通过凝聚Peptide-Loaded固体脂质纳米粒制备技术

文摘

硬脂酸固体脂质纳米粒是准备根据一项新的技术,称为凝聚。这个实验工作的主要目标是肽药物的诱捕SLN,这是一个艰巨的任务,因为他们的化学特性(分子量、亲水性和稳定性)阻碍含有肽配方。胰岛素和leuprolide,选为模型肽药物,后被封装在纳米颗粒与阴离子表面活性剂疏水离子配对。肽的完整性是维持封装后,纳米粒子可以行动在体外作为一个持续为肽释放系统。

1。介绍

胶体载体系统的发展在近年来药物管理局已经吸引了越来越多的关注创新策略来克服频繁治疗失败由于不可预知的药物的生物利用度在由传统的路线和传统的剂型。最调查系统是简单的和多个乳剂、脂质体、胶束、微-纳米粒子基于合成聚合物或天然大分子(1]。

特别是,多肽和蛋白质药物代表一个非常重要的一类药物,由于在生理和病理上的理解他们的角色以及在生物技术和基因工程的研究进展。不幸的是,他们的特点是生物半衰期短,容易被蛋白水解酶降解;此外,大多数肽不跨越生物障碍由于他们贫穷的扩散系数和低分配系数。

多肽和蛋白质的截留nanoparticulate系统仍然是一个艰巨的任务,因为每个分子的特点是基本属性(例如,分子量、亲水性和稳定性),可能会以某种方式不同对另一个。这种情况常常阻碍含有肽配方,因为每个肽变成了一个案例研究的主题。正确制定战略的选择主要是由溶解度和分子稳定性的考虑2]。

在过去的二十年,固体脂质纳米粒(sln)吸引了越来越多的关注有效胶体药物载体,替代高分子纳米颗粒与准备的优势生理和无毒的脂质,作为常见的药用辅料(3]。

脂质作为基质材料的使用肽和蛋白质用缓释配方,据报道只有几个作者(4,5),由于脂质矩阵的疏水性,可以更合适将亲脂性的药物而非亲水性的蛋白质。

方法生产固体脂质纳米粒(sln) W₁/ O / W₂多个乳剂是由我们的研究小组应用solvent-in-water emulsion-diffusion技术(6]。胰岛素被选为亲水性多肽药物溶解在酸性内部水相(W₁)的多个乳剂和SLN中因此进行。几个部分较低的水溶性液体溶剂毒性筛选为了优化乳剂和SLN组成、评估后,胰岛素没有经过任何化学改性在不同溶剂的存在和生产工艺条件。然而,能够很好的证明,大多数肽可能在某种程度上改变了接口和激动压力通过这种方法(7]。

此外,低可溶性肽(例如,有等电点接近中性pH值)应该在非水溶剂溶解或悬浮在一个适当的媒介。在之前的工作中,我们的研究小组开发出一种技术,将溶剂稀释法应用于一个O / W乳液与异戊酸内阶段,允许在SLN封装胰岛素,由于胰岛素的增溶在异戊酸8]。

另一个策略来促进肽药物封装在lipid-based微粒系统是通过形成drug-surfactant来增强其亲油性复杂的离子对技术(9]。基于一个阴离子两亲性分子之间的相互作用和一个带正电荷的蛋白质,离子配对发生在表面活性剂浓度低于临界胶束浓度(CMC)和pH值低于蛋白质的等电点(10,11]。

最近,一个新的、无溶剂SLN生产技术是由我们的研究小组(12]。短暂,当脂肪酸碱性盐胶束溶液的pH值在一个适当的聚合物稳定器,是降低酸化,脂肪酸沉淀由于质子交换之间的酸溶液和肥皂;这个过程被定义为“凝聚”。

