文摘
哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)通路在糖尿病肾病的发展起着重要的作用和其他与年龄相关的疾病。DN的特点之一是p21的表达升高WAF1 / CIP1。然而,mTOR的重要性p21调节信号通路是知之甚少。在这里,我们调查的影响二甲双胍和雷帕霉素mTOR-related表型上皮细胞系的来源。本研究报告,二甲双胍抑制高glucose-induced p21的表达。高葡萄糖与二甲双胍在调节细胞大小、增殖和蛋白质合成。这些影响与减少AMPK活化有关,影响下游mTOR信号。然而,抑制mTOR通路的雷帕霉素对p21表达没有负面影响,这表明二甲双胍调节p21 mTOR的上游。这些发现支持这一假说的AMPK激活可能调节p21的表达,这可能影响糖尿病肾病和其他与年龄相关的疾病。
1。介绍
出现了戏剧性的增加,糖尿病的患病率近年来(1]。糖尿病的慢性影响可能体现在宏观和微血管并发症的糖尿病患者的发病率和死亡率的主要原因。糖尿病肾病(DN)、微血管并发症之一,是死于肾衰竭的主要原因2,3]。除了血液动力学的因素,高血糖症已被证明是在DN发病的根本原因。高血糖症的危害已经部分归因于细胞葡萄糖摄取增加细胞不环境免受高葡萄糖水平。DN早期细胞的变化发展包括增生和肥大4]。
一些调查人员相关的表达Cip / Kip细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂,p21和p27,肾小球肥大(5- - - - - -7]。已经提出,p21和p27可能参与独立肥大细胞周期调控的属性(Monkawa 2002)。此外,p21和p27的感应也衰老逮捕,所需的分子签名肥厚性改变的早期糖尿病肾病的发展(8]。p21,零老鼠不开发肾小球肥大支持p21在DN的重要性9]。
哺乳动物雷帕霉素靶的激活(mTOR)丝氨酸/苏氨酸激酶,扮演一个关键的角色在肾脏肥大的病理形式(10- - - - - -12]。mTOR形式两个复合物与截然不同的功能和物理特性。这些蛋白质复合物有两个不同的脚手架,猛禽和rictor。通过与不同的下游目标交流,这些脚手架蛋白mTOR连接到不同的信号通路,导致离散功能角色(13]。
raptor-mTOR蛋白质复杂的雷帕霉素敏感;它集成了细胞外和细胞内的信号来自生长因子、激素和营养物质。这个复杂的过程中有着重要的作用,调节细胞反应通过磷酸化的下游靶蛋白,营养P70S6 Kinase1 (S6K)和起始因子4 e [14]。对骨骼肌细胞的研究表明,通过一个负面的反馈机制,mTOR通路的激活可能导致胰岛素抵抗[15]。此外慢性雷帕霉素治疗大鼠诱导肝gluconeogenic酶的表达,这可能影响血糖水平在糖尿病状态(12]。另一方面,它显示了几个调查人员的抑制mTOR信号通路有治疗潜力的治疗DN (13,16]。
mTOR也受到活化蛋白激酶(AMPK),胞内腺苷酸水平的传感器(17]。哺乳动物AMPK heteromeric复杂组成的催化亚基之一α和监管β,γ子单元。通过构象的变化γ亚基,AMP促进刺的磷酸化- 172上α亚基通过各种上游激酶,包括Ca2 +-calmodulin-dependent激酶βTGF -β活化激酶1,LKB1丝氨酸/苏氨酸激酶(18]。AMPK活化普遍与抑制mTOR信号有关。抗糖尿病的药物二甲双胍耗尽细胞ATP水平通过阻断线粒体呼吸复杂。反过来,安保水平升高引起的激活AMPK [19]。然而,它已经表明,二甲双胍可以通过一个激活AMPK AMP-independent机制(20.]。尽管AMPK活化的抑制mTOR信号,最近的研究也表明,二甲双胍可能废除mTOR激活AMPK的独立17]。除了下蛋白质其耐受性属性,二甲双胍可能在各种临床设置(有几个好处21]。
