肤样本
研究患者合格如果招募< 24小时postburn受伤,受到partial-thickness烧伤的影响。患者被排除在外,如果他们受到完整的厚度烧伤或有免疫系统或银及其化合物具有很高的敏感性。
病人也被排除在外的伴随疾病(如糖尿病和心脏或肾脏疾病),化学或电烧伤、多发性创伤,或被< 5 > 60岁。皮肤活检获得的一组符合条件的患者同意采取活检材料科学的目的,研究了符合赫尔辛基宣言的道德准则。
活检收集用拳4毫米内径7毫米的深度。在敷料删除7天的治疗后,两个副本,一个来自愈合区域,另一个从一个无法愈合区。十多天的治疗后用一个新的酱,另一个重复样本来自新愈合的区域。
2.2。TEM
样本保存在2.5%戊二醛/ 0.1钠甲次砷酸盐缓冲一夜之间在4°C。样本处理1% OsO4/0.1 M钠甲次砷酸盐缓冲和解决方案使用乙醇脱水浓度增加的嵌入在环氧树脂环氧树脂。超薄部分(LKB超微切片机,斯德哥尔摩,瑞典)获得和处理1%醋酸双氧铀和1%柠檬酸铅。分析的样本TEM(电子显微镜服务、生物学系、帕多瓦大学帕多瓦,意大利)使用Tecnai G12电子显微镜(范,加速电压100 kV)。图像采集系统由摄像头、TIETZ (Gauting TIETZ视频和图像处理系统GmbH,德国),和范TIA成像软件(范公司晚宴过后,或者,美国)。
2.3。细胞培养
人真皮成纤维细胞准备根据Rheinwald和绿色的修改版本的协议。上皮表dispase去除后,真皮是切成小块(2 - 3毫米2)和成纤维细胞被孤立的顺序与0.25% w / v胰蛋白酶消化w / v 20分钟和0.25%胶原酶4 h。这些细胞被培养与杜尔贝科修改鹰介质(DMEM), (Lonza开发。米兰,意大利)补充10%胎牛血清(的边后卫)(Bidachem公司。、米兰、意大利100单位/毫升)和青霉素和100年μg / mL链霉素,形成完整的DMEM (cDMEM)。媒介是每周两次改变,细胞被胰蛋白酶处理收获。从文化板块分离后,成纤维细胞培养在3 d collagen-based支架(MatriDerm Suwelack博士皮肤和卫生保健AG) Billerbeck,德国)的密度105细胞/厘米2,获得重建dermal-like组织在体外。细胞生长在800年的3 d支架了10天μL cDMEM。上方的Ag NP-based敷料应用3 d细胞培养。
2.4。MTT试验
确定细胞生长动力学有或没有Ag) NPs的MTT-based (methyl-thiazolyl-tetrazolium)进行了细胞毒性试验的方法Denizot和朗小修改。这比色测定是一种间接的方法评估细胞生长和增殖。MTT给黄色溶液,与脱氢酶减少或降低代理存在于细胞新陈代谢活跃,产生一个紫蓝色的水不溶性染料化合物,甲瓒。用有机溶剂提取脂溶性甲瓒和量化spectrophotometrically。MTT甲瓒生产的数量成正比细胞的代谢活动。收获后培养基、细胞培养3 h在37°C 1毫升的肝癌和0.5毫克/毫升溶液在磷酸缓冲盐溶液(PBS)。切除后MTT解决方案通过吸管,0.5毫升的10%二甲亚砜在异丙醇(iDMSO)添加到提取样品中的甲瓒为30分钟37°C。对于每一个样本,吸光度值在570海里被记录在200年重复μL整除存入microwell板使用multilabel板读者(Victor 3珀金埃尔默,米兰,意大利)。Ag NP-treated细胞中的线粒体功能之间的比率计算处理样品的吸光度在570 nm和控制样品的吸光度表示为一个百分比。
2.5。形态分析
