文摘

这项研究的目标。例唇腭裂(CLP)是一种常见的先天性畸形orofacial地区。自体髂骨植骨被频繁用于关闭颚骨缺损的裂口。自相关手术相当入侵的病人,这是非常重要的开发一种新的微创技术。本研究的目的是检查骨再生与间质干细胞(msc)治疗骨缺损的人为地创造了狗下颌间隙。材料和方法。骨缺损是双边在贝格尔号上门牙地区狗。msc来源于髂骨髓培养和移植碳酸羟基磷灰石(CAP)粒子到骨缺损区。骨再生被标准化评估咬合的x射线检查和组织学观察。结果。六个月后移植,实现完美的下巴的关闭间隙在实验方面。x射线和组织学检查显示再生骨在实验方面几乎是相当于原来的毗连颚骨裂。结论。建议应用msc与帽粒子可以成为新的治疗方式对骨再生CLP的病人。

1。介绍

例唇腭裂(CLP)是一种常见的先天性畸形orofacial地区表现为下颌间隙由于腭货架上正确地融合的失败。中电控股是由多种遗传和环境因素,中电控股的发生率是0.19%,日本(1]。一般来说,CLP病人接受阴道整型和初始腭成形术在婴儿阶段作为初始治疗,言语治疗也复苏所需的语音功能。此外,不连续的上牙弓由于下颌间隙经常导致咬合不正,和矫正治疗是进行最CLP病人获得稳定的阻塞。

1972年,博因河和金沙(2)报道,光滑喷发的狗骨移植区域诱导和优秀的牙科拱形式是通过自体髂骨植骨前宠物喷发。从那时起,自体髂骨植骨被频繁用于关闭颚骨缺损的裂网站建立均衡的咬合3- - - - - -5]。

然而,收集相关的手术从髂骨移植材料相当入侵,给病人带来巨大的压力。因此,人工骨移植材料再生而不是骨髂,如羟基磷灰石(HAP)和β磷酸三钙(β已经提出tcp), (6,7]。迄今为止,一般临床应用这些材料仅是有限的,因为难以诱导犬喷发和牙齿移植区域运动(6,7]。因此,重视开发一种新的微创技术。

组织工程和干细胞移植是一种预期的候选人以更少的投入来实现骨骨缺损手术为髂骨提取入侵。最近,干细胞已被应用于再生医学,甚至等内部器官的血管,神经,和心脏(8- - - - - -10]。对骨再生,间质干细胞(msc)移植材料将成为有用的。msc占0.001 ~ 0.01%的亚细胞成分在骨髓中,有可能分化成多个间质血统如软骨细胞,脂肪细胞,成骨细胞通过适当的生物刺激(11]。足够数量的分离的骨髓msc可以使用骨髓穿刺针吸气。疼痛评分显著低于CLP病人从髂骨骨髓穿刺比那些接受了传统手术分离髂骨髓,表明病人的骨再生使用msc可以缓解压力(12]。然而,很少有研究与msc在CLP患者骨(13,14]。

三个元素(细胞、支架和生长因子)被认为是成功的组织再生的关键。在目前的研究中,我们使用碳酸羟基磷灰石(CAP)粒子作为支架。帽包含3 ~ 5%碳酸根离子代换HAP晶格结构和骨骼和牙齿的主要矿物成分。因此,帽脚手架有相当高的生物相容性与身体,建议作为支架材料的一大优势。

在这项研究中,我们对骨再生和帽脚手架使用MSC移植人工骨缺损。

2。材料和方法

2.1。制备人工下颌间隙小猎犬狗

三个月大的女小猎犬的狗被使用( = 3 )。许可在这一系列的实验研究是广岛大学的动物实验委员会授予的。简而言之,上第三门齿双方提取在全身麻醉下(Somnopentyl,日本共立公司,日本东京)。肺泡和腭骨地面约5毫米宽10毫米,长度建立双边骨缺陷。的osteoepiphyses被缝合粘膜外包。抗生素(上边,拜耳医药保健、东京、日本)被用来防止感染之前和之后的手术。个月愈合期后,人工下巴裂是由x射线成像检查评估骨缺陷是否充满了骨自然痊愈。

