化学成分和抗菌活性的测定Lavatera thuringiacal .草药物质由液态二氧化碳在亚临界条件下提取方法

文摘

本文介绍了组合的组件Lavatera thuringiacal . (锦葵科汁液。家庭)有一定的抗菌效果。Shamalgan峡谷中的植物进行了收集的山脉Trans-Ili Alatau Karasay区境内的阿拉木图地区,在开花的阶段。一个公司₂提取物的药用植物的地上部分Lavatera thuringiaca在亚临界条件下,获得了l .首次研究了它的组成成分和抗菌活性。测定提取物的化学成分是由气相色谱/质谱(GC / MS)。确定获得质谱,我们使用了威利7^th版和NIST的02数据图书馆。确定抗菌和抗真菌活性,标准测试使用的微生物菌株:金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538 - p,大肠杆菌写明ATCC 8739,铜绿假单胞菌写明ATCC 9027,白色念珠菌写明ATCC 10231,链球菌引起的肺炎写明ATCC 660,肺炎克雷伯菌写明ATCC 700603,葡萄球菌haemolyticus,葡萄球菌saprophyticus。组成的厚有限公司₂Lavatera thuringiacal .提取31组件的内容是证明:spathulenol 6.97%, pulegone 5 08%,顺式β金合欢烯7.63%,verbenone 1.93%,α没药醇氧化B 9.65%,氧化没药醇8.26%,α没药醇1.36%,亚麻酸,乙醚3.15%,叶绿醇2.49%,甲氧基香豆素5.61%,亚麻酸9.38%,亚油酸6.95%,肉豆蔻酸2.33%,反油酸2.57%。抗菌活性研究表明,有限公司₂提取的Lavatera thuringiacal对临床重要的微生物的效果显著:金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,白色念珠菌,链球菌引起的肺炎,肺炎克雷伯菌,葡萄球菌haemolyticus,葡萄球菌saprophyticus。在测试期间,连续稀释的方法证明的提取Lavatera thuringiacal具有杀菌效果金黄色葡萄球菌在浓度为0.83μ克/μl,在大肠杆菌在浓度为3.33μ克/μl,在铜绿假单胞菌在浓度为0.83μ克/μl,在链球菌引起的肺炎在浓度为1.67μ克/μl,对临床分离的葡萄球菌haemolyticus在浓度为26.65μ克/μl,在葡萄球菌saprophyticus在浓度为6.67μ克/μl,对肺炎克雷伯菌在浓度为13.36μ克/μl。试验结果表明,该提取物也具有抑菌活性测试的文化白色念珠菌在浓度为0.21μ克/μl。在测试中,阀瓣扩散法证明提取物抗菌活性和抑制增长的高值区超过15毫米。测试的区域生长迟缓的菌株分别为19.33±1.15金黄色葡萄球菌;17.33±3.21大肠杆菌;15.67±0.57铜绿假单胞菌;20.0±1.0链球菌引起的肺炎;16.0±2.64肺炎克雷伯菌;15.0±1.0葡萄球菌saprophyticus和22.0±1.73白色念珠菌。在临床分离的关系葡萄球菌haemolyticus,提取物的抑菌效果。

1。介绍

近几十年来,食用药用植物和植物产品一直在稳步增长,因为它们是绝不会低于在质量和生物活性合成药物(1]。草药制剂能够影响人体没有扰乱生理过程。通过研究和开发药物生物活性物质从各种物种的植物材料,可以扩大国内产品的植物来源的范围,满足高效和低毒草药的必要性。为了解决这个任务,需要使用我们自己的原材料、生产设备和科学和技术潜力。物种的实际利益Lavatera thuringiacal,which is a promising medicinal plant rich in biologically active substances.

