软骨修复的新水凝胶材料的临床前测试:克服固定问题在大型动物模型

文摘

钢筋水凝胶是一种很有前途的关节软骨组织工程的策略。他们可以重新创建本地关节软骨机械和生物学特性,促进软骨再生结合间充质基质细胞。的局限性之一在活的有机体内模型测试的结果是植入组织工程方法固定。膝关节内的高机械应力,以及凹凸软骨表面,使固定钢筋水凝胶具有挑战性。方法。不同固定方法全层软骨的缺陷minipigs如纤维蛋白胶,BioGlue®,覆盖,直接缝合nonenforced和执行结构进行了比较。因为固定在软骨的不足缺陷,表面在股骨滑车骨软骨缺损,以及股骨髁,检查使用压配合固定。两种不同的水凝胶(starPEG和页面)比较3 d-micro-ct (μCT)分析以及组织学分析。结果。我们的研究结果显示,软骨的低于50%的固定方法的缺陷。1毫米的骨软骨缺损表面深度是必要的长期固定的聚已酸内酯(PCL)钢筋水凝胶结构。压配合固定似乎是用于一个可靠的固定胶或缝合材料的95%没有干扰。尽管良好的集成结构,特别是starPEG组,可见骨溶解中检测出微ct分析。之间没有显著差异的两个水凝胶(starPEG和页面)和空控制缺陷对再生组织和细胞融合。然而,starPEG组更cell-containing水凝胶碎片被发现在缺陷区域。结论。压配合固定在一个肤浅的内侧骨软骨缺损滑车沟的成年minipigs钢筋水凝胶是一种很有前途的固定方法。为了避免骨溶解,未来的方法应该专注于多层结构重建的纬向软骨钙化软骨和软骨下骨板。

1。介绍

骨关节炎是全世界增长最快的残疾的原因之一,大大减少了影响个体的生活质量(1]。一般理解,一旦疾病已经开始,它可能被推迟,但不能治愈。由于一个重要的情况下,骨关节炎从年轻或中年患者软骨损伤或缺陷,这些缺陷的有效修复是一个优先考虑的目标在整形手术。

到目前为止,许多方法软骨修复已经提出,包括微裂缝、骨软骨自体移植,mosaicplasty,切碎或微缩关节软骨移植,自体matrix-induced软骨形成(氨的),或自体软骨细胞移植(ACI) [2]。然而,这些方法能够生成功能透明关节软骨,而是诱导纤维软骨力学性能较低(2]。另一个问题,特别是对氨的和ACI过程,内固定的结构缺陷和相邻本机软骨。

在更高级的骨关节炎,最常用的治疗仍然是部分或全部关节置换。由于有限的耐用性植入物和人口老龄化,修订率是表示在未来增加。同时,它需要被记住,尽管良好的功能和patient-reported结果对某些关节如臀部、其他关节显示更有前景的结果(3]。植入物仍然是一个异物,与感染的易感性,等重要问题和wear-related问题。由于这些原因,软骨修复整形外科手术仍是一项重要任务,因此研究软骨修复。

由于软骨组织的自我修复能力较低,一直专注于足够的细胞来源软骨组织工程修复。与关节软骨细胞(AC),间充质基质细胞(msc)可以收获小施主能级发病率高膨胀率,因此代表了一个有前途的细胞来源(4]。虽然chondrogenic msc的潜力已经在许多研究[5- - - - - -7),他们的临床使用,然而,远非普遍。的一个问题是,足够的航空公司的许多msc影响似乎在软骨缺损和联合使用的先决条件。

水凝胶是一种很有前途的方法作为软骨组织的细胞组织工程载体。他们很容易处理,可以均匀地加载细胞,能促进chondrogenic MSC分化[8,9]。水凝胶基于allyl-functionalized聚缩水甘油)(P (AGE-co-G))交联thiofunctionalized透明质酸水凝胶(在此进一步命名页面)可以结合间充质基质细胞和有希望的结果在体外软骨形成(9]。

此外,PEG-based水凝胶,如starPEG,允许调制的机械性能,降解性,定制整合cysteine-containing肽。他们提供优秀的条件msc对生存和增殖。此外,starPEG水凝胶结构显示良好的细胞外基质分布在整个构造和有前景的结果在活的有机体内以及在体外(8,10]。

解决软骨再生所需的机械和生物学特性,水凝胶加固是必要的。聚已酸内酯(PCL)强化可以用于实现一个类似的刚度为本地关节软骨(11]。PCL-reinforcement还显示关节软骨和骨软骨再生的有前景的结果在活的有机体内(12,13]。然而,到目前为止,在活的有机体内研究PCL-reinforced结构在大型动物模型是有限的由于软骨缺损内固定(不足13,14]。

大型动物模型是一个重要的一步转移成功在体外测试策略软骨修复的临床应用。已经建立了许多大型动物模型在过去(2]。Minipigs显示重要的相似之处人类关于膝盖解剖学和生物力学。他们被认为预测临床结果比小的实验动物模型。因此,minipig模型验证临床前模型关节软骨和骨软骨修复(15]。此外,minipigs基因相似的个体,这减少了个人间不一致的治疗潜力(16]。这些属性,以及人类的相似性有关膝关节负重需求和胶原纤维排列,使他们常用的大型动物模型软骨再生(17- - - - - -19]。滑车沟和股骨髁minipigs缺陷模型已建立,与缺陷的重要不同的生物力学加载网站(19,20.]。在临床实践中,关节软骨和骨软骨缺损来关注。与软骨的缺陷,骨软骨缺损提供骨性融合的优势,从而永久的生成和固定的构造18]。

,一方面,评估安全处理cell-laden结构和他们的潜在好处应该来自大型动物实验,临床应用仍存在,另一方面,安全固定结构的问题。巨大的变化稳定性取决于所使用的固定方法。由于其独特的性质,确定合适的固定技术不能被执行以通用的方式,但必须单独考虑每个构造组合。很明显,临床使用最重要的一个先决条件是,结构保持永久,即使关节运动。

