生物转化法生产生物乳化剂中的农工废弃物Stenotrophomonas maltophiliaUCP 1601及其在生物修复中的应用

摘要

这项研究调查了这种细菌的潜力Stenotrophomonas maltophiliaUCP 1601通过测定溶血活性，在血琼脂中获得9 mm的光环，制备出具有乳化性质的新生物分子。在添加10%废大豆油和不同浓度葡萄糖、蛋白胨、氯化锌的含盐矿物培养基中进行发酵₂,MgSO₄，根据a 2⁴全因子设计。结果表明，在条件6（4%葡萄糖、1%蛋白胨、2.72%氯化锌）下，效果最好₂和2.46％硫酸镁₄），具有82.74％的优异的高乳化指数，使用烧机油。所产生的生物分子的乳化性是由78.57，54.07乳化指数和58.62％，使用大豆，玉米，和柴油，分别与在pH值，温度的不同值的稳定性，和NaCl浓度证实。The yield of the produced bioemulsifier was 2.8 g/L, presenting an anionic character and polymeric nature (37.6% lipids, 28.2% proteins, and 14.7% carbohydrates), confirmed by FTIR. The new bioemulsifier demonstrated promising potential for bioremediation of hydrophobic contaminants in the environment, since it had the ability to reduce the viscosity of WSO and burned motor oil, as well as excellent dispersion capacity of the burned motor oil in water (69.94 cm²以及从砂土中去除71.7%的石油衍生物。

1.简介

生物乳化剂是具有亲水性和疏水性的分子，在不同极性的流体(油/水和水/油)之间起作用，允许接触疏水性底物，增加此类化合物的接触面积、流动性、生物利用度和生物降解性[1- - - - - -4]. 它们有改变液体物理和化学性质的趋势，导致去污、润滑、起泡和增溶、乳化和降低液体粘度的能力[5,6]。

生物乳化剂是由多种微生物，包括细菌，酵母，和丝状真菌产生。当与合成来源，微生物乳化剂具有几个优点，例如稳定性pH，温度和盐度，生物降解性，和低毒性的宽范围，这使得它们在许多工业应用[有为7]. 生物乳化剂广泛应用于石油开采、碳氢化合物污染环境的生物修复、重金属和氯化溶剂化合物的去除等方面[8,9]。

由于人口增长和最近的消费模式，农业工业和农业系统的生产有所增加。由于生产力的非生产性增长而产生大量废物，导致经济、社会和环境损害[10个]。利用残留物作为培养基配方的替代基质来生产生物乳化剂，可提供支持微生物生长和生物乳化剂生物合成所需的碳水化合物和/或脂类水平，有利于微生物生长和代谢产物的产生[11个- - - - - -13个]。

Stenotrophomonas maltophilia是一种革兰阴性细菌栖息的植物，土壤和水。由于与植物促生长有益的互动，它已成为重要的农业生物技术应用[14个,15个]。此外，也有文献几项研究上的生物技术潜力S、 嗜麦芽菌由于产生酶如脂肪酶和蛋白酶[16个,17岁]。最近，一些研究人员强调了生产生物表面活性剂/生物乳化剂的潜力，这些生物表面活性剂/生物乳化剂具有有效的杀幼虫和/或杀虫功能，可有效降解柴油和用过的机油，或可溶解菲18岁- - - - - -20个]. 在此背景下，本研究旨在通过以下方法生产生物乳化剂：S、 嗜麦芽菌UCP 1601，以废大豆油（WSO）为低成本基质，通过⁴全因子设计（FFD）。对生物乳化剂进行了分离和初步表征，并对其稳定性、对疏水性化合物粘度的影响、作为分散剂的效果以及对燃烧机油的去除进行了研究。

2。材料和方法

2.1。微生物

本研究中使用的微生物是Stenotrophomonas maltophiliaUCP 1601，从伯南布科Capibaribe河的粘土中分离得到，由Vilar Junior鉴定(日期未发表)。细菌保存在伯南布哥天主教大学的培养库中，在世界培养收集联合会(WFCC)注册，在营养琼脂培养基和30%甘油中，5℃保存。

2.2条。材料

WSO并在此研究中所用的商业洗涤剂是从正规商业在城市累西腓，巴西获得。葡萄糖，蛋白胨，氯化锌₂，米高梅₄，和吐温80化学品购自默克公司（达姆施塔特，德国）购买。在这项研究中使用WSO的化学成分报告了安德拉德等人。(21岁]。

