文摘

客观的。伤口初步生物活性评价一种新型生物工程产品(api®、SweetBio Inc .,孟菲斯,TN,美国),合成凝胶,麦卢卡蜂蜜,和羟磷灰石在体外适应症保护、灌输平衡和进步伤口微环境。方法。生物活性的生物工程伤口产品(BWP)抒发人类细胞在体外评估是评价基质金属蛋白酶(MMP)相关蛋白质表达的巨噬细胞和成纤维细胞生长因子的分泌。没有治疗的细胞培养,与脂多糖(LPS)刺激,或直接播种在BWP 24小时。BWP额外72小时时间点进行评估以确定BWP保持其活动相比,本身在24小时。细胞培养上清液分别量化分泌蛋白的水平。结果。BWP MMP-9巨噬细胞分泌物播种是无法探测( ),而组织的MMP抑制剂(TIMP-1)被检测到。这降低了整体MMP-9 / TIMP-1比率由巨噬细胞分泌,与对照组相比BWP播种。此外,prohealing生长因子的分泌,如碱性纤维母细胞生长因子(FGFb)和血管内皮生长因子(VEGF)是观察。结论。从这个初步结果在体外评估表明,BWP有潜力灌输平衡伤口微环境通过减少MMP-9 / TIMP-1比巨噬细胞分泌物和进步以前停滞对治疗慢性伤口通过触发从成纤维细胞生长因子的释放。

1。介绍

糖尿病已成为全球大流行,全世界大约有4.22亿人受到影响(1- - - - - -3]。这些患者的可能性发展糖尿病足溃疡(DFU)一生中高达25% (4]。dfu是慢性伤口很难愈合,因为中断正常的伤口愈合级联(5]。与愈合的dfu相关的后果是严重的。在全球范围内,据估计,每30秒,一条腿被截肢,85%的这些截肢归因于dfu [6]。此外,截肢并发症负责13 - 40%的死亡率,35 - 65%,和39 - 80% 1,3,截肢和5年后,分别4]。其他慢性和促炎的伤口,如下肢静脉溃疡、脓皮病gangrenosum, calciflaxis,还存在一个主要的生物,心理和经济负担在病人和更广泛的医疗系统7- - - - - -10]。因此,需要先进的治疗恢复正常伤口愈合级联向治疗慢性进展和促炎的伤口不仅是对肢体保护,也对挽救生命至关重要。

了解如何治疗慢性伤口(和促炎),关键是理解正常伤口愈合级联、分解,和适当的平衡的临界炎性细胞因子和生长因子。正常的伤口愈合级联可以被描述为四个连续的阶段:止血,炎症扩散,装修11]。中断的级联与无法愈合的发展,慢性伤口(5]。基质金属蛋白酶(MMPs)和组织基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)是必不可少的生物标志物正常伤口愈合时扮演了重要的角色在细胞外基质降解12- - - - - -14]。然而,高浓度的基质金属蛋白酶和放气TIMPs水平一直停滞不前或相关长期炎症阶段,导致慢性伤口或伤口失败(12,14,15]。具体来说,多个临床研究分析了流体从慢性和急性创伤和得出结论,增加MMP-9 / TIMP-1比率与伤口愈合不良(13,16- - - - - -19]。这种蛋白水解失衡会导致退化矩阵组件、生长因子和其他成功完成所需的蛋白质治疗级联(12,19]。一旦伤口微环境恢复平衡,治疗炎症的可能进展阶段的增殖和装修阶段,在此期间生长因子信号细胞增殖中起重要作用,迁移和分化。这些生长因子,如碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF),很容易出现在急性伤口环境中但已被证明在慢性伤口微环境管制(20.,21]。因此,治疗慢性伤口的新治疗策略,如dfu,可针对灌输平衡和发展微环境通过减少基质金属蛋白酶的浓度,增加TIMPs水平,增加水平的生长因子(12,20.]。