因此,本研究的目的是要适应构建和固定的设计,以获得永久保留minipig cell-laden组织工程构建的软骨缺损动物模型。纤维蛋白胶是一种最常用的固定方法除了缝合,或两者的组合,主要的焦点是确定纤维蛋白胶是否提供了足够的固定不同的构造设计。然而,其他固定技术,如压配合固定,也被评估。确定滑车沟或股骨髁缺陷有关固定效果不同,关节软骨和骨软骨缺损在这两个位置都比较。最后,因为上述重要生物力学差异在关节软骨和骨软骨缺损,固定的有效性评估缺陷深度,定义构造是否固定在骨软骨软骨的缺陷可以作为可靠的缺陷。

2。材料和方法

2.1。动物

实验进行共27只是成熟的小型猪(哥廷根Minipigs, Ellegaard哥廷根Minipigs, Dalmose,丹麦;Mini-Lewe Ruthe农业教育和研究,大学兽医汉诺威,德国)。7个男性和20名女性minipigs平均年龄为27.5±4.8个月,平均54.9±10.4公斤的体重手术的日子。动物被关在室内运行允许自由流动,不受限制地接触水。他们每天喂食一次。动物实验动物实验委员会批准的卡尔斯鲁厄(G-203/14 G-117/16)和动物保健进行根据国家指导方针符合欧盟指令(2010/63 /欧盟)。

2.2。隔离和猪关节软骨细胞的文化

猪关节软骨细胞(pac)隔绝健康猪膝关节(n = 2捐助者)从当地屠宰场屠宰猪获得所述前(21]。短暂,冲洗软骨被切割成小块,与胶原酶消化在一夜之间B(1.5毫克/毫升,罗氏诊断,巴塞尔瑞士)和透明质酸酶(0.1毫克/毫升,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),和过滤40μ尼龙网。软骨细胞被播种在6000个细胞/厘米²和扩大5 - 6天在杜尔贝科修改鹰谷酰胺中(DMEM)低葡萄糖,10%胎牛血清(FCS, Biochrom,柏林,德国),100 U /毫升青霉素,链霉素100µg /毫升在37°C,和6%的公司₂。媒介取代每周两次。

2.3。隔离和猪间充质基质细胞的文化

猪间充质基质细胞(pMSCs)从骨髓中分离获得的骨盆从2 minipig捐赠者的骨髓愿望如前所述[22,23]。单核细胞分数被使用聚蔗糖密度梯度离心法分离®-Paque +(通用电气医疗集团,小都,英国),洗和播种扩张介质(DMEM高葡萄糖与谷酰胺,10% FCS, 100 U /毫升青霉素,和100年μg / mL链霉素,补充了4 ng / mL纤维母细胞生长因子2 (FGF-2,活跃的生物科学,汉堡,德国))。镀单核细胞的密度为1.5×10⁵细胞/厘米²在单层培养和附着msc是3段(5×10亚文化⁴细胞/厘米²有限公司)在37°C和6%₂。

2.4。制备水凝胶材料和组织工程结构

starPEG水凝胶是由混合thiol-end-functionalized (non-MMP-sensitive) starPEG或starPEG-MMP-conjugates携带MMP-sensitive肽在每个手臂和马来酰亚胺功能化恒摩尔比率的肝素(总)starPEG肝素1.5所描述的8,24]。水凝胶前体与PBS重组。的总固体含量水凝胶被调整的混合组件后稳定的维持在5.3%左右。线性的合成进行了P (AGE-co-G)和HA-SH之前所描述的(9]。水凝胶的制备,P (AGE-co-G)和HA-SH溶解在PBS最终聚合物浓度的10 wt. % (5 wt. %的聚合物,SH的克分子数相等的比例和烯丙组)和剂I2959(位于路德维希港的巴斯夫,德国;浓度为0.05 wt. %)添加到水凝胶前体的解决方案。水凝胶前体的pH值的解决方案是使用5 M氢氧化钠中和。

PCL (Purac Purasorb PC12、Corbion-Purac Gorinchem,荷兰)是挤压使用RegenHU生物(3 d发现Gen1 RegenHU)配有thermopolymer挤出机(精密挤压沉积打印头,基于螺丝的挤出机,HM110EX)。一根针的内径0.25毫米(诺信工艺流程图)。水库的挤出机加热到85°C,和打印头的温度设置为93°C。印刷前的材料预热30分钟。PCL印刷的挤压速度17.5转/分钟,3条挤压压力,一位收藏家板5毫米/秒的速度。阴影模式PCL链(90°)印6×6毫米圆形足迹。层的高度是0.20毫米,链中心链中心距设置为1毫米。软骨的方法,3 - layer PCL是印刷五PCL是用于表面骨软骨缺损。

水凝胶材料是使用或pMSC游离和pac聚合之前被添加。水凝胶聚合在一个光盘模具没有执行或封闭CellCoTec(有条件现金转移支付;CellCoTec BV、Bilthoven荷兰)或聚已酸内酯(PCL)执法(补充图1)。P (AGE-co-G) + HA-SH水凝胶的解决方案是使用紫外线交联(UVL手灯与过滤器,a . Hartenstein维尔茨堡,德国)5分钟365海里(1 mW厘米²)。PCL网有一个直径6毫米的高度≤0.6毫米的三层软骨的方法和高度≤1毫米的五层骨软骨方法链的宽度约285μm。有条件现金援助和PCL穿孔直径6毫米和0.6毫米的高度(软骨的方法)或1毫米(表面骨软骨方法)。对于执行结构,各自执行湿透了25μL水凝胶盘模具。nonenforced构造,光盘模具满心30μL水凝胶材料。构造了直接植入前,聚合后,植入使用不同的固定方法在关节软骨或骨软骨缺损在内侧滑车沟或股骨髁部。