2.2。隔离msc和文化

在治疗期间,髂骨骨髓msc被隔绝的狗和讲究的。骨髓是吸气骨髓穿刺针(泰宇医药有限公司,日本东京)骨髂的小猎犬的狗在全身麻醉下与戊巴比妥(Somnopentyl,日本共立公司)。msc被播种密度的5×105每100 mm细胞细胞培养盘(康宁,纽约,纽约,美国)在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫;NaHCO擤鼻涕、Nuaille、法国),10%3,0.7μg / mL谷酰胺,抗生素,5%以下有限公司2气氛在湿润孵化器在37°C。媒介改变了每隔一天,直到融合msc是亚文化。second-passaged细胞用于实验。

2.3。移植体

msc培养1×108细胞/好,脱离文化板块就在移植。未烧结的帽粒子(600 - 800年μ米)包含约10%碳酸根离子作为支架。一百八十毫克帽粒子与msc允许细胞混合附加限制粒子的表面上。移植组成同样体积的限制粒子没有msc是用作控制。

2.4。msc移植到人工下颌间隙

准备一个月后的人工下巴崩裂,人工下颌间隙在双方是在全身麻醉下开了戊巴比妥(Somnopentyl,日本共立公司)。msc与帽粒子被移植到左边的骨缺损(实验),而移植组成帽的粒子就填在右边裂(控制)。骨缺损充满移植覆盖poly-lactic-co-glycolic-acid (PLGA)屏障膜(膜GC, GC有限公司东京,日本),以防止泄漏的移植。随后,粘膜缝合亲密。抗生素(上边,拜耳医疗)被用来防止感染手术前后。

2.5。评价骨再生的x射线成像

骨再生是评估使用标准化的咬合的x射线图像和组织学检查。咬合的x射线检查在这项研究中都是标准化使用底片夹保持位置在x射线辐照器,对象,和电影(图1(一))。

(一)
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(b)
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图1
x光检查骨再生(a)模式的标准化咬合的x射线检查。举行了电影上齿列平行的小猎犬的狗,和x射线辐照垂直电影250 mV。x射线的角度和距离灯泡使用定位器和电影都是标准化的。(b)限制粒子的radio-opacity没有信号在人工下巴裂区测量在标准化咬合的x射线图像。

的radio-opacity人工下颌间隙测量使用面积NIH-image1.59软件(美国国立卫生研究院的贝塞斯达,华盛顿特区的美国)在标准化的咬合的x光图像(图1 (b))。再生骨和限制粒子的信号进行评估的radio-opacity下颌间隙区域。

2.6。通过组织学染色评估骨再生

再生组织的一小块分开的狗在全身麻醉下戊巴比妥(Somnopentyl,日本共立公司)3和6个月后移植。组织标本立即用4%多聚甲醛固定在磷酸盐(PBS) 5分钟,1个月与EDTA脱钙,嵌在石蜡中。组织部分7μ米厚度都是和苏木精和伊红染色(他)。

毛细血管再生地区的数量是依靠组织部分使用相差显微镜(BZ8000,日本基恩士,大阪,日本)。

2.7。统计分析

执行的移植msc使用3狗。均值和标准差(SD)从获得的数据进行了计算,然后进行学生的t以及使用Graphpad Prism 4.0软件(Graphpad软件公司,圣地亚哥,美国)检查显著差异在意味着1%和5%水平的意义。

