(保利的有效性)- 4-vinyl-N-hexylpyridiniumbromide作为抗菌植入涂层:一个在体外研究

文摘

vt .骨结合牙科植入物的临床成功取决于周围软硬组织的强烈依恋。植入物表面细菌粘附可引起炎症反应和可能影响治疗和长期成功的牙科植入物。有前途的植入涂料应该减少细菌附着,但允许上皮和结缔组织附件。因此,本研究检验了保利的生物活性效应——(4-vinyl-N-hexylpyridiniumbromide)关于典型的口腔细菌以及cytotoxicitiy人类细胞考虑silicate-containing表面的聚合物不同的连接方法。结果显示,假定的抗菌和生物相容性聚合物在涂料中的应用策略是受各种参数的影响。发表的研究结果对于降低细菌粘附无法验证使用口腔病原体而hexylated聚合物似乎强烈的软组织粘连的问题。牙科植入物基本方面关于创新的涂料(表面粗糙度、厚度、烷基化、结合其他聚合物)必须被认为是在进一步的调查中。

1。介绍

口语在恢复牙科植入物发挥重要作用及其临床成功导致了他们的广泛使用1]。vt .骨结合牙科植入物的应用已被证明是一个优秀的方法取代缺失的牙齿部分或全部康复的病人。除了审美的改进和有利的语音学,植入物促进恢复咀嚼。今天,implant-supported假肢supraconstructions越来越重要,已部分取代传统假体治疗(2]。自实施口腔植入四十年前,几项研究已经分析了改善植入材料,植入物表面,和植入物的设计,以达到最佳的骨整合(3- - - - - -5]。虽然有相当多的信息和进展植入体的骨性愈合,对细菌植入表面之间的相互作用的过程和周围组织(1]。只有清楚的是,在植入物表面细菌粘附危及治疗和长期成功的牙科植入物(3,6]。

生物膜的形成等固体表面在口腔牙齿,假体或implant-anchored supraconstructions已经开始几分钟后口腔卫生(7,8]。首先,薄薄一层由唾液生物聚合物和可移动的各种蛋白质,称为“收购”或初始薄膜,其次是主要细菌殖民者,通常需氧和兼性厌氧的革兰氏阳性球菌样的,如链球菌不同物种(例如,美国杂志,唾液链球菌,美国缓和的,美国oralis)[9,10]。这最初的殖民扩张与随后的保护性细胞外基质沉积连续创建必需的先决条件的二次微生物,尤其是厌氧革兰氏阴性球菌样的和棒9- - - - - -11]。根据生物膜细菌的组成和数量的增长,在牙周炎症反应和高软、硬组织发生,从而导致坏的情况下进步的骨吸收和早期植入失败(7,12- - - - - -15]。

因此,有效抗菌涂料的发展尤其是对口腔越来越重要的应用程序(16]。朝着这个目标,舵柄等人表明,聚- (4-vinyl-N-alkylpyridiniumbromide) (pVP)涂在玻璃幻灯片杀死了超过90%的沉积金黄色葡萄球菌细胞和革兰氏阳性细菌的99%葡萄球菌epidermidis以及革兰氏阴性细菌铜绿假单胞菌和大肠杆菌使用时(16]。然而,这项研究没有包括初级殖民者从口腔致病性的相关性。

旁边涂层策略所需的抗菌效果,紧密连接的周围软组织和随后的持久闭塞是主要的重要的长期成功的口腔植入策略(17]。如前所述,豪雅et al。牙龈成纤维细胞粘附pVP-coated钛以及增殖能力的细胞都可能减少(18]。这减少生物相容性聚合物链接被修改部分可征服的,展示不同的绑定策略的重要性对涂层基质的生物有效性18,19]。

本研究的目的是验证已知的不同镀膜玻璃幻灯片抗菌性能与聚(4-vinyl-N-hexylpyridiniumbromide)关于典型的口腔细菌(变异链球菌,美国杂志)。为了分享一些表面增强和修改的影响,不同程序的绑定silicate-containing表面的聚合物纳米多孔和非晶态二氧化硅等。加上一个合理的生物相容性,这种涂层策略为未来的应用将提供机会在假肢牙科植入陶瓷。

2。材料和方法

所有的实验都是基于纯化圆玻璃表(0.13 - -0.16毫米厚,大约1.13厘米²表面积)。光盘部分作为衬底表面修改应用在非晶硅层,分别为纳米多孔构象。最后,所有的样品都涂有潜在的杀菌聚合物聚(4-vinyl-N-hexylpyridiniumbromide)或无效,nonhexylated聚合物作为控制(16]。

