文摘

客观的。根尖周的牙周炎是牙根尖周组织的感染和炎症性疾病引起的口腔细菌入侵的根管。在目前的研究中,分析微生物群的感染牙根都使用厌氧培养和细菌分子生物学技术鉴定。方法。知情同意是获得所有科目(年龄范围,34 - 71年)。九个感染牙根尖周病变7受试者包括在内。收集样本感染牙根,紧随其后的是厌氧文化中心血琼脂平板上。7天后,集落形成单位(CFU)数和孤立的细菌被16 s rRNA基因测序鉴定。结果。意思是细菌计数(CFU)在牙根 (范围 ),厌氧细菌占优势(89.8%)。主要的分离是Olsenella(25.4%),Mogibacterium(17.7%),Pseudoramibacter(17.7%),丙酸菌属(11.9%)和Parvimonas(5.9%)。结论。厌氧培养和分子生物学技术的结合可以迅速分析根管感染的微生物群。绝大多数的隔离受感染牙根是厌氧细菌,这表明环境在牙根是厌氧的,因此支持厌氧菌的生长。

1。介绍

根尖周的牙周炎是牙根尖周组织的感染和炎症性疾病引起的口腔细菌入侵的根管,从而导致牙髓学的病变的形成。微生物群的感染牙根已报道包括厌氧细菌,通过采用各种改善厌氧培养技术,如厌氧手套箱(1- - - - - -3]。然而,鉴定细菌种类只利用这些技术是耗费大量的时间和人力。近年来,分子生物学方法如随机克隆和16 s rRNA为了概要介绍了序列分析微生物群(4,5]。然而,生活和死亡的细菌细胞的微生物群不能分化只利用分子生物学方法,结果,活的致病性细菌细胞在牙髓学的损伤还有待充分确定。

因此,在本研究中,我们应用分子生物学技术,即限制片段长度多态性分析(PCR-RFLP)扩增16 s rrna菌进行基因测序,厌氧培养后细菌菌落,细菌识别,为了澄清活细菌细胞的构成的根管感染的微生物群。

2。材料和方法

2.1。主题

主题与根尖周的牙周炎(五个女性和两个男性;年龄、34 - 71岁),参加临床牙髓,东北大学医院,仙台日本,随机选择了这项研究。根尖周的牙周炎被诊断为临床特征的基础上,也就是说,腐烂的气味,自发性疼痛,灵敏度(温柔)冲击/闭塞,脓液排出,脓包和瘘,radiographical发现。选择牙齿临床上没有明显的边缘泄漏,有足够的日冕结构适当隔离橡胶坝,并免费牙周袋深度超过4毫米。基于历史,所有受试者医学健康,收到任何抗生素采样前的3个月。知情同意是来自所有科目,本研究研究伦理委员会批准的东北大学研究生院牙科,日本仙台。

2.2。抽样和DNA提取

橡胶坝是孤立的每一个齿,最重要的领域是与碘甘油牙科消毒剂消毒昭和(昭和Yakuhin Kako,东京,日本)和70%乙醇。日冕访问腔是准备消毒与无菌生理盐水灌溉下高速钻。髓室时,无菌。15 k文件(GC、东京、日本)介绍了运河的长度是决定使用一个顶点定位器(Root ZX、盛田昭夫、日本)。收集从一个顶端运河的牙质样品申请集中运河无菌k文件的大小。采样结束后,清洁和塑造的根管进行无菌k的文件(从# 15 # 55,GC,东京,日本)。一个intracanal药剂,氢氧化钙糊(UltraCal XS, Ultradent产品公司,约旦南部,UT,美国)应用,和日冕访问腔和一个临时的水泥密封(磷康;贺利氏Kulzer日本,日本东京)。

每个文件由消毒钢丝切断刀立即被转移到厌氧手套箱(Hirasawa、东京、日本)含80% N2,10% H2,10%的公司2。在盒子,每个样本都悬浮在1.0毫升的消毒40毫米磷酸钾缓冲(pH值7.0),涡流之后,悬架与聚四氟乙烯分散均质器。连续稀释10倍(0.1毫升)被传播到CDC厌氧菌的表面5%羊血琼脂(BD,富兰克林湖,新泽西,美国)板(复制)和孵化在厌氧手套箱37°C为7天。孵化后,菌落(cfu)统计,所有殖民地从适当稀释板有< 100殖民地(意思是13.1;范围8-31殖民地)亚文化。

