文摘

hemicellulosic糖生物转化为第二代(2 g)乙醇在整个生物炼制的成功有着至关重要的作用。在这项研究中,小说xylose-fermenting酵母的乙醇生产性能,Scheffersomyces shehataeUFMG-HM 52.2,是评估在分批发酵条件下使用甘蔗蔗渣水解(某人)hemicellulosic作为碳源。稀酸水解的某人获得执行甘蔗蔗渣水解hemicellulosic (SBHH)。集中,解毒,补充养分在不同酵母的发酵培养基配方准备评估性能。美国shehataeUFMG-HM 52.2(从巴西大西洋雨林生态系统分离)是用于发酵在厄伦美厄烧瓶进行维护在一个旋转瓶30°C和72 h 200 rpm。使用发酵培养基组成SBHH补充了5 g / L硫酸铵,3 g / L酵母提取物,和3 g / L麦精导致0.38 g / g的乙醇产量和0.19 g L。h(体积生产率48 h后的孵化时间。

1。介绍

生物燃料在世界舞台上获得重要地位,由于其可持续性和快枯竭的化石燃料。巴西第二大乙醇生产商在2012/2013(236亿升)世界上直接从果汁或糖蜜酒精发酵获得的糖生产设备(1,2]。在蔗汁的提取干细胞,甘蔗蔗渣(某人)在大量生成。根据巴西国家供应公司(CONAB) [1),2013/2014的甘蔗生产的记者丰收年大约是652数百万吨。这些值是记者约174数百万吨的某人,考虑由Procknor表示比例(3]。使用约75 - 90%的某人在甘蔗加工业的热量和发电。剩余的某人可以作为一个优秀的原材料第二代(2 g)乙醇生产由于存在大量的碳水化合物,如葡萄糖和木糖(4]。

在第一代乙醇生产技术,酿酒酵母是应用最广泛的微生物的发酵蔗糖汁或糖蜜转化为乙醇。这种酵母也可以用于葡萄糖溶液2 g乙醇纤维素预处理获得的分数的某人4,5]。

从某人的经济乙醇生产,同样重要的是要考虑hemicellulosic分数以及纤维素细胞壁的一部分。半纤维素占大约三分之一的碳水化合物比例在某人(可用4]。这种大分子分数富含戊糖残基,主要是木糖,本机不发酵的酿酒酵母。然而,也有一些微生物能发酵木糖乙醇或其他产品6]。使用木糖代谢微生物全球产量将增加甘蔗乙醇的生物炼制。

为半纤维素稀酸水解过程是一种有效的解聚成各种优先戊糖糖主要如阿拉伯糖和木糖。剩余的固体部分被称为cellulignin可水解成葡萄糖从纤维素部分纤维素酶酶(5]。半纤维素的解聚稀酸水解的收益率主要是木糖和其他糖单体,尽管一些其他副产品考虑微生物代谢抑制剂,如呋喃、5-hydroxymethylfurfurals,酚醛树脂,弱酸7]。因此,有必要降低这些抑制剂的浓度水解前使用hemicellulosic通过微生物发酵成乙醇。氧化钙介导中和水解后的活性炭处理有效地消除了抑制剂(8]。

hemicellulosic乙醇的生产,Scheffersomyces shehatae(Syn。假丝酵母shehatae)已经被认为是一种很有前途的微生物提供高乙醇生产力(9]。然而,平衡的最佳生长所需的营养补充美国shehatae用于生产乙醇所需的产量和生产力。在这个工作中,由甘蔗蔗渣水解hemicellulosic乙醇生产评估,使用酵母美国shehatae在不同的发酵培养基UFMG-HM 52.2。

2。材料和方法

2.1。半纤维素水解物的原料和制备

甘蔗蔗渣分析提供的是好心的圣弗朗西斯科位于Sertaozinho SP,巴西。的hemicellulosic水解制备水解反应器中使用H(200升)₂所以₄98%作为催化剂的比100毫克H₂所以₄干物质/ g在121°C(20分钟10- - - - - -12]。水解是通过过滤分离固体材料。的水解物集中真空蒸发器(三倍浓缩)减压在70°C下32 L容量集中器。集中后水解当时解毒方法建立了阿尔维斯et al。8由一个overliming和活性炭组合。

2.2。剂制备

酵母Scheffersomyces shehataeUFMG-HM 52.2,从大西洋雨林在巴西和分离培养的微生物和细胞提供的请联邦大学的米纳斯吉拉斯(UFMG),用于发酵化验。剂制备的铂环量的股票文化被转移到厄伦美厄烧瓶内的125毫升含有50毫升的合成培养基组成的30.0 g / L木糖,10.0 g / L酵母提取物,和蛋白胨的20.0 g / L。细胞生长在一个孵化器在200 rpm为24小时和30°C。24小时增长后,发酵肉汤离心机在2000 g×20分钟。然后,这些细胞被清洗和resuspended无菌蒸馏水。剂是标准化的浓度为0.5 g / L,根据标准曲线绘制细胞浓度(g / L)与光密度(O。D 600海里)。