初步研究了手稿进行了评估在体外生物活性的新型生物工程伤口产品(api®、SweetBio Inc .,孟菲斯,TN,美国)。具体来说,伤口生物工程产品的贡献(BWP)平衡和进步慢性伤口微环境是评估通过分析从巨噬细胞炎性细胞因子的分泌,从成纤维细胞生长因子在体外细胞培养。BWP坚实的可生物降解的表通过一个先进制造合成明胶(高纯度胶原蛋白衍生物),麦卢卡蜂蜜,羟基磷灰石(HAp)(图1)。每一个这些材料有良好的生物相容性和生物活性的记录对伤口愈合。明胶是一种天然蛋白质基质,有利于细胞粘附、迁移和增殖,以及伤口肉芽和上皮形成22- - - - - -25]。明胶也被吸引和缓冲的高位MMP-2和MMP-9慢性伤口被作为牺牲基质微环境(26]。麦卢卡蜂蜜是广为人知的抗菌、抗炎作用,但它也显示激活生长因子,增加纤维母细胞活性,抑制MMP-2和MMP-9[的表达27,28]。偶然是一种无机矿物质,可以结合蛋白质,离子,从周围环境和其他分子可以触发附着力,增殖,分化的细胞29日,30.]。具体来说,羟磷灰石通过组织愈合已经被证明可以促进伤口愈合,矩阵的形成,血管生成,招募巨噬细胞和成纤维细胞(30.- - - - - -34]。考虑到各种各样的三种生物材料的生物活性,它是假设BWP会引起相似在体外对人类细胞的影响符合灌输平衡停滞伤口微环境和发展对愈合伤口。

2。材料和方法

2.1。巨噬细胞培养和播种

人类单核细胞(THP-1,写明ATCC矿- 202,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)被分化成巨噬细胞使用iFyber协议基于过程建立在文献[35]。短暂,单核细胞培养的RPMI介质(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)包含25 nM佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA Calbiochem,圣地亚哥,美国)48小时,紧随其后的是一个24小时的休息期间没有PMA的培养基。结论的休息期间,细胞被洗一次无菌准备播种1 x磷酸缓冲盐(PBS),然后脱离组织培养瓶用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液(EDTA、生活技术,卡尔斯巴德、钙、美国)。PBS是由96毫米氯化钠(Avantor,二、PA、美国),1.9毫米氯化钾(默克公司,达姆施塔特,德国),7.1毫米Na₂HPO₄(费舍尔化工、公平的草坪,新泽西,美国),KH和1.2毫米₂阿宝₄(美国议员生物医学,梭伦,哦)。

实验中执行12-well细胞培养板(试验板)治疗后评估一式三份(n= 3)在24小时的时间点:与BWP孵化,刺激与脂多糖(LPS、Sigma-Aldrich标准积极控制THP-1细胞),也没有治疗(负控制)。BWP额外72小时时间点进行评估以确定BWP保持其活动相比,本身在24小时。准备试验板,让BWP井都冲洗1毫升Anti-Adherence清洗解决方案(美国干细胞技术、剑桥、马),细胞不会无意中附着在组织培养的塑料。清洗解决方案被移除,和井使用1毫升无菌1 x PBS洗一次。BWP的圆形优惠券使用消毒无菌而干18毫米直径中空钢穿孔。优惠券的先前准备的井被放置在试验板和水化2分钟使用2毫升无菌生理盐水(0.9%氯化钠,Avantor),在此期间他们扩大(如预期)覆盖整个井底。水合作用的解决方案被小心翼翼地吸气,井就播种与巨噬细胞浓度为3.55×10⁵细胞/(2毫升细胞悬液/)。积极的控制井被播种与相同数量的细胞和刺激1μ为24小时(g / mL有限合伙人36,37]。消极的控制(不处理)还与相同数量的种子细胞,但只有RPMI培养基出现在这些井。板被放置在一个湿润孵化器在37°C, 5%的公司₂所需的时间点。结束的时间点,细胞培养基(上层清液)从每个中恢复的很好,通过离心细胞碎片wasremoved,上层的整除,储存在−20°C。