3所示。结果

3.1。Intraoral发现之前和之后的msc移植人工下颌间隙

双边人工下颌间隙是在狗上颌骨(图准备的2(一个)箭头)。人工下巴裂开了3个月后,并没有显示自发恢复骨缺损。因此,限制粒子有或没有msc移植骨缺陷(图2 (c)箭头)。移植后,没有炎症移植区域所示。六个月后移植,在移植牙槽嵴区域的形状保持实验和控制(图2 (d))。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图2
Intraoral发现之前和之后的msc移植人工下颌间隙。Intraoral图像后(a)制备两国在上颌骨的人工下颌间隙(箭头,下巴裂),(b)和(c)之前的msc移植后帽粒子下颌间隙(3个月后准备人工下颌间隙)。右边的裂端(控制端)充满了限制粒子,而裂左边(实验)充满了msc和帽粒子(箭头)。(d)移植后6个月。
3.2。影像学发现之前和之后的msc移植人工下颌间隙

没有自发恢复骨缺陷显示了x光检查后3个月两国人工下颌间隙(数据的准备3(一个)和3 (b)箭头)。观察移植后,帽粒子图像不透明区域的下颌间隙(图3 (c)箭头)。三个月后移植,radio-opacity限制粒子的减少在控制端与在实验方面(图3 (d)、箭头)和6个月后更大幅下降(图3 (e)箭头)。实验一侧radio-opacity 6个月后增加而限制粒子的数量减少与3个月。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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(f)
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图3
影像学发现之前和之后的msc移植人工下颌间隙。标准化的咬合的x射线图像(一)制备两国在上颌骨的人工下颌间隙后,(b)和(c)之前的msc移植后帽粒子下颌间隙(3个月后制备的人工下颌间隙;箭头,下颌间隙)。右边的裂端(控制端)充满了限制粒子,而裂左边(实验)充满了msc和帽粒子,(d) 3个月(e)移植后6个月(箭头,移植区域)。(f)的radio-opacity人工下颌间隙面积测量的标准化咬合的x射线图像后移植人工下颌间隙。再生骨和限制粒子的信号进行评估的radio-opacity下颌间隙区域。 ,* ,* * 。

帽的radio-opacity粒子在实验方面显著( < 0 。 0 5 )低于在控制端(图3 (f))。另一方面,radio-opacity再生骨在实验方面显著(3个月, < 0 。 0 5 ;6个月, < 0 。 0 1 )高于在控制方面。这些结果表明限制粒子的消化和钙化的下巴裂实验。

3.3。组织学观察移植前后骨髓间充质人工下巴的间隙

三、六个个月后移植,移植区域分离的组织和评估组织学观察。

三个月后移植,一个大的数量帽的粒子保持在控制方面,而只有少数帽粒子被发现在实验方面intraoral照片(数字4(一)和4(b))。此外,帽粒子变得比原来的小粒子(600 - 800年μ米)在实验方面。组织学观察显示周围成纤维细胞的细胞的存在限制粒子在控制端(数字4(c),4(d)4(e))。另一方面,没有显示粒子,成纤维细胞的细胞,观察新骨形成实验(数据4(f),4(g)4(h))。


图4
组织学观察移植前后骨髓间充质人工下巴的间隙。再生组织分离3和6个月后移植。组织部分是和苏木精和伊红染色(他)。Intraoral图像上移植后3个月(a)控制端(帽)和(b)实验(msc和帽粒子)。组织切片显示成纤维细胞的细胞和炎症细胞在帽粒子在控制端(c、d、e)。新骨形成在实验方面展示了广泛(f, g, h)。Intraoral图片移植后6个月(i)控制端和(j)实验。组织切片显示,新骨形成发生在本地控制方面(k, l, m)。另一方面,观察新骨形成在几乎整个地区在实验方面(n和o)。

六个月后移植,在控制端帽粒子的数量减少了,但许多粒子仍,而几乎没有限制粒子实验一边观察(数字4(我),4(j))。组织学检查显示,新骨形成出现局部移植地区在控制端,但周围成纤维细胞的细胞仍位于帽粒子(数字4(k),4(左)4(m))。另一方面,观察新骨形成在几乎整个地区在实验方面,和帽粒子几乎已消失(数据4(n)和4(o))。

