文摘

背景。羊膜移植可以作为冻干保存羊膜膜(FD-AM)和羊膜海绵。保存移植需要被γ辐射消毒。然而,此过程的每一步都可能影响其生物学特性。尽管如此,只有少数研究报告的保存方法和γ辐照的影响在保存羊膜移植生长因子水平。方法。这是一个在体外实验研究与pretest-posttest集团设计使用一个连续抽样技术在一批羊膜捐助者在特定时间。羊膜是海绵制成FD-AM和羊膜准备,他们与γ辐照消毒(15 kGy的25 kGy的)。未照射标本作为控制和20毫克的每个标本粉使用ELISA对生长因子水平。结果。有显著减少羊膜海绵FD-AM相比,无论是在转化生长因子β(TGF -β)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF)水平和preirradiated和25 kGy的postirradiated制剂( )。生长因子水平preirradiated和postirradiated FD-AM (kGy的15和25 kGy的)显示显著差异( )。同样,preirradiated羊膜海绵组织的生长因子水平与postirradiated羊膜海绵组也明显下降( )。结论。TGF -β和bFGF水平低比FD-AM羊膜海绵。FD-AM和羊膜海绵制剂的生长因子γ辐照灭菌后水平相对较低。虽然生长因子水平显著下降,生长因子水平的数量仍然是满足组织愈合。

1。介绍

羊膜膜是一种生物材料,是众所周知的,近几十年来用于各种临床应用。羊膜膜来源于胎盘,胎儿组件的一个胚胎外的组织,它由(绒毛膜板)和孕产妇组件(蜕膜)1]。羊膜膜有特定的属性,包括抗炎、抗菌、抗病毒、antifibrotic antiscarring属性和非常高的抗拉强度2,3]。它还可以减少刷组织的发生,保护伤口,减少疼痛,增加基底上皮细胞的粘附,促进细胞分化,促进组织愈合,使它适合组织愈合(3]。

体外研究已经证实羊膜膜产生生长因子,促进血管生成,组织愈合和免疫调节4]。用ELISA检测,揭示人类羊膜膜有七个生长因子:bFGF, TGF -αTGF -β1,-β2,EGF, KGF和HGF [5]。在伤口愈合,碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)负责肉芽组织形成,组织愈合和组织重构(6),而TGF -β抑制ECM(细胞外基质)退化,增加胶原蛋白生产(7]。

有一些方法可以保存羊膜膜;冻干法和冷冻干燥法是最常用的方法之一3]。冻干膜羊膜能保持羊膜膜生存很长一段时间不需要−80°C的冷藏器存储(2]。羊膜膜保护的另一种方法是通过把它转为一个羊膜海绵。羊膜海绵是羊膜膜切碎的大小约为250μ米,与粘合剂混合材料,和冻干1]。凝胶状的形式,羊膜海绵比冻干无疑更容易应用羊膜膜(FD-AM),进来一个片状的形式。羊膜海绵是一种生物材料,可以很容易地获得负担得起的,很容易适用于作为替代材料在加速伤口愈合的过程1]。

灭菌技术是整个系列的组成部分的过程来做生物材料准备(3]。消毒是必要的,以防止病原体的传播或污染。另一方面,选择灭菌过程必须保持生物材料制备的生物潜能。几种方法已经制定消毒生物材料,即使用热、化学和电子辐射或伽马射线灭菌(3]。杀菌技术经常用于羊膜膜灭菌的细胞和组织银行Soetomo博士一般学术医院是25 kGy的γ辐照(8]。