2.5。研究设计

几个固定的方法,基于临床应用方法,测试了我们的预制/ nonreinforced以及有条件现金援助,PCL-reinforced直到我们实现一个可靠的构建固定结构。

首先,目前的黄金标准纤维蛋白胶(TISSEL、德国巴克斯特GmbH Unterschleißheim,德国)与BioGlue (CryoLife Inc .)、美国奥得河JOTEC来自Hechingen),显示一个优越的植入物固定在体外(数据没有显示)。然而,固定方法都不够可靠的构建保留。

因此,我们测试了直接缝合的胶原蛋白的结构以及缝合覆盖如下所述。尽管术中固定稳定,宏观上和/或显微镜下观察术后植入4周后脱位。

评估是否不同的生物力学属性会影响植入错位,植入物固定在股骨滑车与股骨髁。

这些方法取得了可靠的固定尺寸的软骨的缺陷位置,我们决定创建一个表面骨软骨缺损如下所述。额外的高度和表面的骨软骨缺陷允许的稳定可靠的固定使用压配合技术的构建。没有好处,股骨髁作为替代缺陷位置,进一步的实验只评估轮状的缺陷。

研究设计和动物保护的原因,无效的样本大小固定方法被保持到最低限度。

在建立骨软骨缺损表面使用压配合固定作为一个可靠的固定方法,两种不同PCL-reinforced水凝胶,P (AGE-co-G)和starPEG水凝胶,比较而言,构造,保留、软骨下骨溶解和软骨的形成(图1)(表1)。

几个固定方法检测全层软骨的以及肤浅的骨软骨缺损在股骨滑车和股骨髁minipig。后成功植入的固定结构,两个不同的钢筋水凝胶(凝胶1:starPEG;使用宏观凝胶2:页面)比较分数,μCT和组织学分析。

2.6。原位移植

在无菌条件下进行所有操作在气管内麻醉(阿扎哌隆5毫克/公斤i.m.。,氯胺酮15毫克/公斤i.m.。,midazolam 0.5 mg/kg, propofol 2% i.v. to effect, and inhalation anesthesia with 1–3% isoflurane in oxygen). For orthotopic implantation at the medial facet of the trochlear groove of each femur, bilateral arthrotomy was performed as described before [25]。直中位数之间的5 - 8厘米是皮肤切口髌尖和胫骨粗隆。准备皮下组织后,髌骨肌腱是纵向分裂,给访问膝空间。

对植入股骨髁部,关节切开术进行正确的后腿与3厘米切口内侧和外侧髌骨肌腱,股骨髁部提供访问。

两个缺陷直径6毫米,深度约0.6毫米(软骨的方法)和1毫米(骨软骨方法)被创建的中间三分之一的内侧方面每个股骨滑车沟或内侧和右股骨外侧髁。

标记后与活检冲头直径,透明软骨分离了刮匙,直到全层软骨缺损与实现表面光滑植入(软骨的方法)。骨软骨的方法,分离后用刮匙透明软骨,钙化层被使用玫瑰钻主管40.000 rpm恒灌溉下不会引起任何出血的软骨下骨。四个缺陷都产生在每个minipig和对待不同nonenforced或水凝胶结构或空作为控制执行。构造小心地插入,直到他们的表面是软骨水平下,在不同的固定方法。Melsungen Premilene 7/0 (b·布劳恩Melsungen AG),德国)缝合材料是用于直接缝合的胶原蛋白的结构以及固定盖(Chondro-Gide®, Geistlich制药公司Wolhusen,瑞士)。伤口被多层伤口缝合关闭。

术后,动物接受丁丙诺啡每12小时(Buprenovet®,拜耳重要GmbH,勒沃库森,德国,0.025毫克/公斤坜)总共48小时以及meloxicam (Metacam®15毫克/毫升,勃林格殷格翰集团Vetmedica GmbH,殷格翰集团,德国,0.4毫克/公斤订单)和阿莫西林(Duphamox®洛杉矶,Zoetis德国GmbH,柏林,德国15毫克/公斤坜)只要必需的。

Minipigs安乐死在2、4、12周术后全身麻醉下过量戊巴比妥(释放®,WDT Garbsen,德国)。软组织切除,关节囊被打开了显示缺陷区域。缺陷面积以及周围软组织当时检查剩余的构造和软骨或软组织不规则的形状和颜色。宏观检验和照片文档后,滑车或侧分离和缺陷区域的分析处理。

2.7。ct机分析

ct机的缺陷分析网站进行移植后直接使用SkyScan 1076在活的有机体内x射线microtomography (SkyScan, Bruker-micro-CT,比利时)。使用以下设置:1.0毫米的铝过滤器,100千伏电压源,电流源100μ曝光时间400毫秒,体素的大小18μm,旋转步骤0.5度。重建图像进行使用NRecon®软件(版本1.6.3.2 SkyScan)。骨骼的分析,CTAn®(版本1.13.2.1 SkyScan)是用于计算的体积骨组织内定义的体积感兴趣的(VOI, 8毫米×1毫米)所代表的缺陷边界和58截面图像到骨头。低灰度值被设定为80,上灰度值被设定为255。测量对骨的影响/体积总量在每组中,一种动物有四个空的缺陷是直接移植手术后。ct机分析生成代表天0值比较结果后,每组12周。

2.8。组织学

ct机后直接成像,猪骨软骨样本为72 h在4%甲醛固定之后,要么脱钙作用长达16周在乙二胺四乙酸或13 - 15天Formical®2000(美国StatLab) (n= 30),分别或加工有机玻璃(PMMA)嵌入(n= 46)。脱钙标本脱水和PCL残余溶解在丙酮和二甲苯,之前样本嵌入石蜡。切割后5μm系列部分,II型胶原蛋白是沾染了鼠标反人类单克隆抗体(MP生物医学,德国;杰克逊ImmunoResearch英国)根据标准免疫组织学协议ImmPACT向量红色对比染色(向量实验室、美国)。