毛细血管的数量船只明显( < 0 。 0 1 )在实验方面比在控制端(图3和6个月后5)。


图5
的毛细血管再生地区人工下颌间隙。毛细血管再生地区数量指望使用相差显微镜组织部分。 ,* * 。

4所示。讨论

在目前的研究中,证明了人工下巴裂骨再生的msc移植帽粒子。Radio-opacity再生组织在实验方面显著高于在控制方面,表明骨髓间充质新骨形成的贡献。帽粒子用于本研究是未烧结的,代替3 - 5%的碳酸根离子HAP结构,导致不稳定的晶体结构与运气。自纯HAP的溶解度很低,它将需要很长时间消化和更换通过新骨如果用于移植骨缺损。在一项研究15),帽子上面移植牙芽不打扰牙爆发,表明其在体内生物相容性高,溶解度。然而,没有报告颚骨再生的间隙使用脚手架未烧结的限制。在我们之前的研究中,牙槽骨再生是通过移植βtcp在鼠标6]。然而,CLP牙槽骨再生的支架需要一些特殊的特征。的移植βtcp是导致移植后犬喷发和牙齿运动障碍(6]。一般来说,对齐牙齿的牙颌间隙区域运动或执行移植骨再生治疗CLP后患者(3,16]。因此,下颌间隙应该充满骨正常代谢,让牙齿喷发或运动。为此,在活体移植材料具有高溶解度,可以消化的很快就被认为是合适的。

在目前的研究中,骨再生伴随着限制粒子的吸收上限粒子和msc移植的实验。同时,限制粒子的吸收和新骨形成在控制端慢得多。在活体,破骨细胞和成骨细胞在不同differentiational阶段作为一个生理单位(基本多细胞单元;反复BMU)控制骨重塑。骨吸收和形成的平衡调制BMU活动,和新骨形成骨吸收后被激活。在骨重塑的激活阶段,破骨细胞分泌酸和特定的酶连续消化bone-salt和骨基质蛋白,分别为(17]。因此,推测消化移植材料起着至关重要的作用在新骨形成和骨再生实验和控制之间的差异可能是由于帽的速度吸收在这项研究。

在目前的研究中,毛细管的数量船只在再生组织移植后在实验方面明显大于在控制方面。建议msc表达血管内皮生长因子(VEGF),这是有利的对骨再生诱导血管化(18]。自增强血管化有利于诱导破骨细胞在骨再生区,假设msc移植可能导致血管生成,从而增强破骨细胞诱导的帽消化。msc移植的可能相关性不仅其向成骨细胞分化能力,而且感应的毛细管血管。如果这是真的,未分化的msc移植的优势与骨髓间充质成骨细胞分化的应用。然而,目前尚不清楚是否还是移植msc分化成成骨细胞表达了移植后细胞因子或生长因子。跟踪的移植msc将有利于解决上述问题未来的研究。

此外,移植帽粒子控制端的封装了成纤维细胞的细胞,和这可能是另一个原因为限制粒子的延迟消化。然而,目前尚不清楚为什么帽粒子在实验方面没有封装与成纤维细胞的细胞。因此,限制消化机制也应在将来的研究中阐明。

一个特定的需求下巴裂骨再生的的指导或齿运动到新形成的骨。在这项研究中,足够数量的牙槽骨齿运动形成的人工下颌间隙的移植msc与帽粒子。矫正牙齿运动是骨重建的结果,具有高与血管生成的相关性[19]。自再生组织在控制端有少量的血管以及未消化的帽粒子,难以矫正牙齿运动被推测是由于低骨重塑。

总之,结果表明,msc移植的限制粒子可以在人工下巴再生骨裂。的移植msc与帽粒子下颌间隙对CLP病人可能是一个新的治疗模式。

承认

作者感谢Yuhiro酒井法子,研发部生物材料集团和GC corp .)请提供帽粒子。没有利益冲突。