辐射灭菌的常用方法是利用伽马射线从Co-60因为它是实用、可靠,可以预见,渗透性高,所以组织可以消毒,即使最后的包装3,9]。如上所述在ISO 11137 (10),灭菌的医疗设备可以进行剂量的15 kGy的25 kGy的,根据产品的最初的微生物污染水平,产品的微生物数量的内容(3]。实际上,每个组织的辐射剂量用法不同。大多数组织银行亚太地区已经使用一剂25 kGy的辐射灭菌。直到最近,他们已经要求不同剂量因为25 kGy的可以移植(产生负面影响11]。大多数银行辐射灭菌剂量使用25 kGy的作为参考。另一方面,有些人选择更高的剂量,确保产品的不育,有些选择低剂量保持组织的生物力学特性。不幸的是,在高剂量辐射灭菌的使用也许会引起化学和物理变化,可以改变产品的生物属性(12]。相信最初的微生物污染水平越低,剂量越小的灭菌,因此,生物损害越小(13]。

我们所知,只有少数研究报告辐射灭菌的效果在羊膜移植生长因子水平。也有小的数据根据其保存羊膜移植的生长因子水平的方法。因此,在这项研究中,我们的目标是确定γ辐照灭菌剂量对生长因子水平的影响不同羊膜膜之间的保护方法,是冻干膜羊膜(FD-AM)和羊膜海绵,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。

2。材料和方法

本研究是一个在体外试验研究使用pretest-posttest组设计。连续取样技术用于本研究抽样批羊膜捐助者,包括8个病人,在特定时间满足选择条件。本研究在细胞和组织中执行银行泗水Soetomo一般学术医院博士和巴丹(印度尼西亚国家核能机构),雅加达,从6月到2019年12月。

在这项研究中使用的材料从捐助者八羊膜膜符合资格的标准。每个胎盘被划分为六个标本;三个标本进行冻干膜羊膜(FD-AM)和另外三个羊膜海绵的准备工作。根据其保护方法,不同γ辐射剂量(15 kGy的25 kGy的)将给每一个标本。剩余的标本没有辐照作为一个控制。多达20毫克的每个标本被收集和粉的形式羊膜粉,用于评估使用ELISA生长因子水平。

2.1。使冻干膜羊膜(FD-AM)和羊膜海绵的准备工作

新鲜的胎盘羊膜是收获的捐助者18-42岁老他们自愿捐献胎盘,并书面同意。捐助者进行评估和确认免费药物滥用,人类免疫缺陷病毒(HIV),乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和梅毒。Meconium-contaminated胎盘,胎盘从妊娠并发症患者排除在本研究之外。

胎盘是无菌收集从手术室剖腹产或产房在正常劳动。下一步是评估胎盘变色,碎片或其他污染物的存在,气味的变化,和其他损害的迹象。如果一个胎盘是处于良好状态,继续羊膜和绒毛膜分离的过程。分离后,羊膜与生理盐水清洗(0.9%氯化钠)清除血栓,粘液和碎片。当时沉浸在0.9%氯化钠溶液的无菌容器中,密封,贴上标签,准备送到细胞和组织银行Soetomo博士一般学术医院内部的温度冷却箱−4°C。

新鲜羊膜膜到达组织银行的人都有各种各样的容器条件下,不育和行政文件的完整性。然后他们被放在隔离柜−20°C,直到进一步的处理。

羊膜膜加工使用消毒工具均在一个洁净室用无菌布在桌子上。从无菌容器和羊膜膜被转移到容器装满在室温下0.9%氯化钠。羊膜膜后在室温下,大约10分钟后,他们搬到处理处理托盘羊膜移植。首先,羊膜膜被浸泡在0.05% NaOCl消毒溶液10分钟,然后放入水浴瓶(优莱博SW23)充满0.9%氯化钠的室温。0.9%的氯化钠需要改变每15分钟十倍。之后,洗膜羊膜伸出,安装在一个无菌纱布浆膜面面临着纱布。

使冻干膜羊膜(FD-AM),膜羊膜然后深冻−80°C的温度至少24小时。下一步将是冻干法(Lyophizer Lyovoc GT2)羊膜的膜的温度40°C到−−50°C进行了6 - 8小时,直到羊膜膜水含量为6 - 7%。的膜羊膜冻干被削减到所需的大小和三层聚乙烯塑料密封真空封口机。这个过程是在一个层流气流内阁。