PMMA嵌入式标本用甲苯胺蓝染色。聚合完成于孵化器为37.5°C。地面部分被削减,安装在Acropal幻灯片和抛光表面与甲苯胺蓝染色。

2.9。修改奥德利得分

为半定量的histomorphological评价修复质量的为期12周的团体,一个代表甲苯胺蓝染色部分由两个盲观察者根据标准评估修改奥德利的分数(26)(补充表1)。

2.10。统计数据

Shapiro-Wilk测试进行确认我们所有的数据的正态分布。为连续变量进行了描述性统计平均值和标准偏差(SD)。调查小组之间的区别,使用单向方差分析和纠正Bonferroni测试。组织数据的组比较利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验和事后Mann-Whitney紫外线测试和符号秩检验。所有测试按照双边进行测试。差异被认为是重要的 。使用SPSS统计评估完成(版本22.0.0,SPSS Inc .)、芝加哥、IL,美国)。

3所示。结果

所有minipigs麻醉后恢复得很好。经过5到9天的术后镇痛和抗生素治疗,所有的动物都能走路没有任何临床疼痛或残废的迹象。minipigs保持健康,没有遇到不可预见的事件,直到安乐死手术后12周。

3.1。没有固定的水凝胶结构滑车沟软骨缺损

发展最好的固定方法预制游离水凝胶,几个临床或实验方法比较用于软骨的滑车缺陷在活的有机体内。

预制水凝胶(n= 4),以及CCT-reinforced水凝胶(n= 8),是用纤维蛋白胶固定。4周后,没有一个结构中检测到的任何缺陷。

Chondro-Gide®被用作覆盖皮瓣,以防止位移nonreinforced构造(n= 1)。术中由于水凝胶的脆弱性,压力应用于封面把凝胶的缺陷(图2(一个))。虽然Chondro-Gide®仍在4周后,没有发现这种凝胶的残余无论是宏观还是微观的缺陷。

CCT-reinforcement稳定足够的直接缝合周围的软骨。当我们获得一个稳定的固定处理,所有的结构从而治疗4周后仍然存在在活的有机体内(n=(图3)2 (b))。

然而,在几个膝盖脱臼构造周围组织中被发现,表明早期脱位而不是早期,完全降解的构造在前4周内。没有证据表明宏观软骨炎症反应。组织学检查没有软骨下病变的任何缺陷,没有剩余的水凝胶和强化水凝胶可检测(图2 (c))。

在体外实验显示了优越的附着力的结构粘BioGlue®相比,纤维蛋白胶(补充图2)。尽管有前途在体外结果,没有一个结构固定4周后与BioGlue留在的地方(n= 4)。移植的时候,宏观观察周围的软骨改变颜色。这些发现与周围软骨的微观结果显示变性也严重溶解的软骨下骨的皮质结构BioGlue®治疗缺陷(图2 (d))。使用后的ct机可视化显示骨侵蚀BioGlue®在软骨的缺陷(数据未显示)。

总之,没有一个测试方法能够反复修复一个预制(钢筋)水凝胶在滑车沟的软骨缺损。

3.2。没有缺陷的位置保留构造的影响

由于常数femoropatellar剪切力量联合,股骨髁测试作为替代缺陷位置与不同的生物力学加载。的高刚度和脆弱性CCT-reinforcement为应用程序认为是不适用的。PCL-reinforcement更容易处理和脆弱的一个好的多孔系统(补充图1)。此外,pac被添加到我们的结构。4周后在活的有机体内组织学分析显示,没有水凝胶内残余缺陷治疗没有PCL-reinforcement在任何位置(n= 4滑车;n= 2髁)。PCL-reinforcement导致更高的保留率2/3的滑车和股骨髁部1/2。宏观上,滑车缺陷被更少的裂缝和本地软骨的变化相对于髁的缺陷。

软骨下骨的细微变化,没有骨质溶解,观察在滑车缺陷处理PCL-reinforced结构。少重建软骨下骨被发现的缺陷与脱臼PCL-reinforced构造,在一层纤维组织内形成的缺陷。PCL结构4周后仍可定义。

保持率较低,以及显微镜下形成的纤维组织内的缺陷没有PCL-reinforcement治疗,观察股骨髁缺陷滑车缺陷相比,这可能部分造成的凸面股骨髁(图3)。

最终定义是否滑车格罗夫提供一个令人满意的保留PCL-reinforced构造软骨缺损,12缺陷进一步测试。然而,2周后,所有12/12缺陷没有PCL和或水凝胶内残余缺陷。

因此,一个纯粹的软骨缺损没有提供必要的缺陷深度的可靠固定nonenforced和执行结构。

3.3。改进结构固定在表面的骨软骨缺损

通过创建一个骨软骨缺损表面没有明显的出血点通过与玫瑰头钻钻,我们能够实现缺陷的深度约1毫米。软骨下骨板的稳定性以及允许的额外高度压配合固定的pAC包含PCL-reinforced构造结合蛋白胶。组织学分析证实,8/8的PCL-reinforced构造4周后仍可检测,而0/8的nonreinforced结构构造的(一个额外Chondro-Gide®封面)被检测到。

由于石蜡固定困难,造成PCL-construct,外植体固定在PMMA组织学。组织学分析显示骨质溶解的软骨下骨不管PCL-reinforcement(图4)。

为了说明骨溶解的程度,我们进行了ct机扫描。在两组独立的位置,发现了严重的骨质溶解而第0天扫描。骨质溶解被发现在骨软骨缺损,接受PCL-reinforced和nonreinforced结构。相比之下,软骨的缺陷并没有显示任何骨质溶解的迹象在ct机扫描(图5)。由于缺乏明显的效益和观察到的相邻软骨的变化,使用缺陷在股骨髁部被中止。

