细胞通透性的测定和-半乳糖苷酶的提取米曲霉CCT 0977在奶酪乳清中生长

摘要

米曲霉生长在奶酪乳清中具有产生-半乳糖苷酶的能力。本工作的目的是确定测定细胞渗透性和提取酶的参数米曲霉CCT 0977生物质，酶活性高。采用Box-Behnken设计确定细胞通透性和β -半乳糖苷酶提取条件。以脱脂干酪乳清为底物，在28℃下发酵5 d。为了确定各因素对β -半乳糖苷酶活性的影响，通过乳糖水解反应测定酶活性。最有效的细胞渗透条件是25%乙醇，30℃，90 min，酶活为0.44 U·mL⁻¹．以氯仿5.3%、48℃、酶活0.17 U·mL提取-半乳糖苷酶效果最佳⁻¹．利用乙醇是最有效的促进细胞通透性米曲霉有条件现金转移支付0977。

1.介绍

生物技术过程广泛用于获得高附加值产品[1]．利用农用工业废物通过微生物进行生物转化一直是广泛研究的主题，特别是在有关蛋白质、酶、有机酸和次级代谢物等感兴趣的代谢物的生产方面[2]．奶酪乳清作为一种低成本的奶酪残渣，营养丰富，被广泛用作发酵介质[3.，4]．半乳糖苷酶可以通过多种微生物的发酵过程获得米曲霉，一种耐热真菌，栽培时对环境没有很多要求[5，6]．

是一个在其他酶β-半乳糖酶在工业中潜在的用于水解乳糖牛奶和奶酪乳清,生成乳糖含量较低的食物,导致一个更好的溶解性和可消化性的牛奶和乳制品,使它们适合消费者不能容忍这种糖(7]．

当代谢物在细胞内时，细胞壁的破裂是下游过程的第一步。这样就可以把物质分离出来，以便以后提纯。可以使用各种方法，但过程将取决于代谢物的位置和稳定性。细胞分裂的机械方法有高压均质器、超声波和玻璃珠。化学破坏方法使用碱、洗涤剂和有机溶剂。然而，酶法包括酶解或抑制细胞壁合成[1，8，9]．

使用有机溶剂进行细胞渗透和酶提取是最常见的方法，应用在细胞发酵过程后。渗透法是一种简单快速的方法，可以测量酶的活性[10]．为了提取酶，必须促进细胞壁的化学分解。这是一种简单有效的方法，不留下细胞碎片，不需要机械方法的高投资，但由于化学反应，需要更多的时间。这些溶剂改变细胞壁结构，使其孔中的组织紊乱，允许小分子通过，如基质或其他存在于发酵介质中的分子[11]．

因此，这项工作的目的是培养丝状真菌米曲霉在干酪乳清中提取CCT 0977，并确定了细胞渗透和提取酶-半乳糖苷酶的条件。

2.材料和方法

2．1．微生物、接种物和培养基

的米曲霉CCT 0977菌株从Andre Tosello基金会热带培养标本中获得。培养物保存在含有PDA(马铃薯葡萄糖琼脂，Acumedia®)的试管中，并在4°C保存。接种物用0.85%含1%吐温80的生理盐水，用纽鲍尔菌室计数1 × 10进行孢子计数⁶细胞·毫升⁻¹．与培养基相关的接种量为1% v/v。奶酪乳清粉是从当地的乳品合作社获得的。干酪乳清粉以5% w/v的浓度溶于蒸馏水中。对干酪乳清进行脱蛋白，加入85%乳酸至pH值4.6(乳酪蛋白等电点)，90℃加热30 min。沉淀后，用Whatman no。1张滤纸，将培养基调至pH 5.0。在65°C下对奶酪乳清进行巴氏杀菌30分钟。以脱脂巴氏灭菌的干酪乳清为培养基进行发酵实验。

2．2．发酵条件

培养时，加入1% v/v的接种物，在轨道摇床(Tecnal®，TE-420)上进行发酵，28℃，120 rpm，发酵5天。发酵5天后的生物质用匀浆机(IKA®，T10 Basic)研磨，收集悬液5 mL，转移到猎鹰管中，1100 rpm离心(Quimis®，Q222G) 10 min，分离生物质和上清液。生物量用于两种方法:细胞渗透和提取-半乳糖苷酶。

2．3.细胞透化作用

经过发酵的米曲霉CCT 0977，采用离心(1100 rpm, 10分钟)收集细胞，用蒸馏水洗涤1次。根据实验设计，在静态模式下进行细胞渗透，在含5 mL乙醇反应悬浮液的Falcon管(15 mL)水浴中，30°C孵育90分钟(见表)1)，约50 mg湿生物质，0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 6.8)。根据统计设计在温度和时间下培养烧瓶(表1)．以1100 rpm离心10 min收集生物量，用于进一步分析，并用相同的缓冲液清洗细胞一次。将生物质悬浮在1 mL的磷酸盐缓冲液中，通过酶解乳糖确定酶活性。