属Lavateral .锦葵科的汁液。家庭是由25个物种发现主要在地中海国家。只有一个物种,Lavatera thuringiacal . (2),生长几乎在每一个哈萨克斯坦的领土的一部分。这是一个有前途的药用植物用于民间药物作为抗炎,软化剂,包络,镇静剂,止血,泻药3]。它是一种多年生草本multistemmed 25 - 200厘米高,短星状毛覆盖。茎简单或分枝在上半部分。树叶几乎是圆形,切断底部,5裂;上面的叶子3-lobed;和叶卵形或广卵形,中间一个钝角,长。大花是孤独的,敞开的花冠粉红色,倒卵形的,深受两裂片的花瓣。肾脏形的种子,暗棕色,光滑。可能的植物花朵。它生长在草原地带,草场中,休耕土地,在灌木丛林,郊外的树林,附近的道路,在低的地方附近河流和湖泊在哈萨克斯坦。 Spread area: Europe, the Mediterranean, the Balkans, the Caucasus, Central and Minor Asia, Western and Eastern Siberia, and Western China.

使用它作为纤维的生产技术设备,适合生产的细绳,绳子,以及一个观赏honey-bearing植物(4]。

由于黄酮类化合物的含量高,Lavatera thuringiacal .用于医药实践(5)作为止咳药剂(6]。下列化合物出口和鲜花的识别Lavatera thuringiacal:山柰酚3-О-β葡萄糖苷、山柰酚、槲皮素3-О-rutinoside,两个分数含有不同比例的顺式和trans-tiliroside para-coumaric酸。使用高效液相色谱方法,俄罗斯科学家已经确定的组成复杂的酚类化合物的营养器官和花的Lavatera thuringiacal .阿尔泰地区收获。根包含衍生品咖啡、绿原酸和umbelliferone;草和茎含有绿原酸的衍生物,黄酮和儿茶素组的类黄酮,和香豆素化合物;树叶含有绿原和阿魏酸和衍生品的导数的槲皮素(槲皮甙等)、山柰酚、黄酮;和包含phenologlycosides花和山柰酚和黄酮衍生品7]。这种植物具有丰富的多酚类化合物;类黄酮;明显的抗氧化剂(8];和抗炎9),抗菌10),抗菌11),细胞毒性12),和其他类型的活动。属的植物提取物Lavatera锦葵科家族的索格利特的方法,获得的浸渍、微波、超声波、亚临界水萃取用于医学治疗传染病的代理商,(13)和癌症(14),也有抗氧化、细胞毒性和抗菌活性。

因此,文献回顾表明,外国科学家进行的研究并没有提供坚实的信息存在的萜烯决定植物的成分和提取得到的物种Lavatera thuringiacal公司的₂提取方法对提高植物生物活性化合物的提取和选择性(15)是不可或缺的方法检测萜烯类。

早些时候,外国科学家(12)获得提取从药用植物的植物性原料Lavatera thuringiacal·索格利特法、浸渍、微波、超声波、亚临界水萃取。在确定这些提取获得的组件组成,萜烯类的不确定。类黄酮并不确定的化学成分Lavatera thuringiacal .提取,高效液相色谱法。的定量分析进行了GC / MS方法显示了类黄酮的内容消极的结果。在这项研究中,提取厚厚的有限公司₂在亚临界条件下获得了地上部分的吗Lavatera thuringiacal;而且,组件组成进行了研究,确定了31个化合物和萜烯最后,针对病原菌抗菌活性。

2。材料和方法

2.1。植物材料

植物地上部分的材料Lavatera thuringiacal在其开花阶段收集的Shamalgan峡谷Zailiyskiy Alatau岭Karasay区境内的阿拉木图地区2018年6月。增长的地方的坐标和收集的原料研究测定使用GPS导航器(点1:N 43°12′27.34”, 55.36 E 76°33′”,点2:43°N 10′36.06”, 0.45 E′76°31日”,点3:43°N 11′21.12”, 37.17 E 76°30′”)。

收集到的蔬菜植物材料干+ 25±5°C的温度自然在树荫下,在通风良好的地方。植物性原料的水分含量不超过10%。干植物被KDU-2破碎机和存储的温度+ 15°C到25°C,湿度不超过65%的纸袋。