根据临床研究1型和2型糖尿病、长期高血糖症的主要原因是DN (11,22]。一些研究表明,过量的葡萄糖增加单元格大小不同细胞类型通过Akt-mTOR信号的激活;然而,导致glucose-induced mTOR激活机制并没有被很好的定义。有人建议,肥厚性改变引起的高血糖症可通过自分泌mTOR激活的结果TGF -β信号(23]。此外,mTOR活动也一直与表达增加有关的系膜细胞的葡萄糖转运蛋白1 (GLUT1) (24]。然而,系膜细胞葡萄糖摄取的饱和据报道发生在30 mM,表明高血糖症能引起mTOR没有增加GLUT1表达式(25]。
本研究的目的是比较雷帕霉素和二甲双胍增殖的抑制作用和细胞生长在高glucose-induced AMPK / mTOR的背景下信号。我们发现微分的影响二甲双胍和雷帕霉素在几个AMPK / mTOR-related方面与相关细胞生长和细胞特异表达自行车在DN。
2。材料和方法
2.1。细胞培养、治疗和转染
人类胚胎肾细胞系(HEK293)保持在最低基本媒体(表达载体)补充10%的边后卫,1%笔/喉炎的症状(表达载体),和1% MEM不必要的氨基酸的解决方案。细胞培养在37°C 95%空气/ 5%股份有限公司2环境和通过在subconfluence每3 - 4天。
有条件地使人类足细胞(由教授萨利姆,布里斯托尔)包含11毫米葡萄糖RPMI 1640培养基培养,10%胎牛血清1%青霉素和链霉素。简而言之,足细胞的细胞系是由孤立细胞从正常人类肾脏标本和转染温度敏感猴病毒40大t抗原。细胞增殖在宽容33°C,然后培养细胞在37°C开关t抗原表达,允许细胞承担本地表型。在实验中,这些细胞在growth-permissive条件下使用。
细胞培养与不同浓度的葡萄糖(Sigma-Aldrich)。在适当的地方,甘露醇(Sigma-Aldrich)是用来控制渗透效果。雷帕霉素股票的解决方案准备在95%乙醇。最终乙醇浓度保持在0.1%以下。二甲双胍(Sigma-Aldrich)股票的解决方案是在磷酸缓冲盐(PBS)。股票的解决方案是过滤消毒。车辆控制被包含在每个实验和施加不影响细胞的生存能力。
八个pGIPZ慢病毒成分结构对人类的活化,alpha2催化亚基(PRKAA2),和一个nonsilencing构造从开放购买生物系统。pGIPZ质粒被存储在细菌培养大肠杆菌(' +)磅·伦诺克斯(5克氯化钠/ L)和8%的甘油,100μg / mL羧苄青霉素,25岁μ克/毫升zeocin。隔离的质粒DNA是由质粒Midi设备(试剂盒)根据协议提供的制造商。生成的稳定细胞系是使转染HEK293细胞2μg / mL质粒DNA在24孔板用在转染试剂(开放生物系统)。选择稳定转染细胞在媒介提供8μ克/毫升嘌呤霉素。
2.2。扩散分析
细胞悬液在96年被加载井microtitre板1×104/毫升时密度,让它生长,直到50%融合细胞暴露于实验条件。细胞增殖测定使用细胞Titre96 AQueous非放射性细胞增殖测定(Promega)。扩散试验是一种spectrophotometrically MTS-based方法措施四唑盐甲瓒产品的转换。这个产品的吸光度被分光光度法测量490海里。这个产品的数量成正比的活细胞数文化。
2.3。流式细胞术
进行流式细胞术分析细胞周期分布和细胞大小在HEK293细胞中。治疗后,细胞被离心法与PBS trypsinised,洗两次在200 g 5分钟(min)。细胞进行细胞周期分析通用固定在冷盐水和90%乙醇(1:3比率)和存储在-80°C。分析之前,在500 g细胞离心5分钟,在流式细胞仪resuspended缓冲区(PBS, 2% FCS, 10毫米叠氮化钠),与100年和治疗μg / mL核糖核酸酶(σ)。DNA是沾染了50μg / mL propidium碘(σ)1小时(h)在室温下(RT),和1×10的比例4细胞G1 / G0、年代和G2 / M期细胞决定。resuspended在流式细胞仪分析细胞的细胞大小缓冲区和相对前进侧散射决定Becman-Coulterton史诗XL。制程流式细胞分析仪运行EXPO32 ADC软件(10000事件)。为了研究细胞的生存能力,propidium使用碘染色。浮动和附着细胞被trypsinisation收获,颗粒状的离心200克五分钟,然后用流式细胞仪洗两次缓冲区。20的颗粒在流式细胞仪resuspended缓冲区μg / mL propidium碘,对冰10分钟,孵化,分析了染料包容在BD Accuri C6流式细胞分析仪。
