一步超滤过程的分离和净化Keratinolytic蛋白酶生产羽毛粉

文摘

净化技术获得keratinolytic蛋白酶产生的芽孢杆菌sp。在一个中等下岗通知包含鸡羽毛粉为底物。实验进行了超滤单元的死胡同,膜中断的影响,酶提取的pH值和操作压力角蛋白酶的纯化进行了研究。一步超滤过程中膜的分子质量截止10 kDa的pH值8.0和0.147 MPa的操作压力显示一种酶恢复87.8%和4.1倍净化的因素。表明超滤可能会用于角蛋白酶的纯化。

1。介绍

巴西是全球禽肉的主要生产国,产生大量的有机废物如内脏、脚、骨头、羽毛,不用于人类食用和血液。这些有机副产物主要是用来准备动物饲料或土壤肥料虽然焚烧方法处理这样的浪费仍应用在一些地方(1]。鸡的羽毛代表大约10%的废物处置家禽业。羽毛本质上是由角蛋白(大约90% w / w),难降解的蛋白质由于存在强烈的化学键在多肽链二硫桥、氢和疏水相互作用,阻碍他们的快速降解环境中(2- - - - - -4]。

角蛋白的恢复对家禽业构成了巨大的挑战。另一种回收这些角质的材料是生物转化成高附加值的产品特定的微生物生产keratinolytic蛋白酶。这些蛋白酶,名叫角蛋白酶,往往能够降解角质的废物的丝氨酸或metalloproteases [5,6]。碱性角蛋白酶是由一些细菌物种,包括地衣芽孢杆菌(7- - - - - -9),Kocuria rosea(10),链霉菌属sp。11),甚至真菌等黑曲霉(12]。keratinase-producing细菌,芽孢杆菌sp。下岗通知,被隔离的肠亚马逊盆地的鱼Piaractus mesopotamicus(4]。芽孢杆菌sp。下岗通知有效降解羽毛角蛋白在水下查看,产生细胞外keratinolytic酶。

这种类型的酶获得了生物技术对肥料,使用洗涤剂和化妆品行业,也为角质的残留产生的潜在使用生物和沼气1,3,13]。此外,keratinolytic蛋白酶可以应用于获得动物饲料含有丰富的氨基酸。酶法水解保护必需氨基酸如蛋氨酸、赖氨酸,色氨酸和避免形成的无营养的氨基酸如lanthionine和lysinoalanine [14]。也一直在开发新的应用程序,如朊病毒降解预防疯牛病(3),生物可降解塑料的制造、角蛋白肽生产(14,15]。

角蛋白酶的工业应用的可行性驻留最初获得一个可行的来源的酶,如家禽羽毛,及其净化使用一个简单的协议。几个净化技术研究了微生物角蛋白酶,包括硫酸铵沉淀、溶剂沉淀、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、疏水作用色谱法和羟磷灰石色谱法(5,7- - - - - -9,11,16]。然而,这些研究采用净化流程序列的不同的技术以获得高纯度的酶制剂所需酶的特点。在这些协议,膜分离应用只作为一个集中的一步。对于工业应用,高程度的纯度通常不是必需的。因此,有必要研究工业技术适用于净化微生物角蛋白酶,减少这个过程的成本。除了扩大问题,限制蛋白质的生产水平,传统的技术,如色谱法需要复杂的仪器支持高效运行和产量低吞吐量的产品在一个非常高的成本。因此,分离技术,可以同时提供高生产率和纯度较低的处理成本肯定是有益的生物技术产业(17]。

超滤被广泛用于蛋白质浓度和分离,因为较低的复杂性相比前面提到的净化技术(18]。超滤过程的主要优势在传统bioseparation过程是高产品的吞吐量。然而,尽管广泛使用的超滤过程如diafiltration和浓度,用于蛋白质分离的潜力还没有被利用的生物技术产业(17]。然而,有研究表明超滤可用于纯化的酶,同时获得高产量和产品纯度(19- - - - - -21]。