2.2。成纤维细胞培养和播种

主要人类皮肤成纤维细胞(成人(HDFa),写明ATCC pc - 201 - 012,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)是无血清培养系统在纤维母细胞基础培养基补充纤维母细胞生长工具包(写明ATCC)。24小时化验,成纤维细胞被播种在12-well细胞培养板(试验板)治疗后一式三份(nBWP = 3):孵化,刺激与有限合伙人(积极的控制),没有治疗(负控制)。BWP额外72小时时间点进行评估以确定BWP保持其活动相比,本身在24小时。有一些迹象表明LPS刺激的文学影响可能对由成纤维细胞生长因子的分泌,即。肿瘤坏死因子-α水平,潜在的增加,虽然这里描述的实验设置不同(38]。然而,这种控制治疗用于保持一致性与积极的控制治疗的巨噬细胞。

试验板和BWP准备如前一节所述,然而,16毫米直径圆形优惠券BWP被用于此试验井内扩张允许更少的材料。成纤维细胞的播种密度为2.5×10⁵细胞/(2毫升细胞悬液/)。板块在37°C,孵化有限公司5%₂合适的时间点。在指定的时间点,细胞培养基(上层清液)从每个收集好,通过离心细胞碎片移除,上层的整除,储存在−20°C。

2.3。细胞因子数组筛选试验

通过一系列细胞因子测定巨噬细胞上清液进行了分析(人类XL细胞因子数组工具包ARY022B研发系统,明尼阿波利斯,锰、美国)后,制造商的协议。一个为每个样本被膜1小时在室温下摇摆平台。细胞培养上清液的膜被孵化(0.5毫升)一夜之间在4°C的摇滚歌手。1 x的膜清洗三次清洗缓冲(生产商提供的),然后孵化与检测抗体1小时在室温下的摇摆平台。以下三个洗1 x洗缓冲区,streptavidin-HRP添加和细胞膜发生在室温下30分钟。细胞膜又洗了三次,紧随其后的是一分钟孵化与化学试剂混合物。以下光放射自显影法电影(Carestream, 1788207)的膜暴露在以下时间点:1,2,4,8和10分钟。多重曝光时间被用来获得最佳的信号强度。电影被立即使用GBX开发者开发和固定器(Carestream, 5158613)。积极的信号被确定使用这个工具包中提供的透明覆盖,和分析是由与透明度扫描仪扫描的电影,然后确定像素强度相对于试验控制(参考点)使用ImageJ(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。 An initial run with 0.5 mL supernatant was performed to assess the level of biomarkers. If the signal intensities were low, a repeat run with increased supernatant was performed to obtain better resolution (increase the signal to background ratio) and determine if any additional biomarkers can be detected.

2.4。MMP与TIMP化验

通过Quantibody人类巨噬细胞上清液进行了进一步分析MMP数组1 (RayBiotech QAH-MMP-1,桃树,乔治亚州,美国)。这个试验允许10矩阵metalloproteinase-related人类蛋白质的定量测定金属蛋白酶- 1,MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-13, TIMP-1, TIMP-2, TIMP-4最低水平的检测分析物之间的0.02和0.1 ng / mL。Quantibody数组是一个多路复用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)进行载玻片。测定,样品从每个细胞培养试验板的评估一式三份,因此利用九个人每处理类型数组。因为每个蛋白质是发现一式四份,是一个整体n= 36化验。