2.4。蛋白质提取和免疫印迹
提取细胞蛋白质从至少两个独立的实验中,除了含有20毫米的裂解缓冲Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,1毫米EDTA,共同1%,1片/ 10毫升PhosSTOP磷酸酶抑制剂(罗氏)。悬挂在14000×g离心机和上层清液含有细胞蛋白质收集。西方墨点法,12.5%的钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶是在标准条件下运行,装载25μ克每车道总蛋白。凝胶是放置在转移缓冲和设置转移到聚偏二氟乙烯膜在一夜之间250毫安。膜在Tris-buffered盐水冲洗沉浸在阻断缓冲区(2% BSA) 1 h然后用初级抗体(P-mTOR Ser孵化2448年,P-AMPKα用力推172年,P-S6K刺389年p21, 1: 1000年,在4°C细胞信号)在一夜之间。在清洗缓冲冲洗后,细胞膜是孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(细胞信号)1 h 1: 5000稀释沿一个增强化学发光试剂盒(Amersham)是用于检测的乐队。为了控制蛋白质加载、total-mTOR和β肌动蛋白抗体被用来(1:1000年,细胞信号)。
2.5。免疫细胞化学
HEK293细胞融合在玻片培养达到60%。暴露在8毫米二甲双胍后24 h,细胞在PBS和4%多聚甲醛固定15分钟在PBS的rt,幻灯片都洗,permeabilized,和阻塞Triton x - 100 0.2%, 10% FCS, 125毫米赖氨酸,叠氮化钠10% 30分钟。幻灯片在清洗和初级抗体孵育1:400稀释(p21、细胞信号)在一夜之间。这些细胞被冲洗,随后孵化Alexa萤石568(表达载体)山羊anti-mouse二级抗体1:500和DAPI 1: 1000稀释1 h rt,幻灯片被荧光显微镜分析(尼康eclipse 80我显微镜,尼康数码彩色相机)。控制包括初级抗体的遗漏。
2.6。总蛋白/细胞数的比例
总蛋白/细胞数量比被用来确定细胞生长的变化应对高葡萄糖治疗伴有细胞肥大。的实验中,在基本培养基培养HEK293细胞。在治疗期结束后,细胞trypsinised和洗两次PBS和计入一个血球计室。细胞是细胞溶解BCA蛋白质测量总蛋白质含量的测定(热科学)。表示为总蛋白/细胞数的比例μ克/ 105细胞被用作肥大指数。
2.7。数据分析
所有的数据分析与IBM SPSS 19。数据表示为±SEM手段。常态分布验证了列文Shapiro-Wilk试验和方差齐性的测试。除非另有指示,计算了统计学意义上的差异以及或单向方差分析。比较组间与图基posthoc进行测试。差异被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。剂量反应研究二甲双胍和雷帕霉素在HEK293细胞增殖的影响
为了描述二甲双胍和雷帕霉素在HEK293细胞增殖的影响,剂量反应研究,利用MTS试验。在其他的研究相比,二甲双胍和雷帕霉素的影响已经通过使用Alamar蓝色代谢试验(26]。研究人员发现了一个浓度差异二甲双胍和雷帕霉素对扩散的影响。为了测试他们的结果是否可以复制使用MTS试验,这两种药物被用于同样的浓度范围(26]。结果表明,在24小时内,二甲双胍和雷帕霉素抑制细胞生长在HEK293细胞中剂量依赖性的方式(图1)。然而,二甲双胍浓度的增加抑制扩散以线性方式,而越来越多的雷帕霉素的浓度在10 - 500纳米的范围并没有导致细胞增殖显著变化。尽管Zakikhani et al。26)使用低血清浓度和培养时间延长;这里给出的结果符合他们的研究结果,表明二甲双胍对细胞增殖的抑制作用是浓度,比雷帕霉素浓度更高,更加明显。此外,20μM C化合物(dorsomorphin),研究化合物广泛用于抑制AMPK metformin-induced有相反的影响减少核扩散。
