文摘

最近,一个包含prereacted复合树脂玻璃的抗菌活性离子交联聚合物(S-PRG)填充了。我们检查的影响一个S-PRG洗出液对各种生物的活动变形链球菌和Porphyromonas gingivalis。坚持的能力变异链球菌是由微量滴定板分析评估;蛋白酶和白明胶酶活动的p . gingivalis被合成底物水解和明胶电影检查现场试验,分别。Coaggregation的p . gingivalis与梭菌属nucleatum也检查。S-PRG洗出液被发现抑制链球菌粘附。S-PRG洗出液抑制蛋白酶和白明胶酶的活动p . gingivalis和coaggregation之间p . gingivalis和f . nucleatum。这些结果表明,S-PRG洗出液抑制链球菌粘附抑制蛋白酶和coaggregation活动p . gingivalis。这些发现可能会促使小说研究的策略防止龋齿和牙周炎。

1。介绍

龋齿和牙周炎是两个成年人牙齿脱落的主要原因。龋齿来自口腔菌群之间的相互作用,牙齿,和饮食因素。最重要的是生龋齿的细菌变形链球菌顽强glucan-coated表面,产生大量的胞外多糖,是高度引起酸化的和耐酸1- - - - - -4]。牙菌斑的殖民化变异链球菌在龋齿起着决定性作用。糖代谢行为的核心变形链球菌,蔗糖,最生龋齿的膳食碳水化合物是用于生产的细胞外多糖生物膜矩阵,促进协会的变形链球菌与牙菌斑。

牙周炎是由periodontopathic细菌等Porphyromonas gingivalis,革兰氏阴性,black-pigmented asaccharolytic厌氧细菌(5]。p . gingivalis有几个生物活动,如蛋白酶分泌和coaggregation6,7]。我们以前分离蛋白酶gingipain并报告其抑制活性在人类中性粒细胞(8)及其在小鼠毒性脓肿模型(9]。Gingipain有关促进经济增长p . gingivalis通过Tannerella forsythensis(10]。Gingipain也涉及白明胶酶活性(11),这可能会导致牙周组织退化。p . gingivaliscoaggregates等口腔细菌梭菌属nucleatum,这些multistrain复杂的社区的形成是一个初始的和关键的步骤在牙周炎的发病机制12]。

抑制细菌的活动被认为是一个关键形态控制龋齿和牙周疾病。各种策略也已经被开发出来,包括抑制蛋白酶活性(13,14和抗菌牙科材料中的应用15,16]。最近,一个包含prereacted复合树脂玻璃的抗菌活性离子交联聚合物(S-PRG)填充了17]。S-PRG填料颗粒之间形成的酸碱反应fluoroaluminosilicate玻璃和聚丙烯酸(18氟化)和有能力释放和充电19,20.]。在这里,我们报告一个S-PRG洗出液的抑制对依从性的影响变异链球菌蛋白水解,白明胶酶,coaggregation活动p . gingivalis。

2。方法和材料

2.1。菌株和文化条件

变形链球菌JCM 5705在GAM肉汤培养(Nissui制药有限公司,东京,日本)与2.0%蔗糖24 h。p . gingivalis写明ATCC 33277保持在CDC厌氧血琼脂(美国),医学博士,正欲Cockeysville厌氧大气中(80% N2,10% H2,10%的公司2)和接种大豆胰蛋白酶的肉汤(美国Difco实验室、底特律、MI)与氯高铁血红素(5补充μg / mL)和甲萘醌(1μg / mL)。f . nucleatum写明ATCC 10953年和25585年成长为之前报道(21]。

2.2。人类唾液准备

全唾液样本收集刺激石蜡的咀嚼口香糖从三个健康的人类参与者(平均年龄: 3 1 。 7 ± 5 。 5 年)。混合唾液离心机在10000年×在4°C g 20分钟,上层的孵化在56°C 30分钟灭活补充,这可能影响细菌的生存能力(22]。样本使用无菌消毒膜滤器(孔隙大小:0.22μm;美国微孔,Billerica的)和细菌粘附试验立即使用。