２.４.酶提取

经过发酵的米曲霉CCT 0977，采用离心(1100 rpm, 10分钟)收集细胞，用蒸馏水洗涤1次。提取-半乳糖苷酶时，将生物量转移到Erlenmeyer烧瓶(50 mL)中，再悬浮在0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 6.8)中，并按实验设计的浓度添加氯仿(见表)2)，最终体积为10ml。加入试剂后，在120 rpm的轨道摇床(Tecnal, TE-420)上孵育试管，温度见表2一夜之间,。上清液和生物量在1100 rpm离心10 min。在上清液中测定酶的活性。

2．5．-半乳糖苷酶活性的测定

酶活性通过酶比色法葡萄糖氧化酶试剂盒(bioliquet®)产生的葡萄糖量来确定乳糖水解反应的初始速率。工作中使用的活性单位为每分钟产生的葡萄糖单位，每毫升酶悬液(U·mL)⁻¹),定义为μ在47°C条件下，初始浓度为10 g·L的乳糖溶液，每分钟产生的葡萄糖的摩尔，每mL酶悬浮液⁻¹，在0.1 M柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中制备。水解时，使用浓度为30% v/v的酶悬浮液，并在水浴中培养过夜。孵育后，酶在90℃灭活5min后冰浴。分析进行了三个重复。

3.结果与讨论

3．1.细胞透化作用

考虑到渗透细胞是生物催化剂，也就是说，它们作为酶的来源，自然保持固定。采用Box-Behnken设计(BBD)评价各显著变量之间的影响，并确定其最优值。BBD的开发是为了减少试验运行的次数和提高效率。BBD已经被应用并被认为是一个非常有效的统计实验设计工具，包括化学工程优化[12]．

渗透性细胞酶活性的测定米曲霉进行CCT 0977，找出自变量(乙醇，X₁；温度,X₂；时间,X_3.)，从而产生最大的-半乳糖苷酶活性。基于Box-Behnken设计，测定每组条件下β -半乳糖苷酶活性的实验水平，并与建议的相应预测水平进行比较(表1)1)．β -半乳糖苷酶活性的最大值为0.44 U·mL⁻¹预测响应值为0.39 U·mL⁻¹．有些作者报道了在发酵过程中添加培养基。Panesar等[13用了一些盐、乳糖、蛋白胨和酵母提取物，获得了最大的活性米曲霉NCIM 1212 -半乳糖苷酶0.50 U·mL⁻¹，在45至50°C之间，这个值与本研究中得到的值相似。Senm等人[14，在pH为4.5的深层发酵条件下曲霉属真菌alliaceus，得到酶活为0.0486 U/mL。

决定系数R²为0.81266，说明该模型充分反映了所考虑变量之间的真实关系。一个R²值0.81266表示模型解释的变异率为81.26%，这对生物系统来说是可以接受的，只有18.74%的变异率是偶然性的。该模型的有效性约为81.26%，表明该模型对酶的活性有较好的预测。实验数据与预测数据的密切相关说明了实验设计的正确性。β -半乳糖苷酶最大活性为0.44 U·mL⁻¹在乙醇(25%)、温度(30°C)、时间(60 min)的条件下得到1)．在表2，对Box-Behnken实验设计的回归参数进行方差分析(ANOVA)。

根据高-半乳糖苷酶活性的结果从渗透细胞答:oryzaeCCT 0977，乙醇、温度和时间的所有线性(L)和二次(Q)效应均不显著()，表明较小范围内的变量，分别为15%、20℃和30 min，对酶活性是足够的。

为了确定从渗透细胞中影响-半乳糖苷酶活性的变量范围答:oryzaeCCT 0977，响应面图为该分析生成。评估变量乙醇、温度和时间对-半乳糖苷酶活性的响应曲面如图所示1．数字1 (c)显示了温度和乙醇对β -半乳糖苷酶活性的影响。温度和乙醇从低到高的过程值显示出较高的酶活性。温度为26 ~ 33℃，乙醇浓度为20 ~ 30%时，β -半乳糖苷酶活性较高。数字1 (b)描述响应曲面图作为时间与乙醇的函数。乙醇浓度的变化对表面曲率没有显著影响。从图形表示来看，-半乳糖苷酶活性在60 - 90分钟的时间范围内是有依赖性的。数字1 (c)在温度20-40℃、时间60 - 90 min范围内，β -半乳糖苷酶的活性效率较高，而在该范围以下和以上，活性均显著降低。根据库马里等人[15，随着渗透时间的增加，较低的温度会增强酶的活性，因为温度的升高会导致-半乳糖苷酶的部分失活。这证实了这些变量的范围被正确地选择了，并且对于这个过程来说是足够的。β -半乳糖苷酶的最大活性为0.44 U·mL⁻¹在以下条件下定义:乙醇25%，30°C, 60分钟。