研究所的植物样本识别植物学和Phyto-Introduction(阿拉木图)(注册号参考01-08/273)。

2.2。制备二氧化碳提取

干地面的一部分Lavatera thuringiaca L收获的。2018年6月,被用作药用植物原料生产的二氧化碳提取。提取得到的生产基地生产药品Zhanafarm有限责任的伙伴关系”。“亚临界条件下提取收到5 l实验室机器有限公司₂依照公司的8050不锈钢材料提取- 85标准。液态二氧化碳作为萃取剂。为获得公司最佳条件₂提取是维护:51 - 65个大气压的压力,温度18-27°C,和提取时间7 - 11小时。

增加的具体接触表面与液体提取原料有限公司₂KDU-2破碎机,草了。植物性原料的颗粒大小是1 - 3毫米。获得一个厚厚的二氧化碳提取的Lavatera thuringiacal .草2000 g的原材料,从中提取得到的25克;也就是说,收益率是1.25%。

2.2.1。提取过程

粉碎植物材料加载到一个UUPE-5L器(实验室二氧化碳流提取机)。进行了提取与二氧化碳条件下指定这个过程。液化二氧化碳时发表的储罐使用高压泵6 MPa的压力进入排气槽。器,流物质溶解的二氧化碳是美联储收藏家,在分离的过程中溶剂和溶质进行连续减压。提取存入收藏家然后排放作为成品。

2.3。确定组件组成的提取

气相色谱与质谱检测(安捷伦7890 a / 5975 c)是用于二氧化碳提取的定性和定量分析Lavatera thuringiacal .色谱分析条件如下:−1.0的样本容量μl,进样温度−240°С,分工和流程1:10。分离进行了使用一个30米高的长WAXetr色谱毛细管柱,内直径0.25毫米,膜厚度为0.25μm以恒定气体运输船(氦)1毫升/分钟的速度。色谱的温度是编程从40°C(0分钟曝光)到260°C的升温速率10°C /分钟(20分钟曝光)。检测进行扫描米/z34 - 850模式。安捷伦MSD ChemStation软件(版本1701 ea)是用来控制气相色谱系统,注册结果,和处理数据。数据处理包括保留时间的确定、峰值区域,和验证的光谱与质谱检测器获得的信息。

2.3.1。组件的识别提取的成分

确定获得质谱,我们使用了威利7^th版和NIST′02数据库。组件被质谱鉴定和保留时间。

2.3.2。定量测定

定量测定的萜烯的有限公司₂提取,气相色谱与质谱检测方法(安捷伦7890 a / 5975 c)是使用。成分的百分比计算自动的基于峰值区域总离子色谱图。

的内容和萜烯的提取应该是至少50.0%。

2.4。抗菌活性测定

确定抗菌活性、标准测试使用的微生物菌株:铜绿假单胞菌写明ATCC 9027,白色念珠菌写明ATCC 10231,大肠杆菌写明ATCC 8739,链球菌引起的肺炎写明ATCC 660,肺炎克雷伯菌写明ATCC 700603年,从美国获得类型文化集合(写明ATCC、美国),和金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538 - p,葡萄球菌haemolyticus,葡萄球菌saprophyticus,来自共和党的微生物(Nur-Sultan,哈萨克斯坦)。

研究微生物的敏感性进行了标准营养媒体:(我)Mueller-Hinton介质:Mueller-Hinton琼脂(M173) HiMedia,印度(2)HiMedia Mueller-Hinton肉汤(M391),印度(3)HiMedia Sabouraud液体介质(M033),印度

的二氧化碳提取的抗菌活性Lavatera thuringiacal是由两个方法:连续稀释法和disk-diffusion方法。

2.4.1。提取物的抗菌活性的定义连续稀释法

确定抗菌活性,使用96孔板。在所有的井,除了第一个,这是需要添加Mueller-Hinton营养肉汤(M391)(用于测试细菌)和Sabouraud肉汤(用于测试真菌),在100年的数量μl(从1^圣到12^th威尔斯)。提取初步溶解在0.5毫升的0.9%氯化钠溶液和介绍了在100年的体积μl到1^圣好,连续稀释的混合物(Mueller-Hinton肉汤/ Sabouraud-dextrose肉汤(100μl) +试验药物(100μ从1 l))^圣在100制程到2的数量^nd嗯,已经包含100制程的肉汤。测试样品完全混合,然后100年μl是转入的肉汤2^nd到3^{理查德·道金斯}嗯,最初也含有100μl的肉汤。这个过程被重复,直到所需数量的稀释。50μl的混合物被撤过去。因此,稀释后得到:1:1,1:2;1:4,1:8、1:16日,1:32岁,1:64年,1:128年,1:256年,1:512年,1:1024,对应油井从1到11。12个^th测试压力的控制。