至于准备羊膜海绵准备,相同的步骤也应用从胎盘组织收集、羊膜膜消毒NaOCl 0.05%解决方案,并与0.9%生理盐水洗膜羊膜直到将伸长的羊膜上消毒纱布。羊膜海绵的区别是在这些步骤;羊膜是碎成小块,与生理盐水,比例为1:1,直到所需的结构。混合物被塑造为羊膜海绵准备和存储在冰箱−80°C在冻干前至少24小时,因此,用三层聚乙烯塑料包装。

2.2。灭菌

在三层聚乙烯塑料真空包装后,冻干羊膜膜(FD-AM)和羊膜海绵准备接受绝育手术。灭菌是由FD-AM和羊膜海绵准备在最后包装,用15 kGy的辐射和25 kGy的伽马射线(Co-60)辐照(木村,化工厂有限公司,大阪,日本)。执行这个过程在巴丹(印度尼西亚国家核能机构),雅加达。

2.3。测试生长因子水平

多达20毫克的每个preirradiated辐照FD-AM和羊膜海绵准备收集粉检查生长因子水平。FD-AM粉和羊膜海绵在1毫升的0.9%生理盐水溶解,然后与超声发生器均质水浴(埃尔玛1040 H) 10分钟。此外,进行了离心5分钟每分钟1500转。当时产生的上层清液离心收集测量bFGF和TGF -的水平β使用ELISA方法(酶联免疫试剂盒BTLab人类bFGF) (14]。

2.4。数据分析

使用成对获得的数据进行了分析t以及评估生长因子的水平辐射前后(15 kGy的和25 kGy的辐照)和一个独立的t以及比较TGF -β和bFGF水平之间的冻干膜羊膜(FD-AM)和羊膜海绵组织正态分布数据。

3所示。结果

本研究进行了实验使用pretest-posttest组设计。我们已经进行了初步测量(预备考试),其次是治疗和最终的测量(期末测验)两组。我们的研究评估的影响伽马射线辐照和TGF -保存方法β和bFGF在羊膜移植,即冻干膜羊膜(FD-AM)和羊膜海绵。FD-AM和羊膜海绵准备中可以看到数据1和2在下面。

最初的程序是由测量TGF -β和bFGF水平preirradiated FD-AM TGF -和比较它们β和bFGF水平的羊膜膜进一步加工成羊膜海绵。FD-AM和羊膜海绵进行辐射灭菌后15 kGy的25 kGy的剂量的射线,TGF -我们评估准备β和bFGF。我们比较他们preirradiated生长因子水平。我们预期减少生长因子水平都在被加工成一个羊膜海绵和给定γ射线辐射后因为那些治疗可能导致分裂的生长因子的氨基酸组成。

《独立报》t以及由于TGF -β和bFGF水平明显下降的羊膜海绵FD-AM相比,preirradiated和25 kGy的postirradiated准备。TGF -β和bFGF水平preirradiated和postirradiated冻干膜羊膜(FD-AM)较羊膜海绵如表所示1。

paired-sample的结果t以及的TGF -β水平preirradiated羊膜海绵组织较postirradiated羊膜海绵组织,kGy的15和25 kGy的明显下降( )(表2)。另一方面,没有TGF -一个重要的区别β水平比较preirradiated和postirradiated FD-AM 15 kGy的和25 kGy的照射( )(表3)。我们也计算了TGF -减少百分比β水平的25 kGy的postirradiated FD-AM preirradiated标本的标本,以及羊膜海绵。的平均百分比减少TGF -β在FD-AM水平为82.35±7.58%,在羊膜海绵(表73.89±2.61%4)。