(一)
(b)
3.2。高Glucose-Treated HEK293细胞不同应对细胞周期抑制二甲双胍和雷帕霉素
这个实验的目的是探讨如何影响细胞循环二甲双胍和雷帕霉素治疗,以及细胞周期的变化是否由高葡萄糖浓度调制。二甲双胍对细胞生长和增殖的影响已经被各种细胞培养调查研究[17,27,28]。在这些研究中使用二甲双胍的浓度范围10 - 20毫米。使用这些相对高浓度的二甲双胍可能归因于这种药物的低吸收被永久细胞系(21]。在抑制肝醣类的上下文中,使用二甲双胍在毫克分子范围内已被证明是生理相关(19]。8毫米二甲双胍抑制作用的细胞周期进展已经证明在乳腺癌细胞的细胞培养研究。在易感细胞浓度导致细胞数量减少约50%在24小时文化时期(29日]。作为显示在图1在8毫米浓度,二甲双胍减少约50%扩散引起的,表明我们的发现可能与早期的研究(29日]。在这个实验中使用二甲双胍在8毫米及其对细胞的影响骑自行车比较雷帕霉素。雷帕霉素对扩散的影响也被研究血管平滑肌细胞。雷帕霉素对增殖的抑制效果所示的一系列浓度(1 - 100 ng / mL)。还报告说,雷帕霉素并不影响生存能力的培养细胞浓度范围(30.]。为了最大化的影响细胞循环,在这个实验中使用雷帕霉素在100海里。
在细胞培养模型的糖尿病高葡萄糖浓度范围从25到30毫米(31日]。它也被证明由几个调查人员,24 - 72 h后高葡萄糖诱导细胞变化与糖尿病肾病的发展,包括蛋白质合成增加,扩散,TGF -的表达β。在这些研究中,高达72 h文化时期,葡萄糖对生存能力没有显著的影响(32- - - - - -35]。为了研究高葡萄糖是否影响细胞循环,30毫米葡萄糖治疗被用于72 h。为了控制高葡萄糖的渗透影响,正常培养基含有5.5毫米葡萄糖与24.5毫米甘露醇补充。这糖是广泛用于类似的研究目的36- - - - - -38]。
细胞周期分析的结果表明,二甲双胍和雷帕霉素的百分比增加细胞G0 / G1期(图2(一个))。相比之下,二甲双胍对细胞周期的影响高于雷帕霉素抑制。然而在高葡萄糖治疗条件,metformin-induced细胞周期阻滞被废除。相比之下,高葡萄糖没有影响rapamycin-induced细胞周期阻滞。渗透影响的概率扮演了一个角色的逆转metformin-induced高葡萄糖低细胞周期阻滞,如甘露醇克分子数相等的高葡萄糖浓度,并没有以同样的方式影响细胞循环。然而,甘露醇治疗引起明显降低在G2 / M期metformin-treated条件。这种效应在mannitol-only条件不能观察到的。由于细胞凋亡可以诱导通过G0 / G1逮捕,测试是否很重要,细胞周期阻滞由二甲双胍和雷帕霉素可以增加细胞凋亡39]。调查,pre-G0的百分比/ G1细胞测量中所描述的方法。结果表明,二甲双胍和雷帕霉素引起的百分比显著增加pre-G0 / G1细胞(图2 (b))。
(一)
(b)
3.2.1之上。二甲双胍是AMPK-Dependent细胞周期抑制
二甲双胍是一个描述的AMPK激活(40]。HEK293细胞表达的α1,αAMPK 2亚型;然而,它是α2亚基主要是参与减少引起的AMPK激活ATP合成(41]。根据一个被广泛接受的观点,二甲双胍涉及的细胞效应的抑制线粒体电子传递链;因此,它预计,二甲双胍AMPK施加其影响α2-dependent方式(21,42]。为了研究在细胞周期调控AMPK的参与,AMPK的alpha2对碘氧基苯甲醚在HEK293细胞中撞倒了ShRNA-mediated方法。AMPKα2击倒验证通过测量172年苏氨酸磷酸化两亚型(α1,α2)α亚基(数字3(一个)和3 (b))。在AMPK nonsilencing条件相比,α2击倒细胞二甲双胍没有诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期(数据3 (c)和3 (d))。AMPKα2缺乏可比性的影响高葡萄糖治疗逆转metformin-induced细胞周期阻滞。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。高葡萄糖有相反的影响引起的细胞大小减少二甲双胍