这一创新技术允许加载亲脂性的药物在胶束溶液中的分解之前酸化(13),也可以成功地应用于疏水离子对亲水性药物(14]。

本研究的主要目的是评估可能使用疏水离子配对(臀部)封装胰岛素和leuprolide模型肽在SLN通过凝聚,对纳米颗粒大小和最后的药物封装效率和释放。

2。材料和方法

2.1。材料

乳酸和柠檬酸来自A.C.E.F. (Fiorenzuola d 'Arda、意大利);80%水解聚乙烯醇9000 - 10000兆瓦(PVA9000), 89%水解聚乙烯醇85000 - 120000兆瓦(PVA85000)、右旋糖酐60000 - 90000,和牛胰岛素(σ)来自(英国多塞特郡);硬脂酸钠(SS)和钠dodecylsulfate (SDS)与丙烯酰胺(书、瑞士);2,3-epoxypropyl苯基醚来自奥尔德里奇(美国圣路易斯);sulfosuccinate辛酯(AOT)来自默克(达姆施塔特,德国);leuprolide乙酸(= 1210)是一种礼物,索林Spa (Saluggia、意大利)。蒸馏水是纯化使用Milli-Q系统(微孔、贝德福德、钼)。所有其他化学试剂均为分析纯,使用前未经纯化。

2.2。制备多肽药物离子对

疏水肽离子对准备根据文献方法(15,16]。酸性或中性肽解决方案与反离子混合解决方案在不同肽:反离子摩尔比率。

胰岛素(1毫克/毫升)盐酸溶解在水pH值2.5解决方案,和一个SDS水溶液在1:添加6摩尔比率,根据文献报道[15]。

Leuprolide醋酸(1毫克/毫升)溶解(一)在水中(产生的pH值6.5);(b)在一个水pH值4.0醋酸溶液;

和一个AOT水溶液在相同的pH值添加1:1和1:2肽:反离子摩尔比(16]。

沉淀形成都是离心机在55000 g(爱兰歌娜R64离心机,贝克曼库尔特),用去离子水清洗三次,然后冷冻干燥24小时。

加权的冻干的产品是溶解在甲醇,添加同等体积的水,然后由高效液相色谱分析肽测定来评估实际的肽:反离子摩尔比。

2.3。胰岛素的高效液相色谱分析

胰岛素和A21-desamido胰岛素,胰岛素的主要降解产物(17通过rp),进行分析;A21-desamido胰岛素是由存储牛胰岛素在0.01用盐酸50°C 48 h (18]。色谱仪是配备了日本岛津公司高效液相色谱系统(日本岛津公司、米兰、意大利),设定在220海里。为rp - C18柱(贝克曼Ultrasphere 25×0.4厘米)受雇。流动相是0.1 Na₂所以₄/ CH₃CN(72/28)带来了pH值2.3 H₃阿宝₄,在1毫升min¹(19]。保留时间是11分钟和12.5分钟胰岛素和A21-desamido胰岛素,分别。校准图建于-20年0.8更易与L⁻¹的范围内。

校准曲线的线性值(0.9981)的证明R²回归方程的系数:y= 6.97 * 10¹⁰×16176−。定量限,提出了实验中定义的最低的胰岛素浓度曲线,可以测量通常可接受的精密度和准确度,更易与1.0毫升¹;定义为较低的检出限,LOD 0.40更易与L¹。

2.4。Leuprolide高效液相色谱分析

色谱仪是配备了日本岛津公司高效液相色谱系统(日本岛津公司、米兰、意大利),设定在278海里。为rp - C18柱(Chromosystem 15×0.4厘米)受雇。流动相是CH₃哦/小时₂O(60/40)组织0.1%,交货1毫升min¹。保留时间为6分钟。校准图构造在0.02 - -0.2更易与L¹的范围内。

校准曲线的线性值(0.9996)的证明R²回归方程的系数:y= 0.041×−0.0166。定量限,提出了实验中定义的最低leuprolide浓度曲线,可以测量通常可接受的精密度和准确度,更易与0.02毫升⁻¹;定义为较低的检出限,LOD 0.05更易与L⁻¹。

2.5。SLN制备

硬脂酸(SA) sln准备根据先前描述的凝聚方法文献[12]。短暂,党卫军是分散在水溶液中聚合的稳定器,并搅拌下加热混合物(300 rpm) 50°C来获得一个明确的解决方案。一个已知数量的肽乙醇溶液(25毫克/毫升)然后添加,并不断进行搅拌直至完全溶解。选定的酸化的解决方案(凝聚层解决方案)然后添加一滴一滴地如先前所述文献[12]。获得的暂停然后冷却在300 rpm下水浴搅拌直到15°C。