的paired-samplet以及结果bFGF的水平preirradiated冻干膜羊膜(FD-AM)相比15 kGy的25 kGy的postirradiated FD-AM显示显著差异( 和 ,)(表5)。同样,差异也显著preirradiated bFGF水平比较,postirradiated羊膜海绵准备,15 kGy的和25 kGy的( )(表6)。bFGF水平的平均百分比减少25 kGy的postirradiated FD-AM preirradiated标本的标本是30.57±10.33%。bFGF水平辐射灭菌前后的结果,以及百分比减少FD-AM和羊膜海绵组织,可以看到在桌子上7。

TGF -没有明显差异β和bFGF水平的平均百分比减少FD-AM和羊膜海绵( 分别为和0 = 0.662)的独立t以及结果(表8)。

4所示。讨论

4.1。保存方法

羊膜膜含有胶原蛋白矩阵和各种生长因子等主要生物活性分子。我们都知道,羊膜膜的生长因子水平变化的个体之间,可以影响他们的生物效应(15]。目前,有大量的羊膜膜保护方法,即在用电吹风,冷冻干燥,甘油保存16]。这些过程允许生物学性质的变化,影响生长因子水平在羊膜膜的最终形式。

TGF -的结果β冻干膜羊膜和bFGF水平(FD-AM)准备与羊膜海绵制剂在这项研究显示,在统计上有显著差异,含量较低的羊膜海绵制剂( )。这可能是由于这样的事实:羊膜海绵接受了一个不同的步骤,它是碎和地面有0.9%氯化钠来创建一个不同的纹理,而FD-AM没有经过切碎的状态。应当认为实际的TGF -β和bFGF水平以来,这项研究的结果高于FD-AM和羊膜海绵需要粉使用ELISA技术评估生长因子水平。

羊膜膜经过不同阶段的处理、存储和被用作羊膜移植前准备。这其中每个阶段都可能影响羊膜移植的生长因子水平(17]。之前的研究表明,如冷冻干燥保存和辐射灭菌方法显著影响羊膜移植组织学和生物物理属性(12]。

根据Ihsan [18),降低冻干膜羊膜EGF水平发生由于几件事情,如冻结期间受伤,冷冻干燥,包装,和辐射。他解释说,新鲜和冻干膜羊膜的EGF水平低于其他研究者的研究结果。它可以发生由于不同的提取过程和ELISA试验使用。EGF水平下降在这项研究可能发生由于在制造过程的几个阶段冻干膜羊膜。一些组织损伤可能发生在样品的冷冻,冷冻干燥的过程中,和辐射(18]。

下一步是冷冻干燥过程;干燥组织是直接从冰阶段执行而无需通过液相以防止组织自溶。在冷冻干燥温度的变化被认为是导致样品损失。处理的最后阶段冻干羊膜膜辐射灭菌。辐射与物质的交互发生在两个方面,即由于电离辐射本身直接和间接的方式通过自由基的形成。辐射过程是在低温下进行,无水,无氧(真空),以防止氧自由基的影响辐射(18]。

羊膜膜冻结目标准备冻干过程和减少组织抗原性质。冻结在−80°C会导致冷冻损伤形式的微小的冰晶或细胞内液的浓度和成分的变化。它会破坏细胞的扩散和渗透过程造成细胞损伤。此外,冻结也会引起蛋白质的压力,从而导致蛋白质变性。冻结过程的时间越长,越冰晶形成,细胞损伤更严重。在这项研究中,羊膜的冻结膜24-36小时(18]。另一方面,碎的羊膜海绵是一个羊膜膜大小约250μ米混合着一种胶粘剂材料和加工的冷冻干燥方法在室温下(19]。本研究预期显著减少羊膜海绵生长因子水平相比,冻干羊膜膜由于羊膜膜需要被地面处理为一个羊膜海绵。