2.1。创建非晶和纳米多孔表面

在目前的研究中,不同种类的玻璃表面。在未经处理的玻璃、非晶和纳米多孔结构与杀菌聚合物涂层。

生成纳米多孔玻璃幻灯片,EO structure-regulating代理_20.阿宝_70年EO_20.(德国Sigma-Aldrich)是解决EtOH, H₂啊,之前和HCl添加Tetraethoxysilan (teo)。玻片(门泽尔,德国)旋转涂布和干燥60°C过夜。最后,有机成分被煅烧在415°C。

过程为非晶表面相当除了失踪structure-regulating代理。

2.2。玻璃样品的预处理

清洗。
裸玻璃幻灯片被声波降解法在丙酮和乙醇清洗。非晶和纳米多孔表面没有清洗。

激活。
所有玻璃样本处理水虎鱼腐蚀(H₂所以₄:H₂O₂6:4)15分钟。

与APTMS涂层。
激活后,幻灯片满是10% 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APTMS)解决方案与H 2分钟,然后冲洗₂O和丙酮。

转换1 4-Dibrombutan。
样本的混合物1中转移,4-Dibrombutan Nitromethan (CH₃没有₂),Triethylamin 2 h在65°C,紧随其后的是冲洗Nitromethan和空气干燥。

2.3。涂层与聚(4-vinylpyridinium)有或没有Hexylation

为了创建hexylated涂料进行预处理玻璃、幻灯片被转移在溶液组成的聚(4-vinylpyridinium Sigma-Aldrich,德国),1-Bromhexan, Nitromethan,一夜之间在75°C的环境,在甲醇冲洗彻底,最后风干。

程序控制样品(标准玻璃幻灯片没有非晶或纳米多孔表面;nonhexylated涂料)相当1-Bromhexan除了失踪。

结果四种样品组(A = nonhexylated净化玻璃聚合物;B = hexylated聚合物纯化玻璃;C = hexylated聚合物在无定形二氧化硅;D = hexylated聚合物nonoporous二氧化硅)与未经处理的玻璃控制(E)被用于物理和生物分析的影响来确定不同表面修饰对生物相容性和杀菌效果。

2.4。表面Roughness-Atomic力显微镜(AFM)测量

小规模的不同种和裸玻璃表面的表面粗糙度测量原子力显微镜(AFM)。这些样本被风干,然后坚定地安装在一个玻璃盘使用双面胶带。每个样品的表面形貌是由接触探测AFM(美国庇护研究MFP-3D,加州圣芭芭拉分校)使用一个标准的氮化硅尖(奥林巴斯OMCL AC240TS)。两个参数,RMS (nm)和平均Dev (nm),描述表面粗糙度,确定为每个示例中,使用的IGOR Pro WaveMetrics数据处理软件包。均方根值和平均Dev计算样品a e(图的中心1)。

2.5。细胞培养

调查生物相容性的玻璃种,人类齿龈第八段的成纤维细胞(HGFIB Oligene,德国)。探讨粘附细胞的数量在不同的涂层的修改,进行细胞培养使用标准的文化过程。成纤维细胞生长在175厘米²细胞培养瓶大约80%融合在一个有限公司10%₂气氛在100%湿度和37°C。媒介使用标准Dulbeco修改鹰介质(DMEM、Biochrom、德国)含10%胎牛血清(的边后卫,锅,德国)和抗生素(100 U /毫升中青霉素,100μg / mL链霉素)。当发生大量的纤维母细胞生长,细胞被洗与汉克的缓冲盐溶液(哈佛商学院、PAA、德国)没有Ca, Mg,和酚红,发布与胰蛋白酶(胰蛋白酶/ EDTA,胰蛋白酶的0.25%,0.02% EDTA)。胰蛋白酶化是停止使用培养基,细胞数和播种24-well微量滴定板。

2.6。标准曲线

细胞被量化的基础上测量LDH活性。

24-well板块包含稀释系列从人类牙龈成纤维细胞(10⁵,,,,,细胞每)被播种的4倍样品标准曲线。24 - 72小时后,使用了两个24-well板块;种子细胞计数的一个检测,另一个为评估每口井的总乳酸脱氢酶的活动。

2.7。计算的细胞数量

细胞计数进行24和72小时后使用一个逆显微镜(Nicon Eclipse TS 100,尼康公司,东京,日本)。细胞24-well板被释放与胰蛋白酶和计算计数室(纽鲍尔)通过计算16个值/稀释。