建立压配合固定后为我们的预制凝胶作为一种适用的方法,两种不同的水凝胶(starPEG和页面)进行测试,以确定是否使用不同的水凝胶对骨溶解产生影响。此外,我们没有额外使用纤维蛋白胶由于潜在的免疫效应,这可能是一个潜在来源的观察软骨下骨的变化。因此,我们量化的骨溶解在水凝胶组和空控制使用ct机扫描和研究结果相比天0缺陷。

3.4。成功压配合固定PCL-Reinforced pMSC包含结构两种不同的水凝胶材料(StarPEG与页面与空控制)在滑车骨骨软骨缺损的槽

在移植后12周,没有炎症的迹象,关节内的病理变化,或不良反应观察关节内或周围组织。宏观上,在17/20 PCL清晰可见缺陷后12周在活的有机体内。可见实施的五个显示的结束他们的顶层,表明PCL执法开端的恶化。所有3缺陷和宏观上看不见的PCL属于starPEG组。空的缺陷都是充满了白色修复组织。

3.5。增加骨质疏松缺陷处理PCL-Reinforced结构相比,空控制3 d-micro-ct缺陷分析

评估潜在的骨骼变化与缺陷相关的治疗,所有缺陷站点进行了ct机移出后直接成像。所有组ct机可视化显示骨侵蚀,这似乎更明显在治疗组PCL执法相比空控制(图6(一))。

骨体积/总量(BV /电视)在每个缺陷的体积感兴趣的量化标准条件下为期12周的研究。BV的均值/电视的三组为37.05% (starPEG: 18.39 -49.24%), 41.65%(页面:30.45 - -57.74%)和46.41%(空控制:35.84 - -52.70%)(图6 (b))。统计分析(方差分析,Bonferroni调整, )显示组之间没有显著差异。12周后,意味着BV /电视starPEG下降了9.36%,4.76%的页面组,空白对照组和0.73%相比,4个空的缺陷后直接移植手术(0)(图6 (c))。因此,治疗与PCL-reinforced构造页面往往诱发骨质疏松多空控制而骨质流失明显高于starPEG组相比,空控制(方差分析,迷幻药, )(图6 (c))。

3.6。更多StarPEG Cell-Containing缺陷组相比,页面组

部分有机玻璃(PMMA)嵌入式样本染色蛋白聚糖。显微镜下,PCL-reinforcement保持在19/20缺陷,表明只有一个构造在12周的损失。这一缺陷显示严重的骨溶解和属于starPEG组。总而言之,因此集成策略是成功的。

水凝胶碎片中发现了6/10缺陷starPEG-treated组和6/10缺陷PAGE-treated组。starPEG组,5/6缺陷与水凝胶碎片cell-containing页面组相比,只有3/6。

3.7。异构再生组织的组织学评估小组

再生被两个盲观察家使用修改后的分级´阿德里斯科尔得分覆盖的性质主要组织(细胞形态和染色矩阵)和结构特性(表面、结构、侧向和基底集成和软骨下骨)(补充表1)。

总的来说,软骨再生非常异构第5 - 11的分数范围(空控制),电场(starPEG),和3 - 10(页面)。由于这种非均质性,没有统计显著差异群体之间(图7(一))。

缺陷主要是充满纤维proteoglycan-negative再生组织(图7 (b))。一些缺陷显示良好的软骨再生发展从底层骨(图7 (c))。

4所示。讨论

大多数研究解决软骨的再生使用骨软骨缺损模型来实现一个可靠的构造的生成和集成。骨软骨缺陷的缺陷深度minipig模型通常范围从5毫米至10毫米(15,17,27,28]。骨的创伤可能与骨囊肿的形成由于滑液的流入或骨吸收加快,甚至植入后12个月(20.,29日,30.]。股骨髁缺陷显示更高的软骨修复,但也更软骨下骨囊肿形成和增加术后疼痛(20.]。但只有很少的研究都集中在一个全尺寸的再生软骨缺损不创建一个额外的骨的创伤。这可能是由于这一事实< 1毫米的薄软骨大多数大型动物模型使得保留一个预制构造困难(31日]。尽管类似的机械性能,在猪膝盖软骨厚度不同于1.5毫米2.35毫米相比人类[16,32]。先前的研究显示即使薄软骨层minipigs(大约0.5毫米的17]。

有共识,创建分层结构模仿本机软骨软骨修复至关重要。允许成功治疗软骨缺陷,然而,留住这些结构是至关重要的。为了解决这个问题,我们测试了几种固定方法在活的有机体内。

纤维蛋白胶是常用的实验以及ACI在临床设置。先前的研究主要集中在直接喷射cell-loaded纤维蛋白或水凝胶的构建骨软骨或软骨的缺陷,一些构造覆盖胶原膜(25,33]。固定在软骨的结构缺陷的骨软骨缺陷相比困难得多。在动物模型中,即使固定4周后,纤维蛋白胶和纤维蛋白胶结合骨膜瓣达到足够的植入物固定在软骨缺损。

如图所示在我们的实验中,纤维蛋白胶就不足以保持预制构建在滑车或髁突软骨缺损。

BioGlue®是一个手术已经在临床使用胶水,尤其在心脏和血管手术领域。它旨在实现止血和密封和强化的软组织或受损的实质。尽管其临床应用,在体外研究表明细胞毒性和促炎效应,如巨噬细胞激活(34]。宏观以及微观研究在我们的研究揭示出一个明显的周围的软骨变性以及严重的软骨下骨皮质结构的细胞溶解。我们得出这样的结论,BioGlue®不适合固定在软骨修复,最有可能由于戊二醛成分的影响35]。