这项研究提供了一个潜在的一步获得微生物角蛋白酶的纯化过程。此外,这一过程增值最成问题的家禽产业的副产品。在目前的研究中,使用一个工业应用技术获得的角蛋白酶的纯化芽孢杆菌sp。下岗通知使用羽毛进行了研究。这种酶被超滤浓缩和纯化。这种方法允许获得纯化角蛋白酶在一个单一的步骤。

2。材料和方法

2.1。微生物和培养液准备

芽孢杆菌sp。下岗通知(加入基因库AY962474)在脑心浸液保持在4°C (BHI)琼脂板上。剂制备,芽孢杆菌sp。下岗通知接种在BHI盘子和孵化24小时30°C。文化从琼脂表面轻轻地刮,添加到无菌生理盐水溶液(8.5 g / L),和混合直到均匀悬浮的光密度0.5在600海里了22]。

2.2。水下种植

酶是由水下栽培所描述的Daroit et al。22)使用培养基组成(g / L)羽毛粉(50)和北半球₄Cl(5.25)准备在矿物介质(氯化钠(0.5),K₂HPO₄(0.3),和KH₂阿宝₄(0.4))。厄伦美厄烧瓶(250毫升)含50毫升的媒介,初始pH值调整到7.0之前由高压灭菌法灭菌15分钟的121°C。文化发起了1% (v / v)培养液。生长条件是30°C和125 rpm 48 h。培养结束后,上层清液被离心分离(5.000 g×20分钟),获得粗酶提取物。

2.3。超滤(UF)

实验在一个没有发展前途的工作容积的超滤单元160毫升由磁搅拌杆暂停下来5毫米的膜。该模块是配备了再生纤维素膜(微孔)总过滤面积19.63厘米²。新的膜被用于每个实验,使用了两种不同尺寸的分子量截止10 kDa, 30 kDa。与压缩氮气系统加压,温度保持在15°C,以避免酶变性。超滤与粗酶提取过程前,水通过膜的通量。卷40毫升的粗酶提取物添加,这个过程停止时体积浓度因素达到4的值(21]。酶活性和蛋白质含量的饲料(输入粗提物)、滞留物,渗透在每个实验化验。

2.4。角蛋白酶的浓度和净化超滤

操作压力的影响,酶提取液的pH值、分子量截止(MWCO)在超滤过程中研究了2³实验设计,共计八个实验进行重复试验。反应评估是酶恢复和净化的因素。执行的统计分析实验设计使用方差分析(方差分析)和95%的置信水平。Statistica 5.0软件(美国StatSoft Inc .)是用于数据的回归和图形分析获得的实验设计。表1介绍了矩阵的实验设计。

效率的角蛋白酶的酶的浓度和净化的过程中通过酶超滤是评估恢复和净化的因素。这种酶恢复()获得的滞留物总活动之间的比例和总活动提要。净化因子(PF)计算除以滞留物的酶的具体活动(U /毫克)的具体活动中使用的酶提取提要(U /毫克)。

2.5。酶测定

角蛋白酶活动监控使用可溶性基质azocasein(美国圣路易斯σ)作为描述Daroit et al。4]。蛋白酶活动的一个单位(U)被定义为0.1的酶量增加引起的吸光度单位定义试验条件。

2.6。血清总蛋白测定

蛋白质是由洛瑞的方法等。23),使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。

3所示。结果与讨论

3.1。通量研究pH值的变化,操作压力和MWCO在超滤过程中

在试验期间,通量行为角蛋白酶的浓度和净化的过程是评估(数字1和2)。超滤在pH值为7.0(图1),可以观察到试验2的通量变化为76.4至25 L / m²·h减少67.5%,操作时间为0.6 h。试验5和6显示流量减少64.4%和65.1,分别。试验1 (10 kDa和0.147 MPa)显示最小的通量变化从38.2到19.5 L / m²·h减少48.9%,操作时间为0.73 h。