2.8。乳酸脱氢酶测定

从所有类型的聚合物涂层镀膜玻璃盘和裸玻璃盘和哈佛商学院从井中提取和冲洗。细胞细胞溶解triton - x - 100 (Sigma-Aldrich,德国)。颜色反应(Cytotoxity检测设备,罗氏,德国)被用来量化释放乳酸脱氢酶在492 nm和650 nm光度计(Tecan无限F200多功能读者)。4井/播种密度的结果取平均值。对于每个稀释,总LDH释放所有的细胞粘在一个被设定在与总细胞数取决于细胞计数。标准曲线是一个二阶回归(图2)。

2.9。分析测试项目

每组样本模拟,以及控制,被安置在24-well盘子的浓度细胞每好每毫升的好。贴壁细胞表面测量24和72小时后乳酸脱氢酶测定。测试项目与哈佛商学院和转移到新的洗24-well盘子。细胞过程避免失真的结果符合周围的塑料。

结果表示为每厘米细胞计数²相对于增长的表面积,细胞培养塑料100%,,并以图形的方式说明。

识别所有粘附细胞的增殖率,每厘米的细胞计数²相比表面积的24至72小时。由此产生的增长率是条形图所示。

2.10。共焦激光扫描显微镜

细胞形态学研究通过染色每个样本5μg / mL钙黄绿素(英杰公司、德国)。随后,一裸,一种玻璃盘和每种类型的表面改性进行了分析通过共焦激光扫描显微镜在24和72 h(数字3(一个)和3 (b)数据7(一)和7 (b))。在染色之前,哈佛商学院的细胞被洗两次,孵化10分钟,最后洗再次与光学考试前哈佛商学院共焦激光扫描显微镜(样品形貌,徕卡TCS SP5)。这种微观方法给高分辨率光学图像,并允许拓扑复杂对象的三维重建。

2.11。细菌培养

细菌粘附pVP-coated玻璃表相比,控制样本进行了研究变形链球菌和链球菌肝病杂志(数据8和10)。

纯培养的细菌菌株在整除准备和冷冻的股票。种植,两菌株接种到大豆胰蛋白酶的肉汤培养基(TSB 30 g Trypticase酱油汤(Becton, Dickinson), 3 g酵母(罗斯、德国);pH值7.1 - -7.3调整为37%盐酸(j.t贝克、荷兰)),发展到后期固定相,和孵化旋转(700 rpm) 24小时37°C。文化是离心机在2000 g和4°C,持续15分钟。细菌颗粒被两次10毫升的50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值7.5;1:20和双重蒸馏水稀释121.14 g三羟甲基氨基甲烷(罗斯,德国)液和37%盐酸(j.t贝克、荷兰))。细菌被resuspended在20毫升相同的缓冲区。标本涂上变形链球菌被镀的吸光度1.242(相当于吗cfu /毫升)和样本覆盖着链球菌肝病杂志吸光度的1.193(相当于4,cfu /毫升)。测试项目孵化在湿室温柔旋转1 h在37°C,然后用1毫升双重蒸馏水冲洗6倍,和固定在2.5%戊二醛溶液(罗斯,德国,1:10与PBS稀释)30分钟在4°C。之后,细菌一个个独立王国在4°C冷却24 h,满1毫升磷酸缓冲盐(PBS, w / o Ca、Mg;低内毒素;足总。Biochrom,德国)。微生物沾1%吖啶橙(罗斯,德国,1:10稀释50% EtOH)在室温下和孵化1 h。随后,玻璃表与蒸馏水冲洗以去除多余的染料,然后涂上2毫升PBS,分析了共焦激光扫描显微镜放大40倍和63倍。

2.12。统计分析

文档和评估的数据进行数据处理程序SPSS / PC 18.0版本Windows (SPSS Inc .)、芝加哥、生病,美国)。比较细菌粘附在不同聚合物表面与方差分析进行测试,经过测试平等的方差与矫正或Tamhane测试,与显著性水平(数据9和11)。

3所示。结果

3.1。表面Roughness-Atomic力显微镜(AFM)测量

种玻璃往往比未经处理的玻璃(表粗糙1,图1)。

3.2。细胞培养实验

3.2.1之上。标准曲线

的关系测量LDH浓度和成纤维细胞的数量,基于细胞计数,显示通过一个二阶多项式回归。系数测定24小时后是0.9983和0.9961 72 h后,接近1的最优值。

3.2.2。乳酸脱氢酶测定

24小时后粘附细胞的数量相似的样本组,B和c的波动相对于细胞培养塑料控制不到10%,这是在实验不准确(图2)。另一方面,有一个显著减少粘成纤维细胞的计数抽样D。

72 h后,A组的细胞计数是大约相同的细胞培养塑料。细胞计数组B和D和净化玻璃相似,但低于A组和细胞培养塑料。C组的细胞计数更低(图2)。

3.2.3。增殖率

确定细胞的增殖行为在不同的表面,细胞计数每厘米²增长表面积比较在24和72 h。细胞增殖的最佳条件是由细胞培养提供塑料,其次是控制和组,这些组表现出典型的形态学和高纤维母细胞生长。扩散较低组B和c, D组增殖率高,虽然细胞粘附24 h后相对较低。