Russo等人使用“羊膜膜粉”制造阶段,类似于本研究[17]。的preirradiation bFGF水平获得研究中分别为21.72±5.33 pg为每克新鲜羊膜膜使用,而TGF -β1 5.37±0.93 pg / g (17]。很难比较Russo et al。直接与本研究的研究结果,因为他们参考羊膜作为比较湿重。因此,所使用的单位是不同的。在这项研究中,每个羊膜膜捐赠者的生长因子水平变化(17]。吴等人提取从五个新鲜羊膜膜没有冻干法和γ射线灭菌的研究水平和获得更高的bFGF 646.4 pg / ml (172 - 1913 pg / ml) [20.]。然而,TGF -β研究水平是低得多;TGF -之一β亚型,即TGF -β1、只有346 pg / ml (257 - 468 pg / ml) [14]。它类似于Lopez-Valladares等人的研究表明总蛋白质含量。bFGF, HGF, KGF TGF -β1每个羊膜示例不同,与胎龄和供体的年龄21]。

冻干羊膜膜可以存储和保持稳定在不同储存条件没有失去其临床作用。根据使用和储存,冷冻保存羊膜膜可以使用一年之后,虽然冻干和辐照羊膜膜可以持续数年22]。冷冻干燥方法把水从羊膜膜通过升华,从而抑制化学反应可能导致组织破坏(23]。有怀疑的递减生长因子水平保存和辐照羊膜膜会使伤口愈合无效。然而,一项研究[24)发现了一个微不足道的区别冷冻保存羊膜膜和冻干膜羊膜在角膜表面重建。此外,以前的文献报道,在动物模型研究中,冻干羊膜膜一样的nonlyophilized羊膜膜作为重建角膜的生物材料使用时(2]。这些结果证明了生长因子水平降低冻干膜羊膜仍可接受的临床使用。

4.2。灭菌方法

灭菌是一个重要的过程在生物材料,但大多数杀菌技术可以影响产品的生物属性。然而,使用伽马射线辐射灭菌是冷杀菌。建议用于生物组织由于其灭活微生物的能力没有显著升高的温度辐射材料。此外,γ辐照也有高穿透性,以便组织可以消毒后即使是散装最后包装(9]。

如上所述11137年ISO(国际标准化组织),灭菌的医疗设备可以进行剂量的kGy的15或25 kGy的根据其微生物污染水平(10]。人们认为初始数量的微生物污染水平越低,剂量越小的灭菌和较小的生物造成损害(13]。它需要考虑选择辐射灭菌剂量必须足够可靠有效的摧毁微生物,造成尽可能最小的损害(3]。

本研究显示TGF -一个重要的区别β和bFGF preirradiated和postirradiated产品,在冻干膜羊膜(FD-AM)和羊膜海绵。通过计算TGF -β和bFGF水平的减少都准备,最百分比减少被发现的TGF -β水平25 kGy的postirradiated冻干膜羊膜(FD-AM)和82.35±7.58%的数量。最轻微的百分比减少在bFGF的水平25 kGy的postirradiated冻干膜羊膜(FD-AM),下降到30.57±10.33% preirradiated准备。

γ辐照与Co-60贪污灭菌可能会影响组织的生物力学属性剂量依赖性的方式。不幸的是,组织银行必须确保移植辐照的剂量足够高的无菌保证水平(SAL) 10⁻⁶同时保留其功能作为体内生物材料(25]。辐射灭菌可引起生长因子的退化过程中扮演一个角色osteoinduction(骨形态形成蛋白和TGF -β)[26]。哥等人在2006年进行的一项研究发现,bFGF的postirradiated羊膜膜粉为425.7±153.9 pg / ml,虽然水平约500 pg / ml或0.5 ng / ml需要刺激endotenon和epitenon扩散27]。bFGF在我们的研究中发现的最小的数量是15.50 ng / mL的25 kGy的postirradiated羊膜海绵。从以前的文学,它是证明,尽管贪污被保存羊膜海绵和25 kGy的照射,还适合endotenon和epitenon扩散27]。