2.3。发酵

发酵用的化验美国shehataeUFMG-HM 52.2,水解介质组成的补充与不同成分的培养。发酵培养基的选择是基于文献数据考虑简单的标准中,更少的组件的数量,成本,和乙醇生产效率,从作品使用不同的菌株美国shehatae。因此,不同的媒体基于所使用的发酵培养基配方选择帕尔克等。13),通用电气等。14),和太阳和道15]。媒体的组成如表所示1。

水瓶被维护在一个旋转瓶(4000年英诺华孵化器瓶,新布伦瑞克科学、恩菲尔德,CT,美国)在30°C和72 h 200 rpm。样本定期收集确定剩余糖和乙醇和生物产量。

乙醇产量(Y_{P / S})(g / g)被认为是乙醇生产之间的比率(g / L)和糖消费(g / L),而乙醇体积生产率()(g / Lh)之间的比例乙醇生产(g / L)和发酵时间(h)。生物质产量(Y_{P / X})(g / g)被认为是生物质生产之间的比率(g / L)和糖消费(g / L),而生物质容积效率()(g / Lh)生物质生产之间的比率(g / L)和发酵时间(h)。

2.4。扫描电子显微镜(SEM)

原始的扫描电镜分析和稀硫酸预处理某人进行描述Kristensen et al。16]。原始和稀酸预处理某人是分布在一个12毫米的玻璃盖片涂有poly-L-lysine(σ诊断,巴西……)。干部分是安装在铝存根,sputter-coated (JEOL JFC - 1600)与金层,和用于扫描。准备样品进行扫描和成像使用日立S520扫描电子显微镜(日立,东京,日本)。

2.5。分析方法

自然某人和cellulignin(稀酸预处理某人)特征存在的主要化学成分(纤维素、半纤维素、木质素和灰烬)描述的方法由戈维亚et al。17]。化合物的测定水解hemicellulosic验证了高效液相色谱法(HPLC)。的内容葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、醋酸,和乙醇在色谱仪验证Schimadzu LC-10广告(日本京都)列配备BIO-RAD Aminex hpx - 87 h(300×7.8毫米)耦合示差折光检测器(RID-6A), 0.01 N硫酸作为洗脱液流速的0.6 mL / min,列温度45°C,注入量20μl对这些分析,样品9月以前透过Pak C18过滤器。糠醛的决心和5-hydroxymethylfurfural得到色谱Schimadzu-LC 10广告(日本京都),与列HP-RP18(200×4.6毫米),耦合到紫外探测器SPD-10A紫外吸收波长276 nm,洗脱液乙腈/水(1:8)和1%的醋酸。使用流为0.8毫升/分钟,列温度是25°C,以及注射量是20μl .这些分析,样品都是以前过滤膜Minisart 0.22μ米(缝匠肌、哥廷根、德国)。

细胞的浓度是由比浊法使用分光光度计(贝克曼杜640 B富勒顿,CA)在波长600 nm,与细胞的干重(g / L)通过校准曲线。测量了稀释细胞悬浊液,离心后,蒸馏水洗涤,再悬浮的细胞。

3所示。结果与讨论

3.1。甘蔗蔗渣水解和Hemicellulosic表征

某人提交稀酸水解,在这一步中,固体部分(cellulignin)水解hemicellulosic分开。Cellulignin也为化学成分特征。

甘蔗蔗渣细胞壁的化学成分(原始)和cellulignin是其主要成分的特点。图1介绍了原始的细胞壁成分和稀酸预处理蔗渣。

某人的细胞壁成分很难与现有的报告文学起源的差异,培养方法、气候条件和分析方法用于表征(4]。例如,原来的甘蔗蔗渣纤维素含量为39.52%(图1),而罗查et al。18)和Aguilar et al。19分别观察45.5%和38.9%的纤维素。同样,最初的某人是半纤维素含量25.63%(图1);然而,罗查et al。18和马丁et al。20.观察27%半纤维素在他们的分析。生某人的木质素含量为30.36%(图1),而Philippini [21]报道34.42%的木质素在本机某人。据Ek et al。22),都有一个相同的化合物浓度的变化生物物种由于植物的年龄差异,遗传因素和发展条件,以及气候和地理因素。一般来说,巴西甘蔗蔗渣各种纤维素浓度范围的38 - 46%,半纤维素在19 - 32%,木质素在19 - 31%和1.0 - -3%之间的火山灰和抽提和6.9%,分别为(4]。