3.2.4。样品形貌的调查

24小时后的微观调查的结果而LDH测定的结果。控制和组表现出完全粘人牙龈成纤维细胞(数据3(一个)和7(一))。更少的细胞粘附在组B和C(数字4(一)和5(一个))。这可能是解释如果成纤维细胞只有弱束缚,然后失去了在染色过程中,运输和存储在生理盐水。这是符合非典型形态出现在组B, C, D,圆形的细胞。细胞计数似乎与净化玻璃和样品低于a细胞似乎更小更紧凑或可能已经失去了在运输和清洗,这将不会出现在LDH值只要胞内LDH浓度仍然不受影响。样本维数最低的展出成纤维细胞,这是不完全的。这是与LDH的结果(图一致6(一))。

有一些差异72 h后LDH测量和钙黄绿素染色。控制、A组和细胞培养塑料都表现出完全粘成纤维细胞(数据3 (b)和7 (b))。B和C组较低的成纤维细胞扩散和更多的圆形(数字4 (b)和5 (b))。纯化的细胞计数明显降低玻璃和A组,支持的LDH值。D组表现出相似的形态和数量组B和C(图6 (b))。

3.3。细菌培养的研究

3.3.1。样品形貌的显微图变形链球菌

控制和组表现出短链变形链球菌,不断播种。控制和组表现出密集的细菌粘附,这有点大在A组播种,细胞密度,并粘附在B组更高,这也表现出聚合形成。细菌粘附在团体在C组低于A, B, C组和d,播种密度是恒定的玻璃板,尽管有异常在边缘,减少聚合形成和细菌粘附。样本D表现出不断播种和最高数量的细菌adhesion-possibly由多层和聚合形成(图8)。

表面的增长变形链球菌是定量相似组A、B和c细菌生长在D组比这更高,但低净化玻璃(图9)。

3.3.2。样品形貌的显微图链球菌肝病杂志

不断的播种和密集的细菌粘附是一贯发现链球菌肝病杂志。组A, B,和控制表现出的长链链球菌肝病杂志。细菌密度最低的是控制(图中找到10 ())。没有明显的定量差异。

C组暴露明显细菌的粘附链球菌肝病杂志在细菌表面的边界链站在垂直表面(图10 (b))。

细菌粘附与净化玻璃(图最低11)。

4所示。讨论

vt .骨结合牙科植入物的长期成功是基于一个复杂的相互作用的各种因素(18,20.,21]。其中,常数细菌生物膜的形成以及低效的软组织属于最严重的粘连和教唆peri-implantitis momentary-deficient-solved问题和可能导致早期口腔植入失败(3,12- - - - - -14,22]。因此,在本研究不仅pVP-coatings的有前途的抗菌特性方面分析了典型的口腔细菌的细胞毒性也不同镀膜玻璃幻灯片以及表面预处理的表面增强的影响。

因为美的原因tooth-like半透明生物相容性以及优势,低血小板粘附,断裂韧性,加上一个合适的植入物等使用镶面金属框架,牙科陶瓷的站将增加在未来20.,23,24]。由于硅酸玻璃和陶瓷都提供组织的表面,是适应调节聚合物绑定,玻璃盘被用于实验模型底物涂以pVP。都有相同的表面由非晶和纳米多孔二氧化硅,但表面结构中存在差异,随着二氧化硅表面比纯净的玻璃。此外,纳米多孔二氧化硅毛孔在纳米范围内,这可能符合一种纳米多孔涂层表面积和插入剂为化学修饰毛孔。