来确定是否固定的生物力学加载失败主要是由于滑车沟,我们比较骨软骨缺损定位在滑车沟和股骨髁部。之间没有显著差异在固定稳定滑车沟和股骨内侧髁。骨软骨缺陷滑车沟被称为少导致软骨下囊肿形成,因此首选缺陷位置相对于髁缺陷。然而,他们也似乎承受能力差的缺点cartilage-like组织形式。在软骨再生的研究中,较低的自我修复能力的优势,强调构建植入的效果相比,控制缺陷。这些差异在愈合能力最有可能由于不同的生物力学属性的位置(20.,36]。滑车沟的平坦表面相对于股骨髁部的解剖学实验设置的另一个优势。

为了避免额外的创伤骨软骨缺损的全尺寸,我们创建了一个缺陷约1毫米深度并发构建高度。因此,我们删除了软骨的层,包括钙化软骨和软骨下骨板的大约0.5毫米,创建一个表面的骨软骨缺损。

创建一个表面的骨软骨缺陷使我们获得必要的深度的压配合固定构造,只有小点出血。创建表面的骨软骨缺损的另一项研究使用骨膜瓣,纤维蛋白胶,和/或富含血小板血浆工程软骨构建。在这项研究中,骨膜瓣2个月后收到最好的效果。然而,大多数植入物粘的地方没有覆盖了尽管四周的初始阶段,限制关节运动(37),这与我们的研究结果是一致的。在我们的研究中,由于钢筋结构的刚度或水凝胶的脆弱性,覆盖没有增加的retainment构造。Mainil-Varlet创建表面的骨软骨缺损的研究,能够降低植入物松动压配合固定结构相比,软骨的缺陷。与我们的结果相似,他们观察软骨的缺陷的松动率高∼50%,相比只有20%在表面的骨软骨缺损38]。在我们的研究中,放松利率更低,只有5%的构造放松后12周。

之前的研究表明,纤维蛋白胶的使用导致了独特的软骨下骨细胞浸润和组织质量低劣而纤维蛋白glue-free对照组(37]。缺乏这样的胶纤维蛋白胶让我们避免任何生物相容性问题除了来自构造本身。这可能是特别重要的由于纤维蛋白胶所产生负面影响,如组织质量低劣,低缺陷填充,和纤维软骨的形成14,37]。

PCL-collagen结合BMSC表明对形态有积极影响的结果cartilage-like修复组织(36]。此外,PCL已被用于软骨下骨再生结合磷酸三钙(TCP) (39]。在我们看来,PCL-reinforcement是必要的,以提供更高的刚度,从而使压配合固定到表面的骨软骨缺损。此外,建造更大的灵活性和稳定性有条件现金援助相比,PCL还应该提供一个充分多孔系统,允许更好的整合的脚手架。在我们的研究中,这使得高保留率比CCT-reinforcement软骨的缺陷。研究表明,僵硬的结构提高骨再生多软支架(40]。与我们的研究中,曼奇尼等人没有实现可再生的保留与PCL-reinforced水凝胶在马,但只有PCL锚。作者创造了一个深压配合固定的骨软骨缺损PCL-reinforced构造缺陷。他们观察到大量炎症在前4周内手术后,它最有可能引起严重的骨质流失,不管所使用的水凝胶。作为一个解释,作者讨论,这些影响可能是由于异种的胶水。这是一个影响我们能够消除在我们最后的研究。骨质疏松观察到在我们的研究中,因此,可能是由于机械应力,可能由于我们PCL-reinforcement的刚度得到增强。当缺陷在恒钻灌溉和没有迹象显示术中热量的一代,我们不能可靠地排除影响钻井过程的观察到的骨溶解。

< 3个月的相对较短的观测时期可能已经不足以显示完全重构的软骨下骨14]。然而,先前的研究与骨软骨缺损也表明骨囊肿的存在后一年(20.]。等技术,使软骨下骨骨软骨支架的植入或异体骨软骨移植,可能诱发软骨下骨囊肿形成通过流体侵入或骨挫伤,已被证明在一个绵羊的缺陷模型(41]。然而,骨重建和骨基质或损失也被描述为软骨的缺陷(42]。

弗里德曼等人试图确定一个可靠的固定编织PCL脚手架在使用压配合软骨缺损,纤维蛋白胶,trans-chondral缝合固定,或软骨下锚固定,结合微裂缝的软骨下骨。他们能够实现可靠的保留与软骨下锚定的支架,而没有其他的方法显示的结果(< 50%)。保留压配合组的不足主要是归因于编织,PCL-based柔性结构的构造。结合PCL,作者观察到周围的软骨下骨溶解锚(13]。

在我们的研究中,没有显著差异在软骨修复两国水凝胶(starPEG和页面)和空控制缺陷,表明没有明显缺陷治疗12周后的好处。然而,starPEG组,更多的水凝胶碎片被发现在缺陷区域内,和更多的水凝胶cell-containing碎片。这些碎片可能因此有更长时间的影响和对再生过程的影响。骨质流失,另一方面,在水凝胶相类似。因此,StarPEG似乎是一个更有前途的未来研究水凝胶(43]。

使用nonzonal结构并没有导致有效的软骨修复在我们的研究中。软骨下骨板的修复,以及钙化软骨,然而,被认为是必不可少的一个功能软骨愈合。

为了为软骨修复从基础研究到临床应用,结构必须证明功能在日常临床常规和命令式地必须易于移植和显示可靠固定。压配合固定满足这些需求,并经临床检测骨软骨缺损(44]。由于minipigs软骨厚度不足,骨软骨缺损表面是必不可少的压配合固定的结构。人类软骨可能的更大的软骨厚度足以压配合固定没有创建一个额外的骨软骨缺损。然而,去除钙化在骨关节炎软骨可能重要是因为在骨关节炎软骨下板通常是增厚,导致不同的力学性能45]。在这些情况下,消除了软骨下的板和恢复它的属性可能是必不可少的成功治疗OA,使该表面骨软骨缺损模型有前途的大型动物模型用于未来的研究。尽管前,还需要进行更多研究引入实际策略结合构造,细胞生长因子,固定到临床使用。