某人加酸水解后,固体部分水解hemicellulosic分开。某人预处理也具有观察的化学成分和减少72%的半纤维素,显示该聚合物的稀酸水解的有效性部分溶解。这个结果是与研究Philippini密切协议(21)获得65%减少85%半纤维素从各种甘蔗的甘蔗渣物种数量。

专门在半纤维素稀酸水解行为的总体结构很混乱由于破坏聚合物的分数。扫描电子显微镜(SEM)分析显示原始表面的某人和稀酸水解后,清楚地揭示了细胞壁表面形态的变化在不同的放大图2)。

如图2,原来某人显微图显示的坚硬和密实度细胞壁和酸预处理某人显微图显示中断蔗渣表面由于降解半纤维素在某人的稀酸水解细胞壁表面显示中断和粗糙度的去除半纤维素和木质素移位。根据Alvira et al。5),酸水解后,某人在结构上修改。酸水解后纤维的分解。Milessi et al。12也观察到类似的外观的细胞壁稀酸水解后…

液相随着分数(原油hemicellulosic水解物)是由真空蒸发浓缩为了增加糖浓度。水解集中随后解毒的顺序氧化钙介导中和活性炭处理紧随其后。原始的构成、集中和解毒hemicellulosic水解物如表所示2。

水解条件促进了木糖的释放明显高于葡萄糖(浓度低于检出限),表明更大的敏感性比纤维素半纤维素的水解条件。这种行为是意料之中的事,因为,半纤维素的结构比纤维素水解容易[11]。

水解集中显示所有化合物浓度的变化。水解木糖的浓度存在于原油(10.09 g / L)增加约3.5倍后蒸发真空(37.43 g / L)。浓度后观察到0.39和2.72 g / L的血糖和阿拉伯糖,表明两人都出现在原油水解,但在低水平(以下检测限制使用的任何化合物的高效液相色谱方法)。

解毒策略(氧化钙介导中和+活性炭)曾考虑在我们实验室以前的经验表明,nondetoxified hemicellulosic水解抑制剂水平干涉发酵性能。实际上,尽管一些减少糖水平解毒过程后,发现有效的减少抑制剂,特别是糠醛和羟甲基糠醛浓度为5.710³5.9 g / L10⁴g / L和2.310²g / L0⁻³分别g / L,相比原文件和解毒玉米胚芽蛋白酶解物。据van Zyl et al。23),这个删除相关协会与二价钙离子抑制化合物,由于降水。

减少醋酸浓度的解毒途径是30%左右,显示最终浓度为1.269 g / L。根据昌德尔et al。24),存在少量的醋酸水解(直到2.0 g / L)可以提高在发酵过程中乙醇的生产。然而,宽容的微生物醋酸取决于微生物物种和栽培条件(25]。

3.2。发酵培养基的筛选

四个不同的媒体选择根据他们的简单性和低的化合物和好的结果发现相关文献使用酵母的乙醇生产美国shehatae。关于选择的配方,我们强调使用酵母提取物在所有媒体,一旦这种化合物被广泛用作有机氮源供酵母乙醇生产。酵母提取物含有约12%的总氮(Diadema Synth,巴西)。这种化合物是至关重要的补充hemicellulosic玉米胚芽蛋白酶解物使用的细胞美国shehatae对2 g乙醇生产。席尔瓦et al。26)报道,在不同氮源,酵母提取物是最重要的一个来源的生产乙醇。Maruthai et al。27]还得出结论,酵母提取物和硫酸铵生产乙醇的影响是最大的腰果苹果汁的酵母酿酒diastaticus。

水解发酵不同媒体(解毒某人+营养补充)在发酵的酵母美国shehataeUFMG-HM 52.2和发酵概要文件获得使用这些媒体如图3。

最大的乙醇浓度观察孵化的48小时后进行发酵的媒体。经过48小时的潜伏期,减少乙醇浓度观察。这种行为可以归因于总酵母可发酵糖的利用,产生的乙醇作为碳源同化。这一次后,细胞生长也较低与细胞的增长相比使用碳水化合物作为唯一的碳源。使用乙醇作为碳源消耗后使用酵母糖在先前的研究报道美国shehatae(24,28]。乙醇生产结果(乙醇产量和生产力)从每个实验如图4。