2.6。SLN描述

SLN粒度和粒度分布是由激光光散射技术(美国纽约布鲁克海文国家实验室)。群众用水稀释,测量在一个角度90°。

药物封装效率(EE %)计算之间的比率的药物封装在脂质矩阵和药物的使用纳米粒子做准备。封装药物的测定,一个已知数量的SLN暂停离心机在55000克;沉淀是用水洗了盐酸和0.1 N或,分别对胰岛素和leuprolide。然后沉淀是干和溶解在甲醇;0.1盐酸或水被添加到解散胰岛素和leuprolide,分别和脂质沉淀,那么两个肽通过高效液相色谱法进行分析。

2.7。在体外Leuprolide释放纳米颗粒

第一系列的实验是由使用“试管”方法[20.]。

10毫升正癸醇作为有机相,分层的表面上10毫升leuprolide-AOT-loaded SLN,和系统一直在轻微的搅拌(50 rpm);在预定的时候,少量的接收阶段被撤回的上层清液分析spectrophotometrically 278 leuprolide决心。

系统研究:(我)0.05% leuprolide AOT 1: 2离子对加载1%与0.5% PVA9000或PVA85000 SA SLN稳定;(2)0.05% leuprolide AOT 1: 2离子对水溶液作为空白解决方案。

第二个一系列的实验是由使用模型的“扩散通过亲水膜”(21]。发布研究通过使用multicompartment旋转细胞(1毫升的施主和受主隔间)Servapor纤维素膜(MWCO 12000 - 14000 Da,美国赛瓦,海德堡,德国)。蒸馏水作为接收阶段。在预定的时候,接收的解决方案被撤回,分析spectrophometrically 278海里,取而代之的是新的接收阶段。

系统研究:(我)0.05% leuprolide AOT-loaded SA SLN稳定PVA85000 0.5% 1%;(2)0.05% leuprolide AOT 1: 2离子对水溶液作为空白解决方案;(3)0.05% leuprolide水溶液作为空白解决方案。

3所示。结果与讨论

胰岛素和SDS之间离子配对是发表在文献[15]。表面活性剂:肽1:6克分子比复杂被广为研究,化学稳定性;值得注意的是在远紫外圆二色性光谱没有任何变更在多肽二级结构离子配对。此外,一个增强的耐高温收购后的肽离子配对(15]。这些数据提供了一个良好的基础胰岛素SLN内封装的尝试。在当下work-mild操作温度以及热阻的增加胰岛素:SDS离子对,后被视为好假设保持药物稳定纳米粒子制备。

Leuprolide醋酸合成九肽是一种模拟自然产生的促性腺激素释放激素(GnRH或LH-RH);比天然激素模拟拥有更大的力量。它作为一种促性腺激素分泌的有效抑制剂在不断和治疗剂量。动物和人类的研究表明,在最初的促性腺激素的刺激,长期管理leuprolide乙酸抑制卵巢和睾丸甾类产生的结果。这种影响是可逆的停药后药物治疗。管理leuprolide醋酸导致某些激素依赖性肿瘤的生长抑制(前列腺肿瘤在高尚和邓宁雄性老鼠在雌性老鼠DMBA-induced乳腺肿瘤)以及生殖器官的萎缩(22]。Leuprolide有两个ionisable基本侧链,一个咪唑组的()和一个胍组参数()。因此,疏水离子配对leuprolide各种酸性两亲水脂分子等一系列烷基磺酸盐与不同的烃链是试图增强其亲脂性的分配系数(16]。在本实验研究中,线性烷基磺酸盐取而代之的是亲脂性的AOT越多,这是支化烷基磺酸盐。

肽的化学计量学反离子的离子对通过高效液相色谱分析,证实了leuprolide AOT和胰岛素SDS。根据文献数据,发现在去离子水(中性pH值)1:1 leuprolide一乙酸酯:AOT离子对成立。在pH值4.0二乙酸(醋酸)leuprolide在场,1:2离子对。离子对化学计量依赖于pH值的变化,但不是在AOT浓度,因为没有进一步的变化在化学计量学指出通过增加药物:反离子摩尔比为1:4,无论是在中性pH值,还是在pH值4.0。