在图2,pH值8.0表明,膜的通量资料截止和操作压力影响渗透通量比pH值8.0的pH值变化在实验3中,4、7和8对渗透通量无显著影响,而相同条件下在pH值为7.0。试验3 (10 kDa, 0.147 MPa, pH值8.0)最低流量值的百分比减少46.1% (39 21 L / m²·h),几乎与试验1(48.9%),与同一MWCO执行和操作压力,但与pH值7.0。

当截止膜的渗透通量的影响进行了分析,观察到,与30 kDa膜通量的减少大于10 kDa的膜在低压力(0.147 MPa)。这可能归因于这样一个事实:提取包含肽,氨基酸,和其他蛋白水解酶分子质量低于30 kDa,促进他们最初的运输通过膜,从而获得更高的初始通量的过程。然而,由于浓差极化和污染现象,流量下降值低至同10 kDa。

造成的通量减少污染和浓差极化一直被认为是蛋白质超滤的主要问题。可以看到,在这个过程的开始,有一个快速下降的变化。这个初始阶段后,有一个逐渐下降的通量发生由于水垢的形成的蛋白质在膜表面形成浓差极化的影响和污染现象。聘请的蛋白质膜可以在膜表面形成凝胶层,它充当一个动态膜,增加蛋白质的保留。其他作者使用的超滤过程的浓度和分离蛋白(17,21,24观察到的相同的行为。浓度和净化过程中蛋白酶预处理的金枪鱼脾提取,得到的通量下降59% (25),这是接近值获得的这项工作。

(0.245 MPa),然而,在更高的压力之间的差异在通量减少10 kDa, 30 kDa膜不太明显。事实上,更高的操作压力提供了更高的初始流速。更高的压力可能会降低浓差极化的影响;因此,与10 kDa膜过程实现初始通量接近30 kDa膜的实验。

3.2。角蛋白酶的浓度和净化超滤

表2显示的值在角蛋白酶纯化参数评估,预测与实验值的相对标准偏差在试验获得。酶的恢复角蛋白酶在41.3 - 87.8%的范围和净化因子在1.9 - 4.1倍之间。可以验证增加膜的截从10到30 kDa减少酶的恢复,从而净化的因素。实验3,膜截止10 kDa, pH值8.0,和0.147 MPa的压力,提供最高的酶恢复(87.8%)和净化因子(4.1倍)。膜截止,操作压力,这两个变量之间的相互作用有重要影响的两个反应,酶恢复和净化因子;pH值,另一方面,对净化因子有显著的影响。方差分析进行了使用费舍尔的统计检验(表3)验证的实证模型获得的PF和恢复酶。相关系数(R)取得了0.99和0.84的分别和PF。此外,F_计算值是3倍F_列表PF和90倍的值 ,表明模型拟合数据令人满意和被认为是预测的反应。方程(1)和(2)代表经验模型将恢复(分别)和净化因子(FP)。 在哪里是酶的恢复,是净化因子,是分子量截止,是工作压力。

数据3和4等高线图显示了从实证模型来获得更好的理解变量的交互pH值、压力,和MWCO获得角蛋白酶浓度和纯化的最佳条件。

分析pH值和压力之间的相互作用酶恢复,可以验证,当一个10 kDa膜采用高pH值(在7.5和8.0之间)和0.196到0.147 MPa的压力,这种酶恢复增加(80%),如图3。当30 kDa膜,压力恢复值的影响更明显。这可能是由于污垢的形成,有利于酶的保留。

对净化因子,酶提取液的pH值没有显著影响这种反应,不生成轮廓曲线。pH值的影响更多的相关酶activity-keratinases通常有一个伟大的稳定性在中性和碱性pH值(2,14]。只有MWCO和操作压力对净化因子(图产生影响4)。这是观察到高净化因子值是使用低MWCO获得值0.147和0.196 MPa之间随着操作压力。