相对于循环细胞G0 / G1逮捕细胞减少细胞大小表型(23]。为了调查如果细胞大小测量与细胞周期实验,大小的HEK293细胞流式细胞仪测定。这种细胞类型据报道有一个内在的细胞融合的大小在不同阶段的变化(43]。然而,在我们的研究中未发现显著差异的大小HEK293细胞融合水平60%(数据没有显示)。二甲双胍导致细胞大小减少约20%,在同等级别雷帕霉素(图的影响4(一))。在组合条件下高葡萄糖,药物对细胞的影响大小正好相反,metformin-treated条件更为显著的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
二甲双胍的依赖AMPK在细胞大小调节也被调查。符合图中给出的结果4(一)、二甲双胍降低引起的细胞大小的控制,nonsilencing条件(图4 (b))。在AMPKα2-deficient细胞二甲双胍抑制细胞大小相同的程度上控制细胞一样。正如所料,高葡萄糖逆转的影响在单元尺寸控制和AMPK二甲双胍α2-deficient细胞。AMPK的作用是进一步研究通过使用C化合物C。一些报道表明,化合物可能通过细胞凋亡促进细胞死亡(44,45]。调查C化合物的毒性,细胞的生存能力是由propidium碘染色。虽然细胞的生存能力没有明显影响治疗,细胞大小是衡量propidium iodide-negative细胞群。复合C逆转metformin-induced细胞浓度的方式减少大小,最大效果的化合物在20 CμM(图4 (c))。为了调查是否复合C细胞大小的影响可能与相应细胞周期的变化,细胞周期分析是细胞暴露在相同的实验条件中描述的人物4 (c)。在20μC M、复合钝化的影响二甲双胍在诱导增加G0 / G1期细胞周期(图4 (d))。
3.4。高葡萄糖的肥厚性影响与mTOR信号通路的激活有关
增加细胞大小可以与蛋白质含量增加。作为一个高glucose-induced肥大指数,在HEK293细胞总蛋白质含量测定。结果表明,高葡萄糖引起的总蛋白质合成增加25%(图文化一段两天5(一个))。这种肥厚性效应的高葡萄糖治疗降低了雷帕霉素。相比之下,二甲双胍没有产生可观测的抑制作用在高glucose-treated细胞总蛋白质合成。
(一)
(b)
(c)
雷帕霉素和二甲双胍mTOR的抑制性影响信号被测量mTOR的磷酸化水平评估和S6K Ser2448 Thr389,分别(图5 (b))。孵化HEK293细胞8毫米二甲双胍和100 nM雷帕霉素24 h减少mTOR和S6K磷酸化,S6K更为显著的影响。与雷帕霉素组合条件相比,30毫米葡萄糖预处理二甲双胍抑制mTOR有相反的影响。
为了调查是否高葡萄糖反对通过AMPK metformin-induced mTOR抑制,其激活的标志,我们测量了172年的苏氨酸磷酸化水平在两个亚型(α1,α2)的α亚基。二甲双胍激活AMPK剂量依赖性的方式。正如所料,AMPK活化导致相应减少S6K磷酸化(图5 (c))。在15 - 30毫米,葡萄糖抑制AMPK磷酸化和25毫米浓度葡萄糖治疗反对二甲双胍AMPK / S6K信号的影响。
3.5。AMPK抑制与在HEK293细胞中差别p21 Metformin-Induced对这些基因的逆转