其他发酵参数,如生物质产量、生物量生产力、木糖消费,和醋酸的消费已经呈现在表3。

在所有发酵实验中,大约100%的消费初始糖被发现。媒介#显示,乙醇产量的大约0.38 g / g和0.19 g / L的生产力h(图4)。帕尔克等。13乙醇生产状况的评估美国shehatae写明ATCC 22984利用木材水解hemicellulosic和获得乙醇产量0.45 g / g。然而,很难比较乙醇生产参数相同的微生物生长在不同的木质纤维素玉米胚芽蛋白酶解物由于改变培养条件,栽培方法,水解和配置文件(24]。例如,相同的微生物(美国shehataeUFMG-HM 52.2在水解hemicellulosic草酸预处理后获得的某人,并配以3.0 g / L的酵母提取物、麦芽提取物的3.0 g / L, 5.0 g / L(硫酸铵)显示,乙醇产量的0.35 g / g (28]。这中被认为是有效的由于酵母提取物和硫酸铵,化合物容易找到市场,主要用于发酵培养基补充(27]。

中# B由帕尔克设计等。13)也进行发酵试验,显示乙醇产量(Y_{P / S})的0.36 g / g和0.2 g / Lh(图4)。Canilha et al。29日)也使用这一媒介在SBHH乙醇生产,但使用美国stipitisDSM 3651和报道Y_{P / S}0.30 g / g和0.13 g / Lh。尽管这些结果用不同的酵母,这些作者表示这些媒体制定的潜力。这一特性也展示了通过使用美国shehataeUFMG-HM 52.2,在我们的工作导致了更高的价值Y_{P / S}相比。媒介#和# B是由麦芽提取其中包含73.1%的麦芽糖,葡萄糖,果糖(30.]。

中# C使用基于通用电气等的研究。14),乙醇生产性能评估的美国shehataeHDYXHT-01木糖为主要碳源。在这项研究中,乙醇产量为0.41 g / g,在目前的工作中获取的值,0.38 g / g和地方0.2 g / Lh是获得美国shehataeUFMG-HM 52.2使用# C中。

使用介质# D显示大约发酵实验Y_{P / S}0.23 g / g和0.12 g / Lh。此前,这一媒介被太阳和道15乙醇生产的美国shehatae中金公司1766年从稻草水解物在pH值5.5和实现Y_{P / S}和0.31 g / g和0.175 g / L分别h。这种营养媒介没有重大变化乙醇发酵生产比其他媒体#,# B, C #。值得注意的是这种媒介没有蛋白胨或硫酸铵,其中包含约11% (Sigma-Aldrich,圣保罗,巴西)和21% (Isquisa化学、科尔多瓦、墨西哥)总氮,分别,这表明这些营养素的培养的重要性美国shehataeUFMG-HM 52.2。

在目前的研究中,一个小的浓度L-arabinose(约2 g / L)被发现在发酵肉汤。L-arabinose没有利用美国shehataeUFMG-HM 52.2。Spencer-Martins [31日]还发现没有甘露糖和阿拉伯糖的消耗美国shehatae。醋酸浓度被发现被同化美国shehatae培养48 h后导致增加发酵肉汤的pH值。菲利普et al。32)也报道使用醋酸作为碳源,酵母。然而,醋酸的浓度对微生物的宽容可能会有所不同根据物种使用和培养条件25]。

发酵媒体#,# B, C #显示类似的乙醇产量(约0.37 g / g)和生产力(约0.20 g / Lh)。中# D,另一方面,表现出低水平的乙醇产量(0.23 g / g)和生产(0.12 g / L与其他媒体相比h)。之间的差异乙醇生产的结果评估媒体并不重要,根据图基的测试进行了考虑的复制实验。在这个分析中,只有中等4有表明其较低的性能,与观察到的显著差异相对于其他媒体()。

生物质容积效率()和生物质产量(Y_{P / X})类似的所有发酵化验(约0.06 g / L0.10 h和g / g,职责)。有趣的是Y_{X /秒}和低于Y_{P / S}和,表明酵母代谢被定向到乙醇的生产在所有测试。在所有发酵媒体调查,媒介#显示高值的乙醇产量(0.38 g / g)和生产力(0.19 g / Lh)。这个发酵培养基配方是廉价和简单的,可能是一种理想的饲料种植美国shehataeUFMG-HM 52.2大规模生物炼油厂的操作。

4所示。结论

四个不同的发酵媒体乙醇生产的配方进行了评估美国shehataeUFMG-HM 52.2使用甘蔗蔗渣水解hemicellulosic作为主要碳源。发酵媒体#,# B, C #显示类似的乙醇产量和生产力而中等# D显示乙醇生产比别人低。我们强调媒介#由于其简单的作文(5 g / L硫酸铵,3 g / L酵母提取物、麦芽提取物的3 g / L)显示,乙醇产量为0.38 g / g和0.19 g / L的生产力h。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者欣然承认金融支持从FAPESP-BIOEN FAPEMIG, CNPq和披风。