5。结论

肤浅的骨软骨缺损允许成功压配合固定PCL-reinforced成人minipigs内侧滑车沟的水凝胶结构。在软骨的缺陷,没有技术提供足够的固定在这个模型。缺陷处理这些构造显示增强骨质溶解的微ct分析。Nonzonal结构并不能证明优于空控制缺陷。

数据可用性

组织学和μCT数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

本笃Lotz和Friederike博特同样助长了手稿。

确认

统计的建议,作者感谢西蒙Gantz Birgit弗雷为优秀的技术支持,和媚兰weis,尼科尔·赫克特和西蒙·德雷尔手术期间的支持。作者感谢卡佳的主犯,MSRU,苏黎世大学和Tobias Gotterbarm,开普勒大学医院:林茨,手术的建议。作者感谢娜奥米·帕克斯顿和托马斯Jungst,椅子的功能材料在医学和牙科和巴伐利亚的聚合物研究所维尔茨堡大学打印并提供PCL支架。这项工作是由欧盟第七框架计划(fp7/2007 - 2013) HydroZONES(格兰特协议书号码309962)。

补充材料

补充图1:描述用PCL执法。补充图2:在体外撤军的强度比较纤维蛋白胶和BioGlue®CCT-reinforced页面水凝胶。补充表1:修改奥德利得分作为用于半定量的histomorphological评估。(补充材料)