Russo等人的水平测量上皮生长因子(EGF)的25 kGy的辐射羊膜preirradiated从两个捐助者和postirradiated膜粉17]。这两个样品进行检测后,发现EGF浓度postirradiated羊膜膜仅略下降到98.72±0.67% preirradiated水平(17]。Skopiński等人表明,羊膜膜处理伽马消毒35 kGy的有不同的剂量效应的未照射羊膜膜内皮细胞培养(28]。Russo等人测量上皮生长因子(EGF)水平25 kGy的γ辐照前后羊膜膜粉从两个捐助者(17]。考试的两个样品,发现辐照后EGF浓度仅略有下降到98.72±0.67% preirradiation水平(17]。

在特定剂量电离辐射可以破坏细胞结构。另一方面,细胞有一个复杂的修复系统来保护自己免受辐射伤害。这个系统的效率,特别是细胞的生存,取决于基因编码的DNA序列。因此,基因和基因产物的状态活动依赖的DNA序列的完整性(29日,30.]。辐射会导致交联反应和蛋白质碎片,聚合和氧化(24]。内皮细胞凋亡的死亡或有丝分裂死亡是由辐射引起的变化导致内皮细胞的功能。它可能导致减少的数量和质量各种生长因子或网络中其他元素直接或间接。确定辐射剂量是非常重要的维持各种生长因子的数量和质量在同种异体如羊膜膜(31日]。

最引人注目的组织移植改变辐射灭菌后会失去贪污的机械完整性和生物物质,包括生长因子。然而,移植还有其他的属性,如屏障功能,可以防止伤口污染,从而验证其使用时的伤口覆盖(32]。研究报告没有显著变化羊膜膜的结构后剂量的15日,20日,25日和30 kGy的γ辐照(33]。

即使生长因子水平可能会减少由于辐射灭菌后,一些研究说给移植25 kGy的剂量的辐射灭菌仍然保持其功能提供组织愈合。Djefal等人进行的一项研究得出的结论是,维持剂量的γ辐照可以证实消毒25 kGy的人类冻干膜羊膜(FD-AM) [34]。尤索夫和Hilmy说的25 kGy的辐射剂量可以很容易地给微生物污染水平较低的羊膜达到无菌保证水平10⁻⁶(3]。相比之下,Deocaris等人推荐的25 - 35 kGy的辐照剂量羊膜膜灭菌产品不育以及平衡要求,防止过度破坏移植(24]。然而,尽管组织消毒是一个不可或缺的过程使羊膜移植,我们需要记住,组织灭菌绝不是替代适当的组织和卫生处理。

5。结论

保存羊膜移植的准备工作,包括冻干膜羊膜(FD-AM)和羊膜海绵、生长因子水平低于新鲜羊膜移植。本研究发现,TGF -β在羊膜海绵和bFGF水平低于FD-AM。生长因子的减少保存羊膜无疑是不可避免的。然而,它需要考虑,显著降低生长因子水平并不一定意味着移植是不适合临床应用。虽然保存羊膜移植生长因子水平较低,研究证明了保存羊膜作为强有力的nonpreserved羊膜膜在临床应用。

FD-AM和羊膜海绵准备显示减少生长因子水平与剂量的给定γ辐照灭菌后15 kGy的25 kGy的。γ辐照灭菌处理羊膜移植是一个重要的因素,不能妥协。建议贪污灭菌进行25 kGy的γ辐照的剂量保证无菌保证水平(SAL) 10 - 6。

本研究采用FD-AM和羊膜海绵和评估他们的TGF -β和bFGF的水平。我们希望可以有更多的研究在其他类型的辐射灭菌效果的羊膜移植,以及一个体内研究分析活组织生长因子水平的差异。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者想表达自己的感激之情的细胞和组织银行再生医学博士Soetomo一般学术医院的支持本研究的进行。