2.3。细菌粘附试验在96 -微量滴定板

每个应变是细菌粘附的化验使用先前描述的方法(23]。细菌粘附试验开始,precultures变异链球菌储存在−80°C生长在10毫升的脑心浸液(BHI)中(美国Difco实验室、底特律、MI)为24小时37°C到全面增长。评估细菌粘附,20μ180年细菌细胞悬液和Lμ大豆胰蛋白酶的肉汤的L(没有葡萄糖,补充与0.25%蔗糖;tsb;Wako纯化学工业,日本大阪)被添加到每个平底96孔的微量滴定板(Nunc a / S,鲁开德、丹麦),预镀与人类唾液。评估的影响S-PRG洗出液对细菌粘附,不同百分比的S-PRG代替培养基。控制,磷酸盐(PBS)是用来代替S-PRG。盘子被孵化在37°C 16 h在厌氧条件下,液体介质是移除。井与蒸馏水冲洗一次,晾干,沾0.25%红色染料,持续15分钟。染色后,盘子与蒸馏水冲洗以去除多余的染料,然后风干。细菌质量是用乙醇溶解,随着细菌染色物质在每个样本量化通过测量吸光度在492 nm使用标(日出彩虹热;Mannedorf Tecan集团、瑞士)。

2.4。准备用提取的p . gingivalis细胞

p . gingivalis细胞对数阶段后期大豆胰蛋白酶的肉汤被离心收获和PBS洗。50微克的这些细菌是悬浮在0.5毫升的PBS,声波降解法和细胞都中断了在冰24]。完整的细胞被离心分离,上层清液的蛋白质浓度测量。

2.5。制备S-PRG洗出液

S-PRG洗出液制备方法的藤本et al。25),条件,产生的高浓度离子,被应用。简而言之,S-PRG填料(SHOFU Inc .)、日本京都)混合等量的蒸馏水和动摇轻轻在室温下24 h。填充材料被过滤删除。离子溶液离心去除任何残留的不溶性材料,收集得到上清液是用作S-PRG洗出液。元素分析的离子(Al B Na、Si和Sr)释放S-PRG填料进行了使用电感耦合等离子体原子发射光谱(icp - aes;icp - 8000,日本岛津公司有限公司,日本京都)。分析后进行了准备校准曲线对应于每个元素(标准溶液浓度;Si: 0、0.5、1、5 ppm;Sr: 0、5、20、50 ppm;B: 0, 10、50和100 ppm; Al: 0, 0.5, 5, and 10 ppm; Na: 0, 0.5, 20, and 50 ppm). Concentration of F was also determined using a fluoride ion electrode method after preparing its calibration curves (standard solution concentration: 0.1, 1, 5, and 10 ppm). A fluoride electrode (Model 9609BN, Orion Research Inc., MA, USA) connected to a pH/ion meter (720A, Orion Research Inc.) was used to measure the F concentration of each solution. Each test solution was diluted to obtain a fluoride ion level of less than 5 ppm, and 0.5 mL of an ionic strength adjuster (TISAB III, Orion Research Inc.) was added to 5 mL of each diluted solution to measure F ion concentration. For each ion under investigation, the amount released into the solution was expressed in ppm, as well as a cumulative amount in per gram of S-PRG filler weight (mg/g). To exclude the effect of ions in saliva preparation, no saliva was added to the reaction mixtures of each experiment.

2.6。蛋白酶的活性P.-gingivalis-Sonicated提取

N -benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide盐酸盐(BAPNA)购买的西格玛奥德里奇(圣路易斯,女士,美国)。BAPNA是一种合成的底物,发展黄色精氨酸的网站由trypsin-like蛋白酶消化。酶化验的方法执行Potempa et al。26]。简单地说,P.-gingivalis -用提取被添加到一个水反应混合物BAPNA 1毫米,0.2米Tris-HCl (pH值7.5),CaCl 0.1 M氯化钠,5毫米2半胱氨酸,10毫米。的控制,P.-gingivalis -用从反应混合物中提取了。背景颜色是通过测量光密度的计算P.-gingivalis -用提取。分析S-PRG的影响,反应混合物的蒸馏水S-PRG解决方案所取代。酶测定混合是在37°C的环境中30分钟,进行比色测定(OD 405海里)来确定颜色的代谢物(作为衡量蛋白酶活动)。