p21的表达的上下文中研究了AMPK / mTOR S6K信号通过免疫印迹。二甲双胍治疗导致剂量依赖性降低p21的表达方式(图6(一))。磷酸化S6K的表达水平和细胞周期蛋白D1也被调查。正如所料,二甲双胍P-S6K和细胞周期蛋白D1的差别引起的对这些更明显影响浓度范围在5 - 8毫米。高葡萄糖治疗(15 - 30毫米)p21的表达增加,细胞周期蛋白D1, P-S6K和25毫米浓度二甲双胍的抑制效应减弱。类似于高葡萄糖、复合C有反对metformin-induced AMPK活化的影响,(图差别S6K去磷酸化,p21和对这些6 (b))。二甲双胍在p21表达的抑制作用也证实在HEK293细胞中稳定表达对AMPK的成分α2(图6 (c))。在AMPKα2-deficient细胞,metformin-induced AMPK活化是减少。相应地,互惠mTOR磷酸化也可以观察到的变化。二甲双胍治疗减少p21表达nonsilencing控制条件。相比之下,AMPKα2击倒条件二甲双胍在p21表达的抑制作用不明显。p21的表达可以由蛋白酶体,最近有人建议,AMPK活化可能抑制蛋白酶体的功能(46- - - - - -48]。探讨p21 proteasome-dependent,差别metformin-induced是否对这些蛋白酶体抑制剂,carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal (MG132),是用于控制和AMPKα2-deficient细胞。的差别在控制和可拆卸的细胞,对这些p21阻止了MG132治疗(图6 (d))。为了确认上述免疫印迹结果和p21获取变化信息本地化,免疫荧光显微镜进行二甲双胍和高葡萄糖HEK293细胞治疗。正如所料,二甲双胍治疗减少p21的表达和高葡萄糖(图差别p21 metformin-induced对这些治疗逆转7)。此外,高葡萄糖治疗增强p21的核上。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。抑制mTOR p21表达信号没有影响
mTOR细胞周期调控中起着重要的作用[49]。此外,雷帕霉素会使p21在小鼠成纤维细胞(50]。为了调查是否抑制mTOR p21在监管中扮演一个角色,雷帕霉素对p21表达的影响是由在HEK293细胞免疫印迹。mTOR的抑制信号通路被S6K磷酸化水平降低了。雷帕霉素没有影响p21表达(图8)。这一发现也证实了有条件地人类足细胞中被永久地传颂p21表达metformin-sensitive但rapamycin-insensitive方式(图9)。
(一)
(b)
(一)
(b)
4所示。讨论
我们发现在HEK293细胞高葡萄糖反对的负面影响二甲双胍和雷帕霉素增殖,细胞大小、广泛和蛋白质合成,参数与结构变化发展的早期DN (51]。它也被观察到高葡萄糖引起的不同影响mTOR-related表型二甲双胍和雷帕霉素。这个微分效应的高葡萄糖可能归因于抑制AMPK活化。与我们的预期相反,我们发现二甲双胍抑制p21表达浓度的方式,对mTOR信号独立的影响。高葡萄糖,AMPKα2-deficiency,复合C克服二甲双胍在p21表达的抑制作用,表明AMPK可能发挥作用在调节细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。
DN早期细胞的变化发展涉及两管和系膜增生和肥大隔间(4]。这些细胞的变化归因于细胞葡萄糖摄取增加细胞不环境免受高葡萄糖水平(52,53]。在过去几十年已投入相当大的兴趣在肾小球肥大细胞周期调节蛋白(54- - - - - -57]。这些研究表明,最初在糖尿病肾脏病理变化与低级的增殖细胞肥大紧随其后。在体外和在活的有机体内研究表明p21的缺失阻碍发展的肥大与糖尿病肾病相关(56,58]。它已经表明p21的表达(CDKN1A强劲)是诱导1型和2型糖尿病的动物(7]。根据普遍观点,p21高表达与细胞周期阻滞(59- - - - - -61年]。然而,p21作为细胞周期抑制剂的作用受到了p21的发现或许可以作为一个细胞周期蛋白的组装因素D-Cdk4复杂的形成。的细胞周期蛋白D-Cdk4复杂细胞周期进展和需要是无处不在在不同细胞类型(62年,63年]。此外,一些研究已经表明,增加细胞周期蛋白D1表达与肾和心脏肥大,这可能归因于p21[稳定的增加64年- - - - - -66年]。在这项研究中,高葡萄糖反对二甲双胍的抑制性影响细胞周期蛋白D1和p21的表达。此外,这些影响的高葡萄糖与二甲双胍治疗细胞促进细胞周期进展,表明高glucose-induced细胞周期蛋白D1和p21的表达可能与由一个共同的机制。