分析是根据制造商的协议执行。短暂,幻灯片从包装和删除被允许在室温下干燥3小时之前使用。使用100井被阻塞μL的样本稀释30分钟在室温下与温和的摇摆。测定蛋白质标准由冻干重组蛋白混合,然后执行一系列六1:3稀释。封锁时期后,缓冲区被移除,100μL(样品或蛋白质标准添加到每个。减少背景下,细胞培养样本稀释1:2与之前样品稀释剂添加幻灯片。幻灯片是孵化与样品和标准在一夜之间在4°C摇摆平台。第二天早上,幻灯片可以温暖到室温1小时在继续下一步之前。提供样本,幻灯片与150年洗五次μL 150年洗我和两倍的缓冲区μL清洗缓冲II。每个洗孵化五分钟在室温下摇臂。洗后,生物素化的检测抗体被添加到每个在80的数量μL和幻灯片是在室温下2小时摇晃。幻灯片然后洗如前所述。接下来,80年μL的Cy3等效dye-conjugated链霉亲和素添加到每个好,和幻灯片孵化摇臂在室温1小时,受光。幻灯片与洗涤缓冲我然后洗了5次,如前所述。洗后,垫圈从每个幻灯片,幻灯片放在4-slide持有人/离心管。管充满了30毫升缓冲洗我和冲击在室温下15分钟。清洗缓冲,那时我腾出30毫升缓冲洗二世是补充说,管是在室温下5分钟摇晃。清洗缓冲II提供了,并删除幻灯片,与去离子水冲洗轻轻地去除任何残留,完全和干下一个压缩氮气流。幻灯片被运到的生产商为扫描和数据提取分析。

蛋白质含量是由第一正常化荧光信号阵列上的内部控制。每个信号归一化使用以下公式: 在哪里P1 =平均信号密度的积极控制地方引用数组,P (Y)=平均信号密度的积极控制斑点数组Y被分析(数组),X (Y)=信号密度为特定位置数组样本”Y”,X(纽约)=这个点”的归一化值X“对样本数组”Y”。

按照制造商的指示,引用数组定义的研究员,并决定使用的引用数组每个样本平均最高积极的控制信号。正常化后,空白的值减去,蛋白质含量测定用标准曲线生成的每个蛋白质。

统计分析了使用人民币,14版本统计软件(SAS研究所Inc .)来确定在一个先验的水平的显著差异 。分析的数据是基于克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析排名和Tukey-Kramer成对多重比较的过程。这项研究的结果发表在平均值±标准偏差(SD)。样本运行至少一式三份(n= 3)。

2.5。生长因子ELISA测定

人类生长因子ELISA第二条设备与标准(美国Signosis,圣克拉拉,CA)是用于检测成纤维细胞生长因子分泌。板由十二条包含8井,每口井的每个地带都有一个单独的捕获抗体。分析允许以下生长因子的检测:碱性纤维母细胞生长因子(FGFb)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF),血小板源生长因子BB (PDGF-BB) beta-nerve生长因子(b-NGF)干细胞因子(SCF),肿瘤坏死因子-α(TNFα)和转化生长因子β(TGFβ)。

执行的分析是根据制造商的说明如下。试验板的标准准备先稀释表示数量的股票在稀释剂的缓冲地带。一系列的四个双重连续稀释被执行。由此产生的浓度标准:4、2、1,0.5 ng / mL。试验检测范围是0.125到4 ng / mL。在100年的样本添加μL /。细胞培养上清液的一个示例是使用每个地带。两个控制条还包括,一片空白,100μL稀释缓冲/好,另一个是控制纤维母细胞基础培养基,100μL每口井的媒介,没有用于细胞培养。添加标准和样品后,板在室温下孵化了温柔的震动(40 rpm) 2小时。使用200井被洗了三次μL分析清洗缓冲/。洗后,100年μL biotin-labeled抗体的混合物添加到每个好,盘子是孵化1小时在室温下与温和的颤抖。盘子洗了三次如前所述,然后,100μL streptavidin-HRP被添加到每个。板是孵化与streptavidin-HRP 45分钟在室温下与温和的颤抖。盘子洗了三次。接下来,100年μL的底物被添加到每个。底物在室温下孵化了20分钟,然后,50μL停止的解决方案是添加到每个。停止一点的解决方案是添加行操作,所以每个分析物的反应是同时停了下来。然后吸光度是读立即在450海里。空白数据修正,然后,每个生长因子的总量决定使用标准曲线生成的每一个因素。

3所示。结果

3.1。细胞因子数组筛选试验

细胞因子的初始运行的结果数组筛选试验证实,细胞反应的生物标记物检测的LPS刺激控制。总的来说,信号强度是低于预期的。因此,分析重复关注消极的控制和24小时BWP接触获得更好的筛选评估最初的细胞反应。在这里,细胞培养上清液的数量翻了一倍(1毫升)使用。初始和重复运行结果如图2和3,分别。一个阈值5%的参考信号是用于非常微弱的信号。