2.3。溶血试验

潜在的S、 嗜麦芽菌使用溶血活性试验[UCP1601生产bioemulsifier的进行了研究22个]。将菌体接种于5% (v/v)脱纤维绵羊血琼脂平板中央，37℃孵育24 h。活动是通过周围清晰区域的出现来评估的S、 嗜麦芽菌殖民地。

2.4。生物乳化剂的生产S、 嗜麦芽菌

2.4.1。接种物的制备

一群S、 嗜麦芽菌将在营养琼脂上生长的UCP 1601转移到50 mL营养肉汤中，在37°C和150 rpm的轨道摇床上孵育24小时。然后，用紫外/可见分光光度计Libra S32 (Biochrom Ltd.)在600 nm处检测培养基的光密度。以光密度0.8-1.0、600 nm的培养基作为接种物。

2.4.2条。生物乳化剂的生产

Bioemulsifier production was carried out in Erlenmeyer flasks containing 100 ml of saline mineral medium (MMS) (composition in g/L: 1.0 (NH4)₂所以₄，2.0公里₂HPO₄，0.5千赫₂人事军官₄，10.0硫酸镁₄·7H₂O、 5.0氯化钠，0.2亚铁₄和0.5的CaCl₂) [23个]添加10%的WSO。培养基中加入葡萄糖、蛋白胨、氯化锌₂,MgSO₄，根据a 2⁴FFD（第2.4。3.). 将生产培养基调至pH7，在121℃高压灭菌15 min，然后在10%接种，在30℃眼眶旋转（150 rpm）下孵育96 h。此后，培养基在10000 rpm和10℃下离心15 min。所得无细胞代谢液用于通过测定乳化指数来评估生物乳化剂的生产，如下所述（第2.4。4)。

2.4.3条。全因子设计

在这项研究中，一个2⁴用FFD评价四个变量（葡萄糖、蛋白胨、ZnCl）的影响₂,MgSO₄)。每个自变量在最小(−1)和最大(+1)水平上被研究，如表所示1. 16项实验检测分为3次，以乳化指数作为变量反应。实验数据由Statistica®软件10.0版（StatSoft Inc.，USA）进行分析，并测试结果的显著性( )。

2.4.4。乳化指数的测定（EI_24个)

乳化指数（EI_24个)根据库珀和戈登堡描述的方法测定[24个]简言之，将每种情况下的1.0 ml无细胞代谢液和1.0 ml燃烧的机油混合在试管中，并在室温（25°C）下彻底旋转2 min。将混合物静置24小时，之后，通过以下方程式确定指数： 哪里H_e=乳状液的高度H_t=混合物的总高度。具有较高EI值的FFD条件_24个选用烧机油进行EI测定_24个使用大豆，玉米，和柴油，通过由方法Cooper和Goldenberg的[描述24个]。并对结果进行了比较，得出了具有较好的EI的条件_24个对于所有的疏水性化合物被用于进一步的研究。

2.5。生物乳化剂稳定性的测定

所制备的生物乳化剂的稳定性S、 嗜麦芽菌通过EI确定FFD选定条件下的ucp1601_24个。分别在不同温度(0、5、30、37、50和100℃)下提交无细胞代谢液，调整至不同的pH值(2、4、6、8、10和12)或NaCl(2、4、6、8、10和12%)。然后,EI_24个使用燃烧的机油作为疏水性基质，按照第节中先前描述的方法测定2.4。4(25个,26个]。

2.6。生物乳化剂对疏水化合物粘度的影响

所产生的生物乳化剂的效果S、 嗜麦芽菌用Andrade Silva等人描述的方法研究了UCP 1601对疏水化合物（WSO和燃烧机油）粘度的影响。[27个]和马亚等。(26个]。The viscosity of the hydrophobic compounds was determined in test tubes before and after adding 2 ml of the cell-free metabolic liquid (crude bioemulsifier) of the selected condition of the FFD, and the mixture was vigorously homogenized in vortex for 1 min. The determination was made using an automatic viscometer (Brookfield (Middleboro, MA, USA) TC 500), and the results were expressed in centipoise (cP).