2.7。白明胶酶的活性P.-gingivalis-Sonicated提取

白明胶酶点进行试验使用一个修改的方法Sumantran et al。27]。不同浓度的S-PRG洗出液被添加到反应混合物BAPNA 1毫米,0.2米Tris-HCl (pH值7.5),CaCl 0.1 M氯化钠,5毫米2半胱氨酸,10毫米。不同浓度的P.-gingivalis -用提取和混合,还添加了连续用蒸馏水稀释。一个15μL现货的混合物放入gelatin-coated x射线胶片(柯达超速的,伊士曼柯达公司,罗切斯特,纽约,美国)和孵化37°C在100%湿润的气氛中。的控制,p . gingivalisSE从反应混合物中删除。2 h后,x射线胶片被湿润的盒子,用自来水洗净。gelatinase-positive样本,表面膜的应用领域是移除,揭示电影的基本色。

2.8。Coaggregation之间p . gingivalis和f . nucleatum

进行coaggregation试验根据友善的方法和霍尔特(28]。简单地说,细菌细胞被离心收获,洗两次(10000 g×15分钟在4°C),然后在预还原coaggregation resuspended缓冲区(CB;10毫米三、0.15 M氯化钠,0.1毫米CaCl2,0.1毫米MgCl2h·62O (pH值7.5))在660纳米光学密度2.0。菌株为coaggregation检查结合同等体积的一个测试应变控制(CB)总量的2毫升和厌氧孵化。评估的影响S-PRG洗出液、10%、50%或100%的蒸馏水在CB取代S-PRG洗出液。30和60分钟后,反应混合物被视觉评估评分系统(0,+ 1、+ 2、+ 3、+ 4)所描述的友善和霍尔特28]。所有化验都至少重复三次。代表结果显示,再现性的象征。

3所示。结果

3.1。的本质S-PRG洗出液

icp - aes和氟离子电极方法的结果表明,离子浓度S-PRG洗出液是如下:,40.8 ppm;B, 1907.8 ppm;是的,28.1点;Sr, 218.3 ppm;和F, 127.0 ppm。洗出液的pH值为7.8,所有这一批的实验研究。没有pH值变化和降水发生在洗出液添加到反应混合物。

3.2。链球菌粘附效应S-PRG洗出液

替代培养基与PBS或S-PRG依从性降低变异链球菌。(图S-PRG显示最大的抑制效果1)。当超过20%的培养基代替S-PRG洗出液,减少大约20%细菌附着。


图1
依从性的变形链球菌JCM 5705年的存在和缺乏PBS或S-PRG洗出液。依从性评估的影响S-PRG洗出液,不同百分比的S-PRG代替培养基(圆)。控制,磷酸盐是用来代替S-PRG(三角形)。板块在37°C孵化16 h在厌氧条件下,沾0.25%红色染料,染色的数量在一个ethanol-solubilized样本量化通过测量吸光度在492海里。数据是代表三个独立实验表明标准差和酒吧。
3.3。S-PRG对蛋白酶活性的影响p . gingivalis

用提取样本,准备从50μ克/毫升p . gingivalis细胞,使用。S-PRG对蛋白酶的抑制作用显示有20%的活动(图2)。然而,没有影响S-PRG时观察到的数量P.-gingivalis-sonicated提取是增加或减少。


图2
BAPNA水解活动(作为蛋白酶活性的指标)的存在和缺乏S-PRG洗出液。P.-gingivalis -用提取物添加到反应混合物。分析S-PRG的影响,蒸馏水混合控制(三角形)取代S-PRG解决方案(圆)。彩色的代谢物被量化使用比色吸光度测定405海里。数据是代表三个独立实验表明标准差和酒吧。
3.4。S-PRG对白明胶酶活性的影响p . gingivalis

图3显示的结果白明胶酶试验。S-PRG白明胶酶活性的抑制p . gingivalis。这种抑制作用是观察到的100倍稀释用提取。S-PRG洗出液和缓冲对明胶的电影没有任何影响。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
白明胶酶试验。不同数量的S-PRG洗出液被添加到反应混合物。P.-gingivalis -用提取接着说,混合物连续用蒸馏水稀释。一个15μL现货的混合物放入gelatin-coated x射线胶片和孵化37°C 2 h在湿润的气氛中在用自来水洗净。去除凝胶表面的斑点面积下透露影片的基本色,表示白明胶酶活动的存在。(一)x射线胶片试验后的照片。(b)白明胶酶斑点试验的结果。
3.5。效果的S-PRG Coaggregation之间p . gingivalis和f . nucleatum

f . nucleatumATCC25585展出coaggregation与p . gingivalisATCC33277。相反,f . nucleatumATCC10953没有coaggregatep . gingivalisATCC33277。S-PRG抑制coaggregation,如图4。当10%的CB代替S-PRG洗出液,只有弱coaggregation观察之间p . gingivalis和f . nucleatumATCC25585。当50%的CB代替S-PRG洗出液,没有coaggregation这些菌株之间的观察。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
Coaggregation之间p . gingivalis和f . nucleatum在的存在和缺乏S-PRG洗出液。(一):coaggregation的照片。(b): coaggregation化验的结果。