一系列稀释后,20μl测试菌株微生物浓度为1.5×10⁶CFU / ml被添加到所有井(图1)。

所有的样品都孵化18 - 24小时37±1°C。孵化期后,样本在培养皿上镀Mueller-Hinton营养培养基来确定活细胞。结果考虑的可见表面的微生物生长密集的营养培养基。

最低杀菌浓度(MBC)被认为是最低浓度在试管中,抑制微生物的生长。表1根据稀释显示培养皿的标签。

2.4.2。Disk-Diffusion抗菌活性的测定方法

disk-diffusion方法应用光盘是由处理制备使用无菌培养皿上钳15 - 20毫米的距离从盘子边缘和对方。试验菌株的培养皿是preinoculated悬浮密度为1.5×10⁸CFU /毫升。接种、无菌棉签都沉浸在暂停,然后稍微压在试管墙壁和条纹在三个方向,将杯子60°。Сartridges用现成的无菌盘(HiMedia)被用于这项研究。磁盘初步饱和与提取大约30分钟的曝光时间内。

接种后,菜被放置在一个恒温器孵化的细菌18 - 24小时37°C。阀瓣扩散法的结果考虑通过计算区域缺陷直径/抑制增长1毫米的精度(药敏测试的性能标准,2015;指导方针,确定微生物的抗菌药物的敏感性,2004;参考方法肉汤稀释酵母的抗真菌敏感性测试,2017)16- - - - - -18]。

3所示。结果与讨论

3.1。确定组件组成的有限公司₂提取

提取获得,我们分析了提取子任务和超临界条件下二氧化碳的能力和各种物理参数。结果如表所示2。

研究表明,所有5个二氧化碳提取获得Lavatera thuringiacal在亚临界条件下,根据输出数据参数、化学成分和工艺参数,提取第一是最优的。因此,当获得一个从草中提取Lavatera thuringiacal .发现在亚临界条件下提取的收益率明显高于其他生产方法(超临界CO₂提取)。相比之下,我们在超临界条件下提取获得的一个示例。

图2和表3显示的结果厚的化学成分的研究从药用植物原料中提取得到Lavatera thuringiacal . 31个化合物的内容由色谱-光谱法决定。我们研究了这些化合物的药理作用分析外国科学家的作品。

单萜:isopulegone 0.7%, pulegone 5.08%, verbenone 1.93%;二萜:植醇2.49%;倍半萜烯:没药醇氧化为8.26%,α没药醇氧化B 9.65%,γ-muurolene 0.75%, spathulenol 6.97%,顺式β金合欢烯7.63%,alloaromadendrene 0.4%;脂肪酸:亚麻酸9.38%,亚油酸6.95%,反油酸2.57%,1.14%硬脂酸,肉豆蔻酸2.33%,棕榈酸,和乙酯2.72%;和香豆素类:甲氧基香豆素或7-methoxycoumarin 5.61%被发现的主要类化合物有限公司₂提取的Lavatera thuringiacal

3.2。的抗菌活性测定结果有限公司₂提取

在公司抗菌活性进行了研究₂提取的Lavatera thuringiacal .主要活性成分的提取Lavatera thuringiacal .如下:化合物的萜烯53.3%,脂肪酸28.55%,香豆素类5.61%,所谓的抗菌效果。