2.3。DNA提取和鉴定DNA序列分析

基因组DNA提取每一个殖民地InstaGene矩阵设备(美国Bio-Rad实验室、里士满、CA)根据制造商的指示。

16 s rRNA基因序列被使用通用引物PCR扩增27 1492 r和f和TaqDNA聚合酶(热明星Taq主,试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国)根据制造商的指示。引物序列是:27 f;5′aga GTT TGA中医TGG CTC AG-3′- 1492 r, 5′TAC GGY TAC CTT GTT ACG行动条t - 3′(6,7]。放大使用PCR进行热循环议员(豆类生物医学,Ohtsu,志贺,日本)编程:15分钟在95°C初始热激活的1分钟和30个周期为变性94°C, 1分钟55°C退火,1.5分钟在72°C扩展,最后10分钟在72°C扩展。PCR产品1%琼脂糖凝胶上分离(高强度分析年级琼脂糖、Bio-Rad实验室)在Tris-borate EDTA缓冲区(硼酸三100毫米,90毫米,1毫米EDTA, pH值8.4),用溴化乙锭染色的,拍摄的紫外线照射下,和他们的大小1466个基点(ca)被证实与分子大小标记(100个基点DNA阶梯,表达载体,卡尔斯巴德,ca,美国)。

16 s rRNA基因单独消化下丘脑-垂体-肾上腺轴的二世(FastDigest Fermentas, Cosmo生物、东京、日本)根据制造商的指示。2%琼脂糖凝胶上分离消化产品如上所述。

隔离被确定初步根据RFLP分析(8- - - - - -13)以及形态学数据,即殖民地表象和革兰氏染色法。然后,代表隔离被序列分析如下所述最终确定,并没有异常在相同的RFLP组。PCR产物纯化了illustra GFX PCR DNA和凝胶带净化设备(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国),然后在Fasmac测序(厚、神奈川、日本)使用BigDye终结者循环测序工具和一个自动化的DNA测序仪(棱镜- 3100,应用生物系统,日本东京,日本)。引物1492 r序列(至少900个基点),和部分16 s rRNA基因序列与那些从基因库数据库使用爆炸搜索项目通过国家生物技术信息中心的网站。细菌物种是由序列相似性百分比(> 97%)。

3所示。结果

意思是细菌计数(CFU)在牙根 (范围 )(表1)。

表1
临床特征的主题和细菌数量在目前的研究。

主要gerera是Olsenella(25.4%),Mogibacterium(17.7%),Pseudoramibacter(17.7%),丙酸菌属(11.9%)和Parvimonas(5.9%),从而表明厌氧细菌感染牙根中完全占据着主导地位(89.8%)(表2)。在物种水平,Mogibacterium timidum(17.7%),Pseudoramibacter alactolyticus(17.7%),Olsenella profusa(14.4%)和Parvimonas微米(5.9%)是主要的(表2)。

表2
数量的细菌分离获得的根管感染。

4所示。讨论

在目前的研究中,绝大多数的隔离感染根管牙本质是厌氧细菌(表2)。结果表明,感染牙根是厌氧的环境,因此支持厌氧细菌的生长。发现按照先前的研究在样本口腔龋齿,当使用类似的厌氧发酵过程2,3,14- - - - - -17]。

厌氧菌株,属于Olsenella,Mogibacterium,Pseudoramibacter,丙酸菌属,和Parvimonas包括大多数隔离受感染牙根在当下研究(表2与先前的研究),在协议(1,2]。除了Pseudoramibacter和Parvimonas在这些研究[1,2),梭菌属还发现主要属中分离。这些研究结果表明,厌氧细菌在感染牙根,常见,这些细菌可能导致一些对牙髓学的感染病因的角色。

在目前的研究中,分子生物学技术,也就是说,PCR-RFLP和测序,被应用于厌氧培养细菌菌落后,细菌鉴定。厌氧培养和分子生物学技术的结合,利用也在先前的研究14,15),似乎不仅相对快速和低成本,而且准确的识别口腔微生物群,而不是仅仅使用厌氧文化。然而,本研究样本的分析是只限制而不是通过分子生物学技术,例如,PCR或实时PCR分析,没有目标noncultivable细菌等的方法密螺旋体属。此外,进一步的研究,包括检查每个孤立的生物学特性,是必要的,因为细菌在牙髓学的病变的作用或复杂的性质仍不确定的方法本研究虽然其特点可能会猜测一般特征的基础上,引用类型菌株。

最近开发的技术,焦磷酸测序已经应用于分析受感染牙根的微生物群的构成(18,19),这表明微生物群是高度多样化的建议之前(20.]虽然技术是高成本的。由于这项技术是一个文化无关的方法以及实时PCR扩增和随机克隆分析,不仅包括生活还死细菌细胞的根管感染的微生物群。

在初步(额外)研究中,未发现细菌的样本收集前牙根管闭塞,也就是说,在第二次或第三次访问根管治疗(数据未显示),这表明适当治疗可能会改变微生物群和牙根彻底的环境。

总之,微生物群的感染牙根可以迅速分析了厌氧培养和分子生物学技术的结合。绝大多数的隔离受感染牙根是厌氧细菌,这表明环境在牙根是厌氧的,因此支持厌氧菌的生长。

承认

t .佐藤和k .山木份额第一作者。本研究支持的科研补助金(22592112,22592112,22592112,23792201)从日本促进社会科学。