4所示。讨论

S-PRG牙科填料广泛应用于许多领域,如复合树脂,粘合剂,假牙,密封剂,等等29日),部分原因是他们充电与氟离子的能力,促进牙本质补充矿质的后续版本。因此,S-PRG预防龋齿的形成的作用已被调查。

这里有报道,S-PRG洗出液抑制依从性变异链球菌。细菌感染的第一步是坚持主机,并抑制细菌粘附可能成为预防龋齿的有效手段之一。最近,一个在活的有机体内实验表明,减少牙菌斑形成一个S-PRG-containing树脂块比两种材料(17]。此外,的依从性变异链球菌saliva-treated树脂表面显著降低在S-PRG-containing树脂比另两种材料,尽管所有的材料具有显著的杀菌活性(17]。从这些结果,我们可以得出这样的结论:S-PRG可以抑制变异链球菌在固体树脂和可溶性形式。

S-PRG洗出液被发现有一个BAPNA-hydrolyzing和白明胶酶活动的抑制效果p . gingivalis。的蛋白水解活性p . gingivalis主要是从其gingipains的生产。这些都是已知的与组织破坏和宿主免疫紊乱,导致牙周炎的发展,因此抑制gingipain活动应有利于维护牙周健康。白明胶酶相关进展的继发龋牙修复(30.]。桑托斯等人报道,氧化锌水泥和汞合金压制白明胶酶活动,这可能会导致这些材料的龋齿的预防作用[31日]。它已经知道S-PRG限制龋齿发展由于其释放氟(25,32),但我们发现它可能另外防止继发龋通过抑制白明胶酶活动恢复网站。白明胶酶的测定,进行这项工作,不是很敏感,我们只能确定它是积极的还是消极的。我们需要进行更具体的分析来阐明S-PRG白明胶酶活动的影响。

对之间的coaggregation S-PRG有抑制作用p . gingivalis和f . nucleatum。Coaggregation periodontopathic细菌与细菌有关附件的牙龈缝隙(33]。最近,一些金属离子抑制的coaggregating能力被发现p . gingivalis他们预计将抑制的解决p . gingivalis在牙龈沟34]。S-PRG也可能干扰的形成先进multistrain牙周环境中的细菌群落。

这些抑制效应的机理还不清楚,需要澄清。S-PRG众所周知,释放各种离子,包括 F − ,艾尔。3 +,老2 +, 年代 我 O 3 − , B O 3 3 − 和钠+(25,35]。硼是已知的抗菌活性皮肤疾病和牙周炎(36,37和抑制细菌和真菌群体感应38]。群体感应是生物膜的形成的关键因素,所以在链球菌抑制这个函数可能是一个好的候选S-PRG的行为机制。在p . gingivalis,负责S-PRG行动的机制可能涉及金属盐和离子的控制调节细菌酶活性。Gingipains已知需要金属离子达到最大酶活性(39由金属盐[],而明胶酶抑制40]。因此,S-PRG可能影响酶活性的调节这些金属盐和离子的浓度。

一些实验报告中没有适合统计分析。我们不是重复每个试验证实其再现性和代表性数据。进一步的工作现在进展中获得更多的统计数据和描述的抑制机制S-PRG洗出液p . gingivalis。Saku等人都执行在体外和在活的有机体内实验(17]。这里我们报道在体外数据,我们需要进一步执行在活的有机体内实验证实S-PRG的生物学效应。

总的来说,这是第一个报告显示的效果S-PRG洗出液对链球菌粘附和蛋白酶和coaggregation活动p . gingivalis。这些发现可能会促使小说研究的策略防止龋齿和牙周炎。

确认

本文的部分支持由年轻科学家(没有的补助金。23792532 n .铃木),科研(没有的补助金。23593078 t . Hirofuji),和先进的科学研究补助金(m . Yoneda和t . Hirofuji)从教育部,日本的文化、体育、科学和技术。