3.2。MMP与TIMP化验

最高的蛋白质分泌量的控制是TIMP-1和MMP-9(实际值和MMP-9 / TIMP-1比率表中给出1)。TIMP-1分泌大量的消极的控制,然后减少数量的有限合伙人和BWP条件。TIMP-2也有类似的结果,但程度不一样。特别感兴趣的是MMP-9数组中也检测到这种蛋白质在细胞因子筛选试验(图4)。MMP-9分泌在显著提高( )LPS-stimulated数量的细胞相比,消极的控制和BWP样本。消极的控制条件少了大约三分之一(仍然显著降低, )比LPS-stimulated MMP-9细胞。BWP样品引起显著降低(可以忽略不计, )分泌MMP-9相比LPS-stimulated和消极的控制样本。BWP 24 h和72 h并没有统计上的不同( )从对方。所有检测到的水平都高于试验的检测极限。

3.3。生长因子ELISA测定

计算如图生长因子水平5。所有检测到的水平都高于试验的检测极限。负控制和LPS-stimulated样品没有产生一个信号的分析物,除了PDGF-BB有限合伙人样本有一个非常微弱的信号。然而,这并不有损于样本的总体有效性研究空白,纠正和细胞培养基和信号BWP样本观察。分泌的生长因子的最大数量是FGFb。第二个最丰富的因素是VEGF。PDGF-BB,尽管显示出微弱信号的有限合伙人样本,并不是出现在可量化的使用标准曲线。EGF吸光度检测;然而,标准曲线的浓度生长因子是无效的和不确定。

4所示。讨论

4.1。细胞因子数组筛选试验

简短的描述观察到的蛋白质是包括在表中2。LPS-treated巨噬细胞分泌一些蛋白质,预计将作为促炎反应的一部分。高浓度的interleukin-8(引发)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α/ MIP-1β和MIP-3β),MMP-9被观察到。BWP还显示引发升高,一个重要的趋化因子参与中性粒细胞的激活和其他免疫细胞和相关的急性炎症(54,55]。然而,没有可检测巨噬细胞炎性蛋白质或MMP-9分泌细胞BWP播种。

比较两个数字信号2和3,它可以观察到,总的来说,BWP概要文件非常类似于消极的控制。最值得注意的结果图中可以看到3负,唯一的主要差异控制和24小时BWP样本缺乏补充因素D, MMP-9,和血小板源生长factor-AA (PDGF-AA) BWP样本,以及减少水平的分化、生长因子等15 (GDF-15)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、和最值得注意的是,urokinase-type纤溶酶原激活物受体(uPAR)。

这里显示的数据表明,BWP有可能引发所需的生物影响宿主炎症(巨噬细胞)细胞通过不引发炎性反应。这项研究提供了宝贵的在体外见解但不提供检查参与组成分泌腺洞察时态的表达,为临床研究提供。然而,它显示什么分子靶点应该进一步探讨。因此,巨噬细胞上清液进行了进一步分析通过10人类矩阵metalloproteinase-related蛋白质的定量测定。

4.2。MMP与TIMP化验

在慢性伤口、高水平升高蛋白酶破坏组织分解和修复之间的平衡,这可能会导致停滞炎症阶段和延迟愈合。MMP-9相关生物标志物的伤口,这是一个最丰富的蛋白酶在慢性伤口。多个临床研究分析了流体从慢性和急性创伤和得出结论,增加MMP-9 / TIMP-1比率与伤口愈合不良(13,16- - - - - -19]。因此,减少生长因子和细胞外基质的降解减少MMP-9 / TIMP-1比率是一个可行的伤口管理策略将无法愈合伤口愈合状态。