同时与MTT分析、形态分析进行了复制样品。后删除Ag NP-based敷料和培养基,其余dermal-like组织嵌入在最佳切削温度(10月)化合物,在液态氮冷冻,保存−直到削减80°C。组织部分(> 7μ米厚度)获得使用低温恒温器(CM1950,徕卡、米兰、意大利)和沉积到gelatin-coated玻璃幻灯片。他们与绝对丙酮固定10分钟在室温和低温贮藏−20°C到使用。为了可视化细胞分布在支架和调查核分裂的可能性,成纤维细胞细胞核是沾H33342荧光染料(西格玛奥德里奇,米兰,意大利,最后2的浓度μg / mL)。样本观察使用蔡司Axioplan荧光显微镜配备数码相机(DC500,徕卡、米兰、意大利)。
为了量化活细胞的数量和突出的存在凋亡细胞,一组平行的在体外实验进行了。赫斯特H33342染料添加到3 d dermal-like细胞培养与碘化YO-PRO-1同时染料(激发波长491 nm /发射波长509 nm,分子探针)。赫斯特H33342染料染色细胞核在整个人口的细胞,而YO-PRO-1污渍特别凋亡细胞。YO-PRO-1绿色荧光探针,可以进入细胞一旦他们的质膜已经达到一定程度的渗透率。
细胞膜在细胞凋亡逐渐渗透和YO-PRO-1可以自由进入细胞和核酸结合,增强其荧光强度。许多不同的细胞数,计算活细胞是细胞染色的数量之间的差异与赫斯特H33342和沾染了YO-PRO-1凋亡细胞的数量。后立即移除Ag NP-based酱的三维细胞培养,赫斯特33342年和YO-PRO-1添加到细胞培养。在37°C细胞孵化一个小时,然后,文化多井板包含细胞被转移到一家共焦激光扫描显微镜监控YO-PRO-1和赫斯特荧光。
荧光共焦激光扫描显微镜(Axiovert 100、蔡司、德国)与10°放大的目的是用于检测赫斯特H33342和YO-PRO-1染色细胞。荧光染料,YO-PRO-1很兴奋,25 mW氩激光在488海里。排放记录超过510海里。赫斯特的H33342荧光检测在460 nm激发后346海里。显微镜是配备了电动舞台,LSM 510(蔡司)软件使记忆的舞台的位置。对于每一个样本,图片被预设阶段在不同深度位置。
2.6。ROS测量
OxiSelect ROS分析工具包是一个测量细胞测定羟基,过氧化氢和其他细胞内活性氧的活动。的测定采用cell-permeable fluorogenic探针DCFH-DA,扩散进入细胞,通过细胞酯酶脱去乙酰基nonfluorescent DCFH(图1)。ROS的存在,DCFH迅速氧化高荧光光纤。荧光标准荧光板的读者阅读。
3所示。结果与讨论
纤维母细胞中深层烧伤皮肤能够吸收AgNps(图1红色箭头)。细胞健康正确的形态学特征表明:质膜完整性,核完整性(蓝色*)和活跃的核仁(蓝色箭头)。纳米粒子是由哺乳动物细胞通过胞饮等机制,内吞作用依赖于小窝和脂质筏组成、clathrin-dependent内吞作用和吞噬作用10),内吞作用{Endo(内)细胞增多症(细胞)},是一个过程,一种物质收益条目没有穿过细胞膜进入细胞。这个过程被分为三种不同类型:吞噬作用、受体mediatedendocytosis胞饮。受体介导的内吞作用是内部机制的具体分子吸收到细胞内。特异性的结果从一个receptor-ligand交互。等离子体膜受体靶组织的专门细胞外配体结合。内部过程,配体吸收。在每种情况下,内吞作用导致细胞内囊泡的形成由于内陷的质膜和膜融合。
AgNps在这方面也不例外;如图2实际上,正常的人类皮肤成纤维细胞占据AgNps(红色箭头)通过内吞作用(蓝弧)。报道在图3粒子的直径从医疗设备20 nm,释放(注:纤维母细胞大小约为100μ米)表明他们聚集能够通过内吞作用进入细胞。