2.7条。油分散试验

为了确定由产生的bioemulsifier的分散剂的潜在S、 嗜麦芽菌UCP 1601，将40 mL蒸馏水放入培养皿（直径10 cm）中，然后在水层表面添加1.0 mL燃烧的机油，进行油分散试验。然后，在油膜中心放置0.5 mL无细胞代谢液（粗生物乳化剂）、商用洗涤剂、吐温80或蒸馏水[27个,28个]. 生物乳化剂的分散能力表现为油的分散性，从而形成驱油面积（ODA）。试验分三次进行；测量透明区直径，测定相应的ODA，并以cm表示²，使用下面的公式[27个]：

2.8条。生物乳化剂分离

生物乳化剂S、 嗜麦芽菌用三种有机溶剂沉淀法（丙酮和乙醇70%）从上清液中提取UCP 1601（1 ： 1，伏/伏)。The mixtures were allowed to stand for 24 h at 5°C, and then the precipitate was obtained by centrifugation at 5000for 15 min at 5°C. The supernatants were discarded, and the precipitate was washed twice with distilled water and dried at 70°C for 3 h. Bioemulsifier yields were expressed as g/L and compared in order to select the more efficient method for bioemulsifier isolation [27个]。

2.9。表征Bioemulsifier

使用Labtest试剂盒（Labtest Diagnostica S.A.，Minas Gerais，巴西）测定生物乳化剂中的蛋白质浓度，以确定总蛋白质含量。用苯酚-硫酸法测定总糖含量[29个]。脂质含量根据Manocha等确定。(30个]。

利用傅里叶变换红外衰减全反射（ATR）技术，在德国卡尔斯鲁厄布鲁克光谱仪上进行了傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析。分离出的生物乳化剂在4000-600 cm范围内进行测量分析⁻¹。

生物乳化剂的离子电荷测定采用Zeta电位计模型ZM3-D-G, Zeta电位计系统3.0+，直接图像用于Zeta电位计视频，旧金山，加利福尼亚，美国[31个]。

2.10。生物乳化剂在清除污染砂中烧机油中的应用

采用Luna等人的方法研究了生物乳化剂去除燃烧机油的适宜性。[32个]。Twenty-gram砂样品被转移到250毫升厄伦美厄烧瓶,人为污染20毫升的烧机油,报以下治疗:(A)的150毫升蒸馏水(控制),(B)添加SDS溶液150毫升的0.5%,和(C)的150毫升的胞外代谢液(原油bioemulsifier)。烧瓶在28℃下，每分钟150转，48h，然后在5000离心洗涤液与泥沙分离20 min。用正己烷重量法测定砂中的剩余油量。

3。结果与讨论

3.1条。溶血活性S、 嗜麦芽菌UCP 1601号

一些研究人员已经研究了溶血活性的微生物生产的表面活性剂[的选择的标准6,22个,33个]. 溶血活性阳性的微生物在血琼脂平板上显示一个清晰的区域，这被证实为S、 嗜麦芽菌跟单信用证1601。在培养基中径向生长的过程中，经过24小时的培养，细菌形成了直径9毫米的光晕。之前，Hemlata等人[23个] reported the formation of a halo of 13 mm byS、 嗜麦芽菌NBS-11。同样，其他研究人员已经证实的积极溶血活性生物表面活性剂生产Stenotrophomonas maltophilia应变[18岁,34个]。

3.2。生物乳化剂的生产S、 嗜麦芽菌UCP 1601号

乳化指数的测定常被用作鉴别乳化剂的合适方法，乳化剂具有良好的乳化稳定性[4,25个,33个]。

表格2介绍了无细胞代谢液体的乳化指数的测定结果S、 嗜麦芽菌UCP 1601培养后在16种条件下进行FFD。乳化指数的实验值和预测值用统计模型分析⁴FFD示于补充材料（表3.)。

乳化液的稳定性可以通过在形成24小时后保持至少50%原始乳化液体积的能力来评估[35岁]。由此产生的生物分子S、 嗜麦芽菌UCP 1601与燃烧的机油呈乳化性，与EI_24个的分别81.97％和82.74％，在条件4和FFD的6。然而，当与其它的疏水性化合物进行试验时，乳化指数低于50％至条件4 bioemulsifier，而所获得的条件6显示EI_24个，分别为78.57、54.07及58.62%(图2)1)。因此，条件6被选择用于以下研究。