评估MWCO的影响,负面影响被观察到的反应(恢复和净化因子)。换句话说,当最小的MWCO (10 kDa),恢复和净化的最高价值因素。30 kDa的MWCO减少酶恢复了27.2%。这可以归因于在研究酶的分子质量。根据Daroit et al。26),角蛋白酶的分子质量芽孢杆菌sp。大约是26 kDa下岗通知,因此,高MWCO有利于酶的通道渗透,减少酶的复苏。

尽管酶分子质量的26 kDa, 30 kDa膜测试,因为它是预期,浓差极化和污染现象可能有利于酶的保留由于凝胶层的形成没有膜通量的主要损失,因为它是一个与一个更大的孔径。实际上,观察到更高的流量,但是保留的角蛋白酶相比更有效率10 kDa膜。因此,酶渗透膜30 kDa导致较小的恢复和净化的因素。

与压力,可以验证,降低压力和MWCO提供值较高的净化的因素。此外,膜分子质量较低的截止值高的pH值和低操作压力提供更高的恢复值。流量行为分析,在更高的压力(0.245 MPa),通量的减少更加明显在最佳状态(10 kDa膜和pH值8)相比,压力较低(0.147 MPa)。

超滤应用角蛋白酶的纯化目的只集中下一个纯化步骤的酶(7,8,27- - - - - -29日]。然而,观察到的值引用的作品中发现低于在这项研究中发现,使用一个步骤。罗陀与Gunasekaran [27由重组)产生了角蛋白酶芽孢杆菌megaterium。在净化过程中,超滤步骤(10 kDa MWCO)实现了净化因子恢复73.5%的2.3倍。林等。7纯化和特征的角蛋白酶孤立feather-degrading培养基接种与地衣芽孢杆菌PWD-1。超滤步骤(10 kDa MWCO)实现了净化因子和恢复69.3%的1.8倍。研究Allpress et al。28),产生的细胞外角蛋白酶Lysobacter9497年NCIMB净化作进一步鉴定。在超滤步骤(MWCO 10 kDa),净化因子的2倍。

程等。8)和Suntornsuk et al。29日)也使用10 kDa的膜MWCO角蛋白酶浓度。程等。8)产生的角蛋白酶的特征地衣芽孢杆菌PWD-l生产羽毛粉。前净化过程中,酶是集中使用螺旋筒集中器与MWCO 10 kDa的膜。Suntornsuk et al。29日隔离和确定角蛋白酶的性质由一个耐热的feather-degrading从泰国土地菌株。纯化,酶首先集中了10 kDa MWCO膜。

在这项研究中,一个超滤过程开发了角蛋白酶的纯化芽孢杆菌sp。下岗通知在一个单一的步骤。系统操作压力为0.147 MPa,膜MWCO 10 kDa, pH值8.0提供了4倍净化因子复苏没有重大损失。因此,可以减少通过优化超滤纯化步骤这种酶的纯化方法。易于操作和高效的超滤过程中另一个有趣的角蛋白酶的纯化,可用于耐材料的降解废水,甚至应用在洗涤剂等行业清洁产品。此外,蛋白质的酶的潜在重要性生产玉米胚芽蛋白酶解物(3]。

4所示。结论

超滤系统形成的膜的分子量截止10 kDa,操作压力的0.147 MPa, pH值为8.0提供了一个恢复87.8%和4.1倍角蛋白酶的酶的纯化因素芽孢杆菌sp,下岗通知。超滤过程的定位是一个潜在的替代品用于工业的角蛋白酶浓度和净化芽孢杆菌sp。只在一个步骤中下岗通知。此外,这一过程增值最成问题的家禽产业的副产品,鸡的羽毛。

数据可用性

没有对本文补充数据或材料。然而,数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)和慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)通过研究奖学金。

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