从这个初步的研究结果表明,巨噬细胞与BWP交互时,分泌MMP-9显著降低( )和MMP-9 / TIMP-1比率减少5 x和16 x -和LPS刺激控制相比,分别(表1)。多个生物材料的合成来创建BWP可能在这些结果起到至关重要的作用。MMP-9活动的显著下降可能归因于内部的麦卢卡蜂蜜BWP自麦卢卡蜂蜜可以抑制MMP-9的表达式(28]。除了减少MMP-9的分泌和MMP-9 / TIMP-1比率,BWP内的凝胶可以作为祭祀衬底缓冲/减少高浓度的基质金属蛋白酶(包括MMP-9)伤口微环境(26]。与collagen-based作为牺牲基质支架,这种多通道活动控制MMP-9是一种新方法惟一区别BWP的伤口护理。

最近的一项临床研究表明,MMP / TIMP比率评分系统可以作为潜在的糖尿病足溃疡愈合预测标记,从而使一个适当的治疗计划开发(56]。的记录在体外生物活性的BWP减少MMP-9 / TIMP-1比率表明,它可能是能够灌输平衡伤口内的微环境,从而阻碍或干扰在促进伤口愈合过程中慢性炎症。

4.3。生长因子ELISA测定

一旦伤口微环境恢复平衡,治疗炎症的可能进展阶段,进入增殖和装修阶段,在此期间生长因子扮演关键角色。FGF等生长因子VEGF、表皮生长因子、转化生长因子,PDGF和其他人可能会加速伤口愈合的生理行为(57]。在慢性糖尿病伤口,缺陷等生长因子VEGF和TGF -β参与了延迟愈合率(58]。因此,刺激人体的先天反应分泌生长因子是进步伤口愈合伤口管理策略。简要描述函数的每个生长因子的发现在这个在这个研究包括在表中3。

从这个初步的研究结果表明,成纤维细胞与BWP交互时,分泌水平的FGFb, VEGF, TNF -α,TGFβ相比,自洽场增加负面和LPS-stimulated控制。每个表3,这些因素促进细胞分化、增殖、迁移、血管生成等。观察FGFb最高金额,这是特别感兴趣的伤口愈合考虑fgf已被证明比VEGF和PDGF更强大的血管新生因子67年]。这种刺激生长因子分泌可以归因于每个生物材料构建BWP合成。明胶和麦卢卡蜂蜜是公认的生物活性对伤口愈合。具体来说,麦卢卡蜂蜜被证明能增加纤维母细胞活动和激活生长因子(27]。另一方面,羟磷灰石是一个相对不知名的生物材料在伤口护理。这种无机矿物可以结合多种蛋白质,离子,和其他分子从周围环境中会引发细胞粘附、增殖和分化(29日,30.]。基于这项研究的结果,运气可能发挥作用的生长因子的分泌增加,因为它已被证明通过愈合的促进伤口愈合,矩阵的形成,血管生成,招聘的成纤维细胞(30.- - - - - -34]。

BWP记录生物活性的诱导分泌的主要由宿主细胞生长因子与伤口愈合在体外表明BWP可能能够刺激人体的先天反应,包括重要的生长因子的释放,使伤口促进愈合的最后阶段。

4.4。未来的研究

在体外BWP的性能可能不代表人类慢性伤口的临床表现。早期临床评估正在进行中,还需要进一步的临床试验来支持这些发现。这个手稿的后续研究将比较BWP其他伤口产品和挑战系统有限合伙人或有限合伙人+ BWP条件。额外的未来在体外研究包括检查BWP可能扮演的角色和最后阶段的早期伤口愈合级联通过止血属性和胶原蛋白的生产,分别。这些未来的研究可以提供洞察的另一个基本策略包括BWP伤口管理:主动使用在急性伤口,如糖尿病和静脉伤口在愈合过程的早期,压力溃疡、擦伤和表面的伤口,创伤性损伤,供体,和手术切口创伤网站。

数据可用性

数据要求(电子邮件保护)。

的利益冲突

SweetBio i r是一个执行官inc .)和BWP技术的发明者之一。t . c, n . b .没有利益冲突声明。

确认

这项研究是由SweetBio, Inc .(美国孟菲斯,TN)。iFyber, LLC(美国纽约伊萨卡岛)是简约设计,开展研究。