3.3条。统计分析

在这项研究中，一个2⁴采用FFD法分析了培养基中葡萄糖、蛋白胨、氯化锌和硫酸镁4种组分对生物乳化剂生产的影响S、 嗜麦芽菌跟单信用证1601。采用响应或因变量为乳化指数，用下式与自变量建立关系: 哪里Y是响应变量（乳化指数）；b₀是一个常数;b₁,b₂,b_3.和b₄为线性的回归系数;和b_{德意志北方银行},b_13个,b_14个,b_23个,b_24个,b_34个,b_123个,b_124个,b_134个和b_234个为交互作用系数^。

为了分析的数学模型，调整通过线性回归方法，以及表制作3.（补充材料）示出通过实验获得的值以及由该模型预测，以获得乳化指数的最高值。数字2补充的材料代表了这些值之间的关系，显示出其线附近分布，这表明，式（4）由数学模型提出解释乳化指数的获得的值。这是通过判定的高系数（证明R² = 0.9993）在表中所示的方差分析（方差分析）中获得4补充材料。实验数据的再现性由调整后的测定系数（调整后）的值确定R² = 0.9898），也表明所描述的数学模型与实验数据相符。

的ANOVA还表明，对于实验数据获得的，只有葡萄糖，蛋白胨，和氯化锌的相互作用₂(1显示2显示3);葡萄糖,ZnCl₂,MgSO₄(1 ∗ 3 ∗ 4); and peptone and ZnCl₂（2 * 3）在95%置信水平下分析时，乳化指数具有统计学意义。只有葡萄糖，ZnCl的相互作用₂,MgSO₄考虑到各自变量(葡萄糖、蛋白胨、ZnCl)的影响，显示出对乳化指数的正作用₂,MgSO₄)如表所示的因变量（乳化指数）4（补充材料）。

3.4条。生物乳化剂的稳定性

在各种工业领域中使用的微生物的乳化剂的不同的温度，pH和盐度条件[下取决于它们的稳定性36个,37个]。

结果表明，在不同的pH值和盐度下，乳化指数基本保持不变（80%以上），只有少量的NaCl下降到2%（图2（甲）- - - - - -2（c）)。然而，在温度的情况下，极端值（0和100℃）的影响乳化（图2（b）），其可能是由bioemulsifier的部分沉淀引起的[38个,39个]。Gargouri等人也报道了类似的结果。[19个当他们评估生物表面活性剂的稳定性时嗜SP。

3.5。生物乳化剂对疏水化合物粘度的影响

在本研究中，对生物乳化剂的作用进行了研究S、 嗜麦芽菌研究了UCP 1601对大豆油和燃烧机油粘度的影响。结果表明，两种被测化合物的粘度都有所下降，豆油从380.1 cP降至21.6 cP，燃烧机油从148.9 cP降至46.9 cP。同样，生物表面活性剂由光滑念珠菌UCP 1556将大豆油的粘度降低到18.5cp[35岁]，作者建议其在化妆品配方中的应用。

最近，Maia等人。[26个]报道通过产生的bioemulsifier烧伤机油的粘度降低枯草芽孢杆菌UCP 0146号。这种降粘特性有助于提高原油采收率、重油或清洁污染场地，因而在石油工业中有潜在应用的乳化剂中是理想的[26个,40个]。

3.6条。生物乳化剂的分散性能S、 嗜麦芽菌

化学分散剂广泛应用于各种工业领域，如油漆和涂料、石油和天然气、建筑、制药、纸张和纤维素、农产品、洗涤剂等[41个]. 然而，由于其配方中某些成分的毒性和不可生物降解性，其持续使用会对环境造成很大影响[42个,43个]. 因此，对环境友好和低成本分散剂的需求越来越大，在这方面，微生物表面活性剂被认为是很有前途的候选者[44个,45岁]。

在本研究中，由S、 嗜麦芽菌采用烧机油分散试验对ucp1601进行了研究。如图所示3.,the bioemulsifier showed excellent dispersion potential with 69.94 cm²官方发展援助，类似于吐温80（73.38 cm²)和higher than that of commercial detergent (24.49 cm²)。

所得结果由生物乳化剂生产而成S、 嗜麦芽菌ucp1601优于该物种的其他菌株[20个,23个]。近日，Gargouri等。(19个]报道了由嗜sp. B-2，对应于28.27 cm的ODA²。此外，通过其他属的细菌产生的乳化剂得到的ODA的较低的值，如由马亚等报道。(26个]用于枯草芽孢杆菌ucp0146(55.38厘米²)。因此，本研究生产的生物乳化剂显示了其作为分散剂在石油泄漏或工业配方中的潜在应用。