当研究连续稀释法抗菌活性,抗菌和抑菌效果的有限公司₂提取的Lavatera thuringiacal .成立于关系分析微生物菌株金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538 - p,大肠杆菌写明ATCC 8739,铜绿假单胞菌写明ATCC 9027,白色念珠菌写明ATCC 10231,链球菌引起的肺炎写明ATCC 660,肺炎克雷伯菌写明ATCC 700603,葡萄球菌haemolyticus,葡萄球菌saprophyticus(表4)。

抗菌活性的研究结果连续稀释显示有限公司₂提取的Lavatera thuringiacal .最大的杀菌和抑菌效果白色念珠菌在0.21微克/毫升的浓度;铜绿假单胞菌在浓度为0.83μ克/μl;金黄色葡萄球菌在浓度为0.83μ克/μl;链球菌引起的肺炎在浓度为1.67μ克/μl;大肠杆菌在浓度为3.33μ克/μl;葡萄球菌saprophyticus在浓度为6.67μ克/μl和3.33μ克/μl;肺炎克雷伯菌在浓度为13.36μ克/μl和6.67μ克/μl;和葡萄球菌haemolyticus在浓度为26.65μ克/μl和13.36μ克/μl

抗菌活性的研究有限公司₂提取的Lavatera thuringiacal是由连续稀释的方法和建立的提取物的抗菌活性是disk-diffusion方法(表5)。

disk-diffusion方法的测试显示,提取了抗菌活性与生长抑制的高值区超过15毫米。测试菌株的生长抑制区分别为19.33±1.15taphylococcus球菌写明ATCC 6538 - p。,17.33±3.21against大肠杆菌写明ATCC 8739, 15.67±0.57铜绿假单胞菌写明ATCC 9027, 20.0±1.0链球菌引起的肺炎写明ATCC 660, 16.0±2.64肺炎克雷伯菌写明ATCC 700603和15.0±1.0葡萄球菌saprophyticus。同时,这种提取对临床分离的抑菌作用葡萄球菌haemolyticus和真菌的活动白色念珠菌写明ATCC 10231生长阻滞区为22.0±1.73。解释数据时,它是有条件的假定的直径生长阻滞区超过15毫米证明高抗菌活性;10 - 15毫米,平均抗菌活性;,不到10毫米,低抗菌活性(60]。

获得的提取物的抗菌活性与其他提取获得的塞尔维亚科学家Pavle z Mašković等等。五种不同的萃取方法被用来获得提取:索格利特、浸渍、超声波、微波、亚临界水提取。这些提取的组件构成是由HPLC-DAD方法。这些提取物的抗菌活性进行了测试在体外对革兰氏阳性细菌:saprophyticus葡萄球菌、金黄色葡萄球菌,李斯特菌ivanovii,李斯特菌inocun,粪肠球菌,单核细胞增多性李斯特氏菌,芽孢杆菌spizizenii,肠球菌都有效以及以下革兰氏阴性菌:大肠杆菌,肠炎沙门氏菌,肠杆菌属aerogenes,枸橼酸杆菌属freundii,鼠伤寒沙门氏菌,铜绿假单胞菌,变形杆菌。根据这些研究的结果,提取的最高的活动获得的亚临界水萃取观察葡萄球菌saprophyticus(浓度为7.81μ克/μl)。超声波提取有强烈的影响鼠伤寒沙门氏菌(在7.81同心μ克/μl)。浸渍提取有强烈的影响肠杆菌属aerogenes(浓度为15.82μ克/μl),变形杆菌(浓度为7.81μ克/μl,葡萄球菌saprophyticus(浓度为15.82μ克/μl)。索氏提取已被证明是非常有效的肠炎沙门氏菌。