至于AgNps的胞内定位,他们的能力形成总量约200海里(图4红色箭头)确认。他们缺席细胞核,内质网,高尔基氏复合体(图5)。他们也形成团聚体在细胞核周围的地区(图5红色箭头)。透射电子显微镜(TEM)分析表明AgNps(数据的缺失5和6红色箭头)在线粒体(数字5和6红色*)和核(图5蓝色*)。AgNps关闭线粒体的外膜,如图7红色箭头(线粒体红色*)。线粒体是组织在细胞质的细胞核周围的区域(图8广场叫红色),招聘更大数量的AgNps(图8红色箭头)存在于细胞质中。
(一)
(b)
在这些条件下,线粒体是小(图8红色*)、圆和高数。
调查如果Ag NPs能影响细胞的生存,我们评估对成纤维细胞的毒性在体外。collagen-based支架采用支持3 d细胞培养的成纤维细胞获得dermal-like组织。形态分析进行了探讨细胞核形态和细胞支架内的分布。报道在图9(一个)dermal-like组织出现的多层细胞,成纤维细胞能够增殖和填补支架过程中实验。没有检测到凋亡的迹象。相似的细胞分布的Ag NP-treated样品(图9 (b))。有趣的是,尽管观察线粒体功能,减少核仍似乎现在和破损。没有可观测存在凋亡的身体或核碎片。
(一)
(b)
定量比较的活细胞的数量报告处理和未经处理的三维细胞培养在图10 ()。结果表明,活细胞的数量随着时间的增加以同样的速度在两个样本。YO-PRO-1试验表明,没有可见凋亡细胞在示例Ag NPs对待。
(一)
(b)
三、六、九天MTT检测进行评估处理Ag NPs线粒体功能的细胞。细胞毒性在体外通常是估计使用比色检测;他们的原则是减少四唑盐、MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)甲瓒。减少由线粒体进行还原酶,是一种间接测量细胞群的生存能力。
报道在图10 (b)时间减少,代谢活动中观察到细胞治疗Ag NP-based调料。这证实了AgNPs损害线粒体功能的能力。MTT测试应用程序的例子对AgNps细胞毒性(ROS)出现在每一个细胞,线粒体和细胞质氧化过程产生的。在环境压力下,细胞反应通过增加活性氧生成,这导致失衡ROS生成和他们的中和抗氧化的酶和低分子量的抗氧化剂,谷胱甘肽等。氧化还原平衡的干扰被定义为氧化应激。氧化应激条件下细胞活性氧积累,并涉及到修改后的抗氧化反应信号通路。
为了测试如果这种损伤可能与ROS生产我们测试了ROS代。报道在图11有一个活性氧产量AgNPs的存在。这个生产时间减少,根据线粒体捕捉AgNPs的能力。
4所示。结论
ROS增加纳米颗粒治疗已被证明是由于生物效应的关键因素在活的有机体内和在体外(23- - - - - -25]。从我们的TEM故事可以判定AgNps积累在线粒体外。可能这是线粒体损伤的直接原因,呼吸链的扰动函数导致活性氧生成和氧化应激。未发现AgNps细胞核内,而且没有观察到支离破碎的细胞核。尽管存在AgNps细胞质内,核膜完整,是圆形的。核仁可见确认了染色质不凝聚,但它有一个结构,允许转录。我们假设一旦AgNps被释放到细胞质中,他们也会生成活性氧簇ROS。
我们推测,线粒体是原子核周围移动作为物理化学屏障阻止活性氧和AgNps到达核膜。如果线粒体膜分解由于活性氧的作用,抗氧化的酶,如线粒体超氧化物歧化酶(mtSOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和硫氧还蛋白过氧化物酶(26,27),从线粒体释放到细胞质中淬火ROS。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。