与舵柄等人的结果在目前的研究中,口腔细菌变异链球菌和美国杂志显示显著增加依从性在所有种样品相比,未经处理的玻璃控制。因此,似乎不那么相关的细菌粘附pVP是否hexylated或衬底与二氧化硅的先决条件。在体外研究表明,化学成分,生物材料表面的粗糙度,疏水性能,指控有强烈影响微生物粘附和随后的生物膜的形成6,12,25- - - - - -27]。作为一种比未经处理的玻璃样品是粗糙,这可能会增加细菌粘附虽然只在另一项研究表面粗糙度0.2以上μm显著影响斑块的形成(13]。在目前的研究中,控制眼镜,所有聚合物治疗谎言远低于这些限制。然而,观察不同的表面粗糙度的修改与细菌粘附的密度。使用样品的表面电荷特征已经通过接触角测量和荧光素染色测试控制聚合物之间的连接净化玻璃修改以各种方式(19]。接触角测量显示更大的表面电荷比净化玻璃nonhexylated pVP,而hexylated pVP表现出最高的。越来越接触角表示的增强疏水性(19,28),与先进的微生物附着取决于有机体的结合,媒介,下层(28,29日]。关于荧光素染色试验,这种染料结合第四纪氨基酸组目前聚合物hexylation之后。hexylated pVP,带电氨基酸组的密度4.5和4.9进行μ摩尔* L⁻¹*厘米⁻²,而例如,octylated和decylated聚合物浓度较低,导致更少的抗菌活性(19]。因此,hexylated聚合物的涂层与更高浓度的季胺基组表明聚合物的一种改进和更有效的绑定到表面,导致增加了细菌疏水性和更多的吸引力在同一时间16,19,30.,31日]。

另一个重要方面在表面涂层效果当然会看到厚度,可以影响与预处理的衬底32- - - - - -34]。瓦格纳与椭圆对称的调查(35]表示之间的显著差异明显的非晶涂层(50 nm)和hexylated表面二氧化硅(5海里)。本研究的实验结果显示非晶涂层的特殊效果,这可能会联想到这一点。坚持变异链球菌只显示大规模聚集,减少细菌粘附在边界(图的测试项目8),表明细菌应激反应不足表面,而链美国杂志出现部分垂直竖立,底部同样避免表面接触(图10 (b))。结果,非均匀配置中心和边界之间的聚合物样品的旋转涂布一起放大无定形二氧化硅表面克服在某些领域关键量,这需要一个抗菌效果。实际上,这与舵柄等人在一个连续的观测研究与pVP描述杀菌活性的表面密度增加吡啶组(36]。也,所以等人反映,革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的生长依赖于一定的聚合物结构,形成活性基团,降低高聚合物浓度(37]。

最后,不同的生理学的细菌可以负责不同的结果相比,舵柄等。作为聚合物被描述更有效的抗菌活性对革兰氏阴性和革兰氏细菌在其他研究37),所选的革兰氏阳性兼性厌氧微生物,这代表了典型的口腔细菌,可能不太敏感的高分子涂层进行了分析。

因为舵柄等人并不认为pVP tissue-implant连接上涂层的影响,本研究的另一个主要方面是考试牙龈成纤维细胞的粘附和增殖种与裸基板。关于初始粘附后24小时只有纳米多孔二氧化硅透露了一些减少量化分析。相反,其他荧光照片质疑这种粘附的质量的所有样品涂上hexylated pVP,因为更多的圆形而不是成传播细胞。同样,72 h后,粘附细胞的形态和数量最好控制与nonhexylated聚合物涂层和玻璃,而表面hexylated pVP落后,也证明了一个甚至消极的增殖率下降,可能是由于形态学和细胞粘附。总结研究结果表明,潜在的杀菌聚合物聚- (4-vinyl-N-hexylpyridiniumbromide)本身没有对人牙龈成纤维细胞和细胞毒性作用,因此,可以作为一个来源为未来涂层策略关于牙科植入物。然而,聚合物与视图的必要hexylation抗菌性能以及生物相容性的丧失。所以结合与其他聚合物和共聚物涂料的创建玻璃可能是一个合理的方式来改善细胞粘附和增殖为钛衬底的一项研究显示已经豪雅et al。(18]。此外,奥尔特加的共聚物等人所描述的插入可能提供超支化聚合物的形成包含终端铵组抗菌药物,可能会增强逐渐交付杀虫剂(38]。

5。结论

有利的植入物表面的特点是降低了细菌粘附而同时良好的生物相容性。本研究的结果显示没有细胞毒性作用的聚-人类牙龈成纤维细胞(4-vinyl-N-hexylpyridiniumbromide),这可能表明聚合物作为一个潜在的口腔植入表面涂层的应用程序虽然hexylation有批判性讨论的影响。然而,已知抗菌聚合物的发现不能确认在我们的研究,因为没有杀菌活动不同的镀膜玻璃幻灯片关于典型的口腔细菌可以完成。改善表面粗糙度、厚度、烷基化和配置方面聚合物的连续使用口腔细菌应该被认为是在进一步的调查中。

承认

这项工作是支持的一部分证期局599年德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)。

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