在表1组成、平均直径和封装效率(EE %)的空白和peptide-loaded SLN所示。

它可以指出,几个leuprolide-loaded, 1% SA SLN稳定与不同浓度的两种不同的聚合物。Leuprolide-loaded 1% SLN准备使用1:1和1:2离子对。为了提高EE % 1: 1离子对,PVA9000浓度从1%减少到0.25%,因为高浓度的聚合物可以加强外的离子对溶解度的阶段。降低聚合物浓度,增加颗粒大小是指出没有加强EE %,可能是因为PVA9000作为立体稳定器,涵盖SLN表面从而避免纳米粒子聚合;通过减少聚合物浓度、纳米粒子平均尺寸将会增加可能是因为聚合现象。使用higher-molecular-weight PVA(85000而不是9000)并不影响EE %,这仍接近50%。显著增加EE %(86.8)时达到1:2 leuprolide: AOT离子对SLN加载,这是完全独立于所使用的聚合物。1:2的可能,亲油性越高离子对在1:1确定一个更好的药物分配在党卫军胶束的疏水核心,因此,在SA-SLN。Polymer-ion一对相互作用似乎不相关leuprolide EE %。

否则,对于insulin-loaded SLN, 2%的脂质和聚合物(PVA9000)使用,因为在低浓度的脂质和PVA9000,纳米颗粒发生聚合,可能是因为党卫军胶束施加扰动的高分子量的肽,在凝聚过程中。更高浓度的肥皂和聚合物的使用可能带来的不稳定影响最小化肽封装。

胰岛素封装的有效性评估通过清洗离心机SLN有0.1 M盐酸删除从SLN表面吸附药物;高情感表达%(89%)被发现。自从nanoparticles-loaded肽的稳定性是一个很重要的问题,缺乏A21-desamido胰岛素的情况下,最常见的热降解产物的胰岛素,通过rp - SLN评估分析;不到5% A21-desamido胰岛素在封装药物恢复,说明化学肽在凝聚过程的完整性。

验证的有效封装内离子对纳米颗粒药物释放研究自封装的离子对固体脂质矩阵,与随后的固定,导致减少的释放速度(23]。此外,肽释放纳米粒子是一个重要的目标尤其是长期而渐进的交付是必要的,也就是说,leuprolide在前列腺癌治疗;所以leuprolide在体外释放SLN研究根据文献中描述的两种不同的方法。

首先,使用试管试验。这个方法包括两个步骤:释放的药物纳米颗粒水外阶段和迁移到有机相,它积极的分区,由于离子对的亲油性。尽管nonphysiological介质分区的步骤,这个试验适用于获得完整的释放在几个小时内,由于有机相溶解容易亲脂性的分子或复杂的。结果如图所示1。加载1:2离子对SLN减少引起的释放率相比,1:2离子对水中悬浮体,因为脂质中的离子对固定矩阵。聚合物的年级涵盖SLN作为立体稳定器的表面,可能会影响药物的释放的脂质矩阵在较低的程度上,可能由于与药物的相互作用吸附到SLN表面。

在图2通过亲水膜,扩散研究的结果报道。这个试验包括两个步骤:膜和释放的穿越到接收的阶段。纤维素膜几乎完全透水leuprolide在24小时内,以便释放接收阶段限制步骤。版本1:2离子对减少装载在纳米粒子时,确认封装内的脂质矩阵;释放慢得多,而试管试验由于离子对在水中的溶解度降低而正癸醇。

4所示。结论

疏水离子配对leuprolide和胰岛素,选为模型肽,允许这些分子的封装SLN通过凝聚技术生产;离子对的化学计量学是封装效率、行列式作为leuprolide演示。所需的温和加热凝聚过程并不影响肽的化学稳定性,因为没有相关的A21-desamido胰岛素,胰岛素的主要热降解产物,后被发现在纳米颗粒封装。SLN可以持续释放系统在体外肽(即。,leuprolide), because of the entrapment of ion pair within the lipid matrix.

承认

意大利的支持研究(MIUR)主要06计划部长。

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