比较分析我们的数据与塞尔维亚科学家获得的数据显示了以下结果:提取获得的塞尔维亚科学家通过超声波提取显示了一个高杀菌能力金黄色葡萄球菌在浓度为31.25μ克/μl;提取得到的塞尔维亚科学家使用微波和亚临界水萃取方法显示杀菌活动金黄色葡萄球菌在浓度为62.50μ克/μl,提取得到的有限公司₂在亚临界条件下萃取,杀菌活性金黄色葡萄球菌被证明在一个集中的0.83μ克/μl;提取了塞尔维亚的科学家通过超声波提取行为铜绿假单胞菌在浓度为15.82μ克/μl;提取得到的塞尔维亚科学家使用微波和亚临界水萃取方法的行为铜绿假单胞菌在浓度为62.50μ克/μl;在提取获得的有限公司₂在亚临界条件下萃取,杀菌活性铜绿假单胞菌浓度为0.83吗μ克/μl;提取得到的塞尔维亚科学家利用超声波提取和浸渍方法作用于大肠杆菌在浓度为62.50μ克/μl;在提取获得的有限公司₂在亚临界条件下萃取,杀菌活性大肠杆菌浓度为3.33吗μ克/μl。根据提交的数据,提取得到的有限公司₂在亚临界条件下提取的抗菌活性高于提取获得的塞尔维亚科学家使用以下方法:超声波,亚临界水,微波,浸渍提取(表6)。

4所示。结论

最优条件有限公司₂二氧化碳萃取的提取Lavatera thuringiacal .药用植物原料开发。最终的成品的产量是25克(1.25%)。这种方法提高了成品的质量。研究亚临界有限公司₂提取表明它们不包含镇流器物质和有机溶剂残留。它们含有天然生物活性物质不暴露于温度和化学的影响,以及有抗菌活性。

研究的植物化学的成分Lavatera thuringiacal .药用植物材料,厚提取得到的有限公司₂提取方法和化学成分是由气相色谱与质谱检测器。因此,大量的萜烯,香豆素类,多不饱和脂肪酸在亚临界检测有限公司₂提取。31日组件组的单萜、二萜、倍半萜烯,脂肪酸,并从原材料的香豆素类Lavatera thuringiacal .被确定。

有限公司的抗菌活性₂提取的Lavatera thuringiacal在亚临界条件下获得的决心。的测试样本Lavatera thuringiacal .提取物具有抗菌活性金黄色葡萄球菌写明ATCC 6538 -р大肠杆菌写明ATCC 8739,铜绿假单胞菌写明ATCC 9027,链球菌引起的肺炎写明ATCC 660,葡萄球菌haemolyticus,葡萄球菌saprophyticus,肺炎克雷伯菌写明ATCC 700603系列稀释的肉汤和琼脂扩散试验,形成了区域测试菌株的生长抑制。这个示例还展示对真菌的活动白色念珠菌写明ATCC 10231测试文化系列稀释和琼脂扩散。

的Lavatera thuringiacal .提取有效作用于测试菌株(博物馆和临床)。实验结果表明,提取的Lavatera thuringiacal,when tested by the serial dilutions method, has a bactericidal effect at the following dilutions: on金黄色葡萄球菌在浓度为0.83μ克/μl,在大肠杆菌在浓度为3.33μ克/μl,在铜绿假单胞菌在浓度为0.83μ克/μl,在链球菌引起的肺炎在浓度为1.67μ克/μl,对临床分离的葡萄球菌haemolyticus在浓度为26.65μ克/μl,葡萄球菌saprophyticus在浓度为6.67μ克/μl,肺炎克雷伯菌在浓度为13.36μ克/μl。从测试获得的数据测定真菌的活动表明,该提取物对测试的文化活动白色念珠菌在浓度为0.21μ克/μl。此外,当disk-diffusion测试的方法时,也发现提取的抗菌活性抑制增长的高值区超过15毫米。测试菌株的生长抑制区分别为19.33±1.15taphylococcus aureu年代,17.33±3.21大肠杆菌,15.67±0.57铜绿假单胞菌,20.0±1.0链球菌引起的肺炎,16.0±2.64肺炎克雷伯菌,15.0±1.0葡萄球菌saprophyticus和22.0±1.73白色念珠菌。同时,这种提取对临床分离的抑菌作用葡萄球菌haemolyticus。

测试样本的结果表明的进一步研究的前景锦葵thuringiaca(Lavatera thuringiacal .)医疗实践。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果可按照客户要求定制。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

作者要感谢教师,以及博士学位的博士生学院药学和制药技术,在这工作的支持。

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