3.7。生物乳化剂的分离和产率

对于许多生物技术产品，下游加工成本占总生产成本的70%-80%[5]. 生物乳化剂的几种常规回收方法，如酸沉法、溶剂萃取法、硫酸铵沉淀法、离心法和泡沫分馏法等已被广泛报道[46个,47个]。在本研究中，我们测试了三种回收方法2.8). 乙醇抽提得到较好的生物乳化剂产率（2.8 g/L），丙酮抽提得到较好的生物乳化剂产率（1.7 g/L）。酸沉法回收少量生物乳化剂（0.9g/L）。乙醇提取法被认为是分离生物分子最有效的方法。

3.8条。生物乳化剂的表征

zeta电位决定了粒子的离子电荷，用于预测和控制胶体悬浮液和乳液的稳定性。根据文献，较高的zeta电位值表明，由于亲水颗粒之间的排斥作用，悬浮液具有良好的稳定性[22个,27个]. 根据Zeta电位Meta 3.0+的分析，生物乳化剂由S、 嗜麦芽菌呈负离子性（-33.97   0.23 ZPmv，28.3°C）。

初步的生化鉴定表明，该生物乳化剂具有聚合结构，由脂类(37.6%)、蛋白质(28.2%)和碳水化合物(14.7%)组成。类似地，Araujo等人[48个]进行这些方法，以获得由所产生生物表面活性剂的生化组成粘质沙雷氏菌UCP 1549和揭示了43%的脂质，32%的蛋白质和11%的碳水化合物的存在，表明其聚合性质。生物表面活性剂嗜B-2在结构上具有特征性，在性质上包含环状肽和脂质结构，而纯化的生物表面活性剂S、 嗜麦芽菌NBS-11含有34%的碳水化合物、62%的脂质和4%的蛋白质。

FTIR spectrum displays a broad peak at 3312.13 cm⁻¹说明OH基团（图4). 拉伸1652.30 cm⁻¹，-C[双键，长度为m-dash]O拉伸，形成羧基-C-O拉伸（2925.11）。另外，在1018.70 cm处出现两个拉伸信号⁻¹其中，根据Jadhav等人[49个]。672.37 cm到1之间的区域被认为是碳水化合物的指纹，经常出现与异常碳相关的一些峰[50个]. 结果表明，所制备的生物乳化剂主要是脂肽与少量糖脂的复合物，是一种高分子聚合物。

3.9。生物乳化剂在清除污染砂中烧机油中的应用

生物乳化剂可使烃类乳化，增强其水溶性，增加油类物质从土壤颗粒中的排水量[40个]。在本研究中，粗生物乳化剂的应用取得了良好的效果S、 嗜麦芽菌对砂质土壤样品除去的燃烧发动机油吸附的71.64％，当与SDS（81.47％）相比，和蒸馏水（6.2％）作为对照。因此，有人证明用于油生物补救过程中使用粗bioemulsifier的相当大的潜力，因为替代合成对应物。

四。结论

S、 嗜麦芽菌UCP 1601在生产具有优良分散性能的阴离子和聚合物生物乳化剂、降低疏水化合物的粘度和去除砂中燃烧的机油等方面展示了其潜力。由此可见，它在利用石油衍生的疏水污染物分子对污染生态系统进行生物修复方面的生物技术潜力。

数据可用性

本文介绍了在完成“帕南布科天主教大学环境过程开发”硕士课程的过程中，通过实验获得的有关因子设计和浸没发酵的数据。实验获得的乳化指数和由生物脉冲发生器预测的乳化指数Stenotrophomonas maltophilia包含在补充信息文件中。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了CAPES（硕士课程奖学金）（Coordenaço de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nçvel Superior）、CNPq（Conselho Nacional de Desenvolvimento ciento e Tecnológico）（流程号314422/2018-8）和FACEPE（Fundaço de Amparo a Ciçncia e Tecnologia de Pernambuco）（流程号APQ-0291-2.12/15）的支持。作者感谢巴西帕南布哥天主教大学环境科学和生物技术研究中心（NPCIAMB）使用实验室。

补充材料

图2：根据2中获得的结果，响应变量（乳化指数）的模型预测值与观察值⁴FFD。表3：实验获得，并通过统计模型预测的乳化指数的值用来分析2⁴FFD。表4:方差分析获得的结果从2⁴FFD分析独立变量的影响（葡萄糖，蛋白胨，氯化锌₂,MgSO₄)因变量（乳化指数）。(补充材料)

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