这项研究的结果表明,抑制AMPK可能底层机制高葡萄糖诱导p21表达,进而可能刺激细胞生长和增殖。参与调控AMPK的扩散已经在其他研究报告(26,27,67年]。形成鲜明对比α1)同种型,AMPKα2已被证明对与压力相关的条件,如低氧和葡萄糖剥夺。此外,AMPKα2基因敲除小鼠二甲双胍抗心肌肥厚的影响,减(68年]。这些发现表明,energy-depleting代理,如二甲双胍或爱卡,发挥他们的这种同种型抗心肌肥厚作用通过激活(69年]。然而,这两种药物可能有一些限制在他们的细胞行为的解释。据报道,在一次和浓度的方式,爱卡可能充当一个ATP模拟由于盒子氧的增加,其三重磷酸化形式(70年]。此外,有人建议爱卡也可能调解AMPK-independent过程通过调节AMP-sensitive酶,如糖原磷酸化酶(71年]。AMP-independent激活AMPK的二甲双胍也被报道(72年,73年]。然而,最近的一项研究表明,AICAR-induced AMPK活化会使p21表达在视网膜母细胞瘤细胞74年]。同样,尽管抑制细胞循环,爱卡治疗p21水平降低成肌细胞培养(75年]。后者研究的结果还表明,与化合物抑制AMPK C associates的逆转AICAR-induced p21的表达。我们发现复合C废除metformin-induced细胞周期阻滞符合AMPK抑制促进增殖的概念。此外,在实验研究metformin-induced细胞机制、复合C已成功用于削弱AMPK活化(76年,77年]。根据这些研究,我们的研究结果还表明,复合C反对二甲双胍对AMPK / S6K通路和p21的表达。后的研究结果表明,AMPK抑制可以促进扩散通过增加p21的表达。
二甲双胍的影响通常伴随着的AMPK激活(21]。证据表明,二甲双胍可以降低糖尿病患者罹患癌症的风险(78年]。在癌症研究中二甲双胍的抗增殖作用归因于它能够诱导细胞周期阻滞通过AMPK-dependent机制(17,27,29日]。根据建议的机制,通过激活AMPK,二甲双胍会使细胞周期蛋白D1,导致释放隔离CDK抑制剂,p21和p27。反过来p21和p27可能与E / CDK2复合物和抑制细胞循环G1 / S检查站(29日]。另一方面,在黑素瘤细胞p21表达不是metformin-induced所需细胞周期阻滞(79年]。我们的结果表明,二甲双胍和雷帕霉素抑制扩散在HEK293细胞中诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期。有趣的是,高葡萄糖预处理废除二甲双胍对细胞的抑制作用的自行车,但没有影响rapamycin-induced细胞周期抑制。此外,雷帕霉素既不增加也不减少p21表达在这个研究。这些发现表明,不需要增加p21表达细胞周期抑制二甲双胍和雷帕霉素。
细胞周期调控蛋白的参与DN一直发展的建议(5,56,80年- - - - - -82年]。这些研究表明,肾小球肥大是增加细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的结果expression-mediated细胞周期阻滞。然而,p21在发病机理中的作用更为复杂。p21的表达通常是与调节细胞周期,细胞凋亡,改善DNA损伤(83年]。与AMPK / mTOR信号通路,p21的诱导衰老标记描述了与衰老相关疾病(84年]。