根据获得的结果,温度和时间是基本因素的过程中细胞透化作用,可以用这一事实来解释真菌的细胞壁比别人更严格,要求较低浓度的乙醇与更多的反应时间和细胞无序的温度较高。

3．2．酶提取

提取-半乳糖苷酶的酶活性测定米曲霉进行CCT 0977，以找到自变量的最佳值(氯仿(X₁)及温度(X₂)，这将提供最大的-半乳糖苷酶活性。基于Box-Behnken设计，测定每组条件下β -半乳糖苷酶活性的实验水平，并与建议的相应预测水平进行比较(表1)2)．β -半乳糖苷酶活性的最大值为0.17 U·mL⁻¹预测响应值为0.15 U·mL⁻¹．决定系数R²为0.87248，说明该模型充分反映了所考虑变量之间的真实关系。一个R²值为0.87248，表明87.24%的变异是由模型解释的，这在生物系统中是可以接受的，只有12.76%的变异是由偶然性造成的。该模型的有效性约为87.24%，说明该模型对酶的活性预测较好。实验数据与预测数据的密切相关说明了实验设计的正确性。β -半乳糖苷酶最大活性为0.17 U·mL⁻¹氯仿(5.0%)和温度(45°C)3.)．在表4，对Box-Behnken实验设计的回归参数进行方差分析(ANOVA)。

米曲霉CCT 0977提取的β -半乳糖苷酶活性较高，温度(L + Q)影响显著()，说明温度越高，酶活性越高。氯仿的线性(L)、二次(Q)效应和温度的二次效应均不显著()，表明变量保持在最低水平，分别为4%和40°C，足以维持酶活性。

以确定影响提取的-半乳糖苷酶活性的变量范围米曲霉CCT 0977，响应面图为该分析生成。评估氯仿和温度变量对-半乳糖苷酶活性的响应面绘制在图中2这表明温度和氯仿对-半乳糖苷酶活性的影响。氯仿从低到高的加工值显示出较高的酶活性。-半乳糖苷酶活性在氯仿5.0-6.0%范围内较高。从图形表示中可以看出，在45 - 50°C的温度范围内，-半乳糖苷酶的活性具有依赖性，而在这些温度范围内，活性显著下降。β -半乳糖苷酶的最大活性为0.17 U·mL⁻¹在以下条件下定义:氯仿5.0%和47℃。

一些作者研究了溶剂对酶提取的影响[8，16，17]．Nagy等人[18的细胞内-半乳糖苷酶的活性青霉菌chrysogenumNCAIM 00237的活性约为0.16 U·mL⁻¹．Mirdamadi等人[19]通过实验测定了不同组成的液体培养基在生产-半乳糖苷酶中的功效曲霉属真菌orzyae在干酪乳清培养基中，获得的最大酶活约为0.13 U·mL⁻¹．因此，在我们的研究中，我们观察到，在提取过程中，酶活性有明显的降低。渗透活性为0.44 U·mL⁻¹；在提取过程中，该值降至0.17 U·mL⁻¹， -半乳糖苷酶活性降低61.36%。很可能，通过溶剂从细胞内部提取酶的过程会对酶造成损害，从而降低酶的活性。

4.结论

米曲霉在脱脂干酪乳清中成功地培养了cct0977，用于生产β -半乳糖苷酶。采用两种化学溶剂:乙醇渗透和氯仿提取酶。与氯仿萃取法相比，乙醇作为渗透剂获得了更高的酶活性。-半乳糖苷酶的最佳透皮条件为:乙醇浓度为25%，温度为30℃，透皮时间为60分钟。在此条件下，β -半乳糖苷酶活性的最大值为0.44 U·mL⁻¹．提取工艺条件为氯仿5.3%，48℃，酶活0.17 U·mL⁻¹．

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者谨感谢巴西高等尼维尔省协调中心(Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel superiore - capes)提供的财政支持，以及KROTON/UNOPAR为学校和硕士课程提供的资助。