引用

1. p·g .客纳罕m . Porcheret, s . r .金斯伯里et al .,“影响和治疗骨关节炎:关节炎治疗OA国家2012年的调查,“临床风湿病学,34卷,不。9日,第1588 - 1581页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j·a·安德森,d, a·p·托斯et al .,“干细胞治疗膝关节软骨修复,”美国运动医学杂志》上,42卷,不。9日,第2261 - 2253页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. s . O ' brien d·班尼特e·多兰,d . e . Beverland”髋关节和膝关节置换手术结果的比较早,中间的后续,”整形外科,32卷,不。3,p。168年,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. w·瓦格纳,葡萄酒,a Seckinger et al .,“比较的特点,从人类骨髓间充质干细胞,脂肪组织,和脐带血,”实验血液学,33卷,不。11日,第1416 - 1402页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. c . Goepfert a . Slobodianski a . f .先令p . Adamietz和r . Portner“间充质干细胞软骨工程”组织工程生物反应器系统卷,123年,第200 - 163页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. m·格里芬s Hindocha和w·s .汗”Chondrogenic成人msc分化,“目前干细胞研究和治疗,7卷,不。4、260 - 265年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. h·勒·w·徐、x壮族f . Chang y . Wang和j .叮“间充质干细胞软骨再生,”组织工程杂志ID 2041731420943839条,卷。11日,2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. e .海塞科德宝,t . Niemietz et al .,“Peptide-functionalized starPEG /肝素钠水凝胶直接mitogenicity,软骨细胞形态和矩阵分布在体外和体内,”组织工程和再生医学杂志》上,12卷,不。1,第239 - 229页,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. s . Stichler t .一杯啤酒:帕克斯顿et al .,“双印刷透明质酸/聚(缩水甘油)混合水凝胶和聚(epsilon-caprolactone) MSC软骨形成,”生物制造,9卷,不。4、文章ID 044108, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. E . Kunisch a K可耐福,E Hesse et al .,“基于StarPEG / heparin-hydrogel体内工程稳定的二地区的软骨钙化层底部,”生物制造,11卷,不。1,文章ID 015001, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. j·维瑟f·p·w·Melchels j·e·琼et al .,“强化使用三维印刷水凝胶纤维制成,”自然通讯》第六卷,没有。1,p。6933年,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. 比比Christensen, c . b . Foldager o·m·汉森et al。”一个新颖的纳米结构多孔聚已酸内酯支架提高透明软骨修复兔模型相比,I / III型胶原支架:体外和体内研究,“膝盖手术,运动创伤学,关节镜检查,20卷,不。6,1192 - 1204年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j·m·弗里德曼m . l . Sennett m . b . Bonadio et al .,“比较固定技术的三向织物聚ϵ己内酯)为软骨修复支架weightbearing猪大动物模型,”软骨,9卷,不。4、428 - 437年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 即公元曼奇尼,r . a . Vindas极限,h·布朗et al .,“固定水凝胶结构的软骨修复马模型:一个具有挑战性的问题,”C:组织工程部分的方法,23卷,不。11日,第814 - 804页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 比比克里斯滕森,c . b . Foldager m·l·奥尔森et al。”实验在哥廷根minipig关节软骨修复:每个膝盖多个缺陷的影响,“实验骨科杂志》上,卷2,不。1,p。13日,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. c·r·楚m . Szczodry,布鲁诺,“为软骨组织再生和修复动物模型,组织工程B部分:评论,16卷,不。1,第115 - 105页,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. t . Gotterbarm s . j . Breusch施耐德,和m·荣格“minipig模型实验在组织工程软骨和骨软骨缺损修复:180年回顾性分析缺陷,”实验动物,42卷,不。1,第82 - 71页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. t . Gotterbarm w·里克特·m·荣格et al .,”一个体内研究生长因子增强,细胞自由,两层collagen-tricalcium磷酸盐在深骨软骨缺损,”生物材料,27卷,不。18日,第3395 - 3387页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. m·荣格j . s . Tuischer c塞尔吉et al .,“胶原蛋白类型的本地应用程序I /透明质酸盐基质和生长分化因子5影响关闭骨软骨由软骨骨化minipig模型中的缺陷,”生长因子,24卷,不。4、225 - 232年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. m·荣格s Breusch w . Daecke, t . Gotterbarm”缺陷定位的影响在哥廷根minipig自发修复骨软骨缺损模型:回顾性分析内侧髌槽与股骨内侧髁,”实验动物,43卷,不。2、191 - 197年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. k .奔驰s布莱特·m·Lukoschek h .猫和w·里希特,“分子分析的扩张、分化和生长因子治疗人类软骨细胞识别的分化标记和与生长有关的基因,”生物化学和生物物理研究通信,卷293,不。1,第292 - 284页,2002。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. h·伯特伦,美国牛肉,j . wachter et al .,“矩阵的发生和发展metalloprotease抑制剂抑制chondrogenic间充质基质细胞体外分化,“干细胞与发展,18卷,不。6,881 - 892年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. s e . Haynesworth m . a .仅有的,ai Caplan,“在人类骨髓来源间充质细胞的细胞表面抗原单克隆抗体检测,”骨,13卷,不。1,第80 - 69页,1992。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. m . v . Tsurkan k . Chwalek s Prokoph et al .,“定义polymer-peptide轭合物形成cell-instructive starPEG-heparin矩阵原位,“先进材料,25卷,不。18日,第2610 - 2606页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. m·荣格b . Kaszap a Redohl et al .,“增强早期matrix-assisted自体间充质干细胞移植后组织再生软骨的厚度缺陷minipig模型,”细胞移植,18卷,不。8,923 - 932年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. f·w·s·w·奥德利基利,r·b·索尔特“耐用性再生关节软骨由自由自体骨膜移植主要全层关节表面缺陷的影响下持续被动运动。在一年的后续报告,”《骨和关节手术。美国卷,卷70,不。4、595 - 606年,1988页。视图:谷歌学术搜索
27. 郑胜耀许凤,c . h . Wang黄懿慧Pao et al .,“富含血小板的影响纤维蛋白在自体骨软骨移植:一个体内猪模型,”我的膝盖,24卷,不。6,1392 - 1401年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. 中州。谢长廷,B.-Y。沈,中州。Wang Lin,小时。李,M.-F。谢”,治疗骨软骨缺损的仿生支架植入聚ε己内酯)/羟磷灰石和glycidyl-methacrylate-modified minipig透明质酸,”国际分子科学杂志》上,19卷,不。4 p。1125年,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. b·冯·Rechenberg m . k . Akens d·纳德勒et al .,“软骨下骨的改变在羊软骨resurfacing-an实验研究使用不同类型的骨软骨移植,”骨关节炎和软骨,11卷,不。4、265 - 277年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. 美国p•奥尔特l . Goebel Wolfram et al .,“软骨下钻孔对软骨下骨的微体系结构的影响,“美国运动医学杂志》上,40卷,不。4、828 - 836年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. b·j·埃亨j . Parvizi r .波士顿和t . p . Schaer“临床前动物模型在单站点软骨缺陷测试:系统回顾,“骨关节炎和软骨,17卷,不。6,705 - 713年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. t·j·克莱因j . Malda r . l .长官和d . w . Hutmacher”的关节软骨组织工程仿生区”,组织工程B部分:评论,15卷,不。2、143 - 157年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. t . Niemietz g . Zass s Hagmann s Diederichs t . Gotterbarm和w·里希特,“异种的关节软骨细胞移植到全层关节软骨缺损在minipigs:命运的细胞和巨噬细胞的作用,“细胞和组织的研究,卷358,不。3、749 - 761年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. p . Umashankar t Kumari, p . Mohanan“戊二醛处理产生有毒的反应相对于去细胞牛心包,”毒理学国际,19卷,不。1,51-58,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. w·福斯特和a·巴纳吉”释放的戊二醛albumin-glutaraldehyde组织胶导致显著的体外和体内的毒性,”胸外科的史册,卷79,不。5,1522 - 1528年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. d . w . s . t . b . Ho Hutmacher, a . k . Ekaputra d . Hitendra和j . h .回族”评价的两相的骨软骨移植加上一个实际上电纺膜在大型动物模型中,“组织工程部分,16卷,不。4、1123 - 1141年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. w·Brehm b . Aklin t山下式et al .,“肤浅的骨软骨缺损的修复自体scaffold-free软骨构建在山羊的模型:植入方法和短期的结果,“骨关节炎和软骨,14卷,不。12日,第1226 - 1214页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. p . Mainil-Varlet f·里斯,格罗根,w·穆勒,c .菠菜和r·p·雅克布,“关节软骨修复用组织工程cartilage-like植入:动物研究中,“骨关节炎和软骨,9卷,不。增刊,S6-S15, 2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. x邵,j . c . h .吴作栋,d . w . Hutmacher e·h·李和g、“大关节骨软骨缺损修复使用混合支架和骨骨髓来源间充质干细胞在一只兔子模型中,“组织工程,12卷,不。6,1539 - 1551年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. k是h席尔,r . Kleemann et al .,“支架刚度对软骨下骨的影响和随后的软骨再生的绵羊的骨软骨缺损模型愈合,”美国运动医学杂志》上,36卷,不。12日,第2391 - 2379页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. c·j·莫兰,a·拉梅什·a·j·Brama j·m·奥伯f . j . O ' brien和t . j . Levingstone”动物模型的好处和局限性软骨修复,转化研究”实验骨科杂志》上,3卷,不。1,p。2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. ai Vasara, M . M Hyttinen M J Lammi et al .,“软骨下骨反应与软骨缺损和企图软骨修复山羊,”钙化组织国际,卷74,不。1,第114 - 107页,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. f·博特,A.-K。回复,大肠Hesse et al .,“治疗焦点软骨缺陷minipigs与纬向软骨细胞/间叶细胞祖细胞结构,”国际分子科学杂志》上,20卷,不。3,p。653年,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
44. f . v . Sciarretta”, 5到8年随访的膝盖软骨的缺陷被PVA-H水凝胶植入,”欧洲医学和药理科学审查,17卷,不。22日,第3038 - 3031页,2013年。视图:谷歌学术搜索
45. j·g . Li阴,j .高et al .,“软骨下骨在骨关节炎:洞察风险因素和微观结构的变化,“关节炎研究和治疗,15卷,不。6,223年,页2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2021本笃Lotz et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。