越来越多的证据表明,衰老可能在DN的发展起着重要的作用。过早衰老一直在观察成纤维细胞和近端小管细胞与DN患者(85年- - - - - -87年]。Downregulation联接蛋白43,缝隙连接蛋白,据报道在糖尿病患者的足细胞在高葡萄糖治疗肾小球系膜细胞显示增加衰老标记物的表达,比如p21, p27和β牛乳糖染色(82年,88年]。联接蛋白43也被卷入肾小球肥大(89年]。此外,高葡萄糖诱导细胞周期蛋白D1的表情,有趣的是,成纤维细胞周期蛋白D1的表达式是与衰老相关的增加(90年]。糖尿病会导致血管老化,内皮细胞衰老引起的高葡萄糖或高级糖基化的终端产品(91年]。在大鼠肾近端小管细胞上的一项研究中,p21和p27的表达增加与表型相关过渡到衰老(8]。分化细胞衰老不能进步。然而,它已经表明,肾脏细胞去分化的可能贡献显著的增殖细胞(92年,93年]。反过来,肉瘤细胞对促有丝分裂的因素可以发展到衰老逮捕[59]。纤连蛋白的过度表达,细胞外基质蛋白诱导的糖尿病肾病,是衰老细胞的特征之一(94年]。此外,蛋白酶体蛋白质降解减少衰老细胞,这可能是一个因素增加肥大(95年]。
细胞凋亡的干预糖尿病肾病已经被几位调查人员表示96年- - - - - -98年]。广泛承认,除了衰老以外,受损细胞依赖细胞凋亡逃避肿瘤形成(99年]。有人建议,凋亡细胞的损失可能是一个正常组织内稳态调节的过程放大肾小球系膜细胞的人口One hundred.,101年]。荣格et al。96年)演示了使用糖尿病大鼠肾小球细胞凋亡不同可能影响小和大肾小球。他们还表明,细胞肥大负责的差异大小,纤连蛋白的表达水平,细胞外基质的标尺,是一样的在这两个小型和大型肾小球。增加proapoptotic蛋白的表达被发现在大的肾小球,表明细胞凋亡可选择性更过分生长的细胞环境中经营。有趣的是,upregulation的细胞周期蛋白D1、p21和p27只有较小的肾小球中发现,表明这些蛋白的高表达与肾小球肥大的起始。
抑制mTOR的雷帕霉素被发现,以防止永久性丧失增殖潜力,是细胞衰老的特征(102年]。因为二甲双胍抑制mTOR的信号通路,二甲双胍的类似的效果,预防衰老的雷帕霉素可以预期的转变。然而,在雷帕霉素相比,长期接触低剂量二甲双胍已被证明能够预防癌症促进衰老在其他研究40,103年]。已经提出,雷帕霉素调节扩散通过阻止细胞周期蛋白依赖性激酶复合物的形成。mTOR激活生长因子或高能级诱发p21,反过来促进这些复合物的组装104年]。在这个研究二甲双胍抑制p21在HEK293细胞和人类的足细胞,表明能源消耗可能会影响细胞周期抑制剂的表达式。决定细胞行为的潜在因素的AMPK水平可能是激活的84年,105年]。然而,一个主要限制理解AMPK在糖尿病肾脏的作用是缺乏调查AMPK的特异性差异表达研究[106年]。细胞髓质主要依靠糖酵解代谢,而管状细胞皮层取决于氧化代谢(107年,108年]。已知糖酵解通量减少细胞衰老过程中;因此可以想象,senescence-induced代谢紊乱可能对肾脏细胞群(不同影响109年,110年]。在家乡的细胞可能有一个相对较高的糖酵解通量;因此,它是可能的,在我们的实验通过增强糖酵解(高葡萄糖施加其影响111年]。
在临床前研究中,二甲双胍的剂量远高于水平的药物口服后积聚在组织报道;因此,很难推断这些研究的结果对临床可能由于微分和可怜的10月在被永久细胞系的表达21]。然而,这些研究表明,二甲双胍可能有利影响病理状态,包括癌症和炎症(17,112年,113年]。几个分子途径在这些疾病也与糖尿病肾病的病因学,这表明二甲双胍可能有潜在的预防治疗DN。事实上,通过调节促炎的表达基因,二甲双胍可以改善DN在老鼠和二甲双胍降低肾脏肥大的AMPK激活糖尿病大鼠(114年,115年]。
5。结论
总之,以上表明,二甲双胍可以降低p21的表达和AMPK可能发挥作用在底层机制。也可以从这些结果推断,不需要p21 metformin-induced细胞周期阻滞。这一发现也支持其他研究超越p21的角色作为一个细胞周期抑制剂(74年,75年]。二甲双胍治疗糖尿病和癌症的影响和p21不同,在两种疾病知之甚少的角色。最近,能量传感通道的上下文中研究了糖尿病并发症和癌症(116年- - - - - -118年]。此外,再入的分化细胞进入细胞周期,以及在p21基因遗传多态性与阿尔茨海默病(119年,120年]。我们的发现可能会促使这些领域的进一步研究。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。