参考文献

1. B. V. Kilikian和A. P. Junior，“Purificação de productos biotecnológicos，Biotecnologia工业、W. Schmidell、U. A. Lima、E. Aquarone和W. Borzani、Eds。，卷。2，pp. 493–507, Edgard Blücher Ltd., São Paulo, Brazil, 2001.视图:谷歌学术搜索
2. S. P. Saha和S. Ghosh， "木聚糖酶生产的优化青霉菌citrinumXym2及其在农渣糖化中的应用，"生物技术与应用生物化学，第3卷，第2期。4, pp. 188-196, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. G. Dragone, S. I. Mussatto, J. B. A. Silva, and J. A. Teixeira，“最大化乙醇产量的最佳发酵条件克鲁维酵母菌属fragilis从奶酪乳清粉，"生物质和生物能源第35期第5页，1977-1982,2011。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. S. R. Macwan, B. K. Dabhi, S. C. Parmar，和K. D. Aparnathi，《乳清及其利用》，国际微生物学与应用科学杂志，第5卷，第5期。8, pp. 134-155, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. K.福利，G.法齐奥，A. B.詹森和w.h.o.休斯，《曲霉属真菌蜂巢中的机会性寄生虫及其对蜜蜂的致病性兽医微生物学第169卷第1期3-4, pp. 203-210, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. P. Krijgsheld, R. Bleichrodt, G. J. Van Veluw et al.，“发展在曲霉属真菌”,在真菌学的研究， vol. 74, pp. 1-29, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 问:侯赛因。”β半乳糖苷酶及其潜在应用:综述生物技术评论，第30卷，第2期1，第41-62页，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. M. strred 'Anský， M. Tomaska, E. Sturdík，和L. Kremnický，“优化β牛乳糖的提取克鲁维酵母菌属marxianus”,酶与微生物技术，第15卷，第5期。12，第1063-1065页，1993。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. F. O. Medeiros, F. G. Alves, C. R. Lisboa等人，“Ondas ultrassônicas e pérolas de vidro: um novo método de extração deβ-半乳糖苷酶para o uso em laboratório "Quimica新星第31卷第1期2，页336-339,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. P. S. Panesar, R. Panesar, R. S. Singh，和M. B. Bera，“有机溶剂对酵母细胞的渗透作用β牛乳糖活动。”微生物学研究杂志，第2卷，第2期1，页34-41,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. G. A. Somkuti和D. H. Steinberg， "渗透的乳酸链球菌以及-半乳糖苷酶的表达，”酶与微生物技术，第16卷，第5期。7，第573-576页，1994。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. L. Gámiz-Gracia, L. Cuadros-Rodríguez, E. J. Almansa-López, J. M. Soto-Chinchilla, a . García-Campaña，“在影响fia -化学发光检测系统的操作和化学关键变量的正式优化中使用高效的Draper-Lin小复合材料设计，”Talanta，第60卷，第2期2-3，页523-534,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. P. S. Panesar, R. Kaur，和R. S. Singh，“真菌菌株的分离和筛选β牛乳糖生产。”国际生物，生物分子，农业，食品和生物技术工程杂志，第10卷，第5期。7、pp. 390-394, 2016。视图:谷歌学术搜索
14. S. Sen, L. Ray，和P. Chattopadhyay，“热稳定性物质的生产、纯化、固定和表征β牛乳糖从曲霉属真菌alliaceus”,应用生物化学及生物技术号，第167卷。第7页，1938-1953,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. S. Kumari, P. S. Panesar和M. B. Bera，“一种新型酵母分离物的渗透的统计模型β-半乳糖苷酶活性，"国际生物，生物分子，农业，食品和生物技术工程杂志，第8卷，第2期6, pp. 567-572, 2014。视图:谷歌学术搜索
16. S. Bansal, H. S. Oberoi, G. S. Dhillon, R. T. Patil， " Production ofβ牛乳糖,克鲁维酵母菌属marxianus采用四种不同的酶提取方法对MTCC 1388乳清的影响β牛乳糖活动。”印度微生物学杂志，第48卷，第48期3，页337-341,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. P. S. Panesar, R. Panesar, R. S. Singh, J. F. Kennedy，和H. Kumar，“微生物的生产，固定化和应用β牛乳糖。”化学技术与生物技术杂志第81卷第1期4，页530-543,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. Z. Nagy, T. Kiss, A. Szentirmai和S. Biró，”β牛乳糖的青霉菌chrysogenum:酶的生产、纯化和特性，”蛋白表达与纯化第21卷第2期1，页24-29,2001。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. S. Mirdamadi, N. Moazami，和M. N. Gorgani， " -半乳糖苷酶在水下培养基的生产米曲霉5163年PTCC”伊朗伊斯兰共和国科学杂志，第8卷，第2期1，第23-27页，1997。视图:谷歌学术搜索

版权

版权所有©2018 Caroline dos Santos Viana等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。