黄秋葵的影响（黄蜀葵荸荠（L.）荞）上在其天然形式交货和装船在聚合物胶束人癌细胞系籽提取物

抽象

癌症是一种非传染性疾病的高发病率世界各地和死亡率。泰国国家癌症研究所的报告增加乳腺癌，大肠癌，肝癌，肺癌和宫颈癌的累计发生率，占王国所有癌症的60％以上。在当前的工作中，我们试图阐明秋葵的植物化学成分（黄蜀葵荸荠（L.）荞）籽提取物（OSE）和研究在三个细胞系（MCF-7，HeLa细胞，和HepG2）其抗癌活性，在其天然形式递送，以及在与增强的溶解性聚合物胶束的形式，。在OSE黄酮类化合物的存在下被成功地证实，和直接递送对乳腺癌细胞系的最高细胞毒性作用（MCF-7），其次是肝细胞癌（肝癌）和宫颈癌（HeLa细胞）细胞系在该顺序，而其在聚合物胶束输送仅在HepG2细胞进一步提高这种效果。The OSE’s observed cytotoxic effects on cancer cell lines demonstrated a dose and time-dependent cell proliferation and migration inhibition plausibly due to VEGF production inhibition, leading to apoptosis and cell death, conceivably due to the four flavonoid compounds noted in the current study, one of which was isoquercitrin. However, in view of the latter compound’s isolated effects being inferior to those observed by the OSE, we hypothesize that either isoquercitrin requires the biological synergy of any one or all of the observed flavonoids or any of the three in isolation or all in concert are responsible. Further studies are required to elucidate the nature of the three unknown compounds. Furthermore, as we encountered significant problems in dissolving the okra seed extract and creating the polymeric micelles, further studies are needed to devise a clinically beneficial delivery and targeting system.

1.简介

癌症是一种非传染性疾病的高发病率世界各地和死亡率[1个–三]。泰国国家癌症研究所的报告增加乳腺癌，大肠癌，肝癌，肺癌和宫颈癌的累计发生率，占王国所有癌症的60％以上。在当前的工作中，我们集中在三个类型的癌症，乳腺癌和宫颈癌在泰国妇女发病率最高，而肝癌具有最高的癌症死亡率在泰国。

黄蜀葵荸荠秋葵是锦葵科的一种开花植物。由于秋葵豆荚是可食用的，秋葵属植物原产于非洲，种植在世界上许多热带和亚热带地区，如东南亚、印度次大陆和地中海。在民间医学中，秋葵常用于治疗胃炎。药理学研究突出了其抗氧化、神经保护、降糖、降血脂和抗疲劳的活性[4个]。秋葵荚先前已被证明含有多糖，多酚和类黄酮的含量较高。后两者具有很强的抗氧化作用[5个,6个]并从秋葵种子发出而其皮肤提取液几乎不显示这样的反应。在秋葵种子提取物经常提到的物质是异槲皮苷，具有比槲皮素更高的生物利用度，既显示数量的化学保护作用体外和体内，对抗氧化应激、心血管疾病、糖尿病、过敏反应和癌症[7个]。异槲皮苷已表明膀胱癌和胰腺癌进展[抑制八,9个]，以及结肠癌抑制[10个]. 尽管上面提到了很多，但是关于秋葵种子的抗癌作用的报道却很少。与黄酮类化合物有关的溶解度问题需要一个传递系统来增加细胞摄取和细胞质可及性。聚合物胶束是最有前途的传递体系之一，因为其制备简单、成本低[11个–14个]。

本研究的目的是阐明秋葵种子提取物的植物化学物质组合物，并研究其富含类黄酮的分数，在其天然形式递送，以及在具有增强的溶解度的聚合物胶束的形式的抗癌活性，在三个癌细胞系。

2。材料和方法

2.1。化学品和试剂

Isoquercitrin (quercetin 3-O-glucoside) of 90% purity and poloxamer 407 bioreagent grade [9003-11-6] were purchased from Sigma-Aldrich, while Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) and Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium were purchased from Biowest. Fetal bovine serum (FBS), L-glutamax, and antibiotic/antimycotic were purchased from Invitrogen. HPLC reagents, standards, and solvents were of Analytical Reagent (AR) grade and purchased from Sigma-Aldrich. Ferric chloride reagent and Folin–Ciocalteu reagent were purchased from Merck Millipore.

2.2。黄秋葵籽提取物的制备

在泰国佛统府当地种植的黄秋葵荚果在统Mongkol市场在同一省的被购买并分别在成熟的状态，随时准备供人类食用的准备。提取在我们的工作中使用的方法是从Adetuyi和易卜拉欣[方法改性15个]。The seeds were separated from their fruit before maceration with 95% ethanol for 24 hrs. The macerated solution was filtered and evaporated using an evaporator. The concentrate was dried using a lyophilizer (Labconco) (Figure1个). 粗秋葵籽提取物在使用前在-20°C下储存，不暴露于光。

2.3。植物化学物质的定性和定量分析

该提取物的组合物，通过使用测试按照以下描述的方法前一分区的方法筛选。The okra seed extract (OSE) was partitioned with hexane : ethanol : water in the ratio 50 : 45 : 5. The ethanol layer was further partitioned with dichloromethane : ethanol : water in the ratio 50 : 30 : 20. Each fraction was let to evaporate, (OSE-Hex, OSE-DCM, and OSE-EtOH) before chemical testing.

2.3.1。植物化学筛选

对秋葵种子提取物、乙醇、二氯甲烷和石油醚进行了植物化学筛选，对秋葵种子中的生物碱、黄酮类化合物、皂甙类、糖苷类、酚类、单宁等植物化学成分进行了定性检测。所有的植物化学试验均按照Samejo等人描述的标准方法进行。[16个]以及Maria等人。[17岁]。

2.3.2条。总酚含量的测定

在秋葵种子不同种子提取物中总酚含量（TP）是使用经修饰的Folin-乔卡梯奥（FC）比色法[确定18岁–20个]。总之，25 μ该提取物的升用75混合 μl在96孔板中加入去离子水，然后加入1 ： 1 FC试剂，在黑暗中孵育6分钟。之后，100 μ的7.5％的Na升_2个一氧化碳_三was added, and the solution was incubated in the dark for another 90 min. The phenolic content is then measured using a microplate reader at 765 nm wavelength carried out using a standard solution of gallic acid, reported as gallic acid equivalents (GAE)/gram dry weight extract.

2.3.3。总黄酮含量的测定

总黄酮含量（TF）被分光光度测定[18岁,21岁]。20的样品提取物 μ我和60 μl 96孔板中的乙醇。那么，4 μ10%酒精的l_三和4 μl of 1 M potassium acetate were added with 112 μ1L去离子水。将溶液在黑暗中温育45分钟。The total flavonoid content was measured afterwards using a microplate reader at 415 nm wavelength. A calibration curve is prepared using a standard solution of quercetin, reported as quercetin equivalents (QE)/gram dry weight extract.

2.3.4。总多糖含量的测定

总多糖（TPS）的含量与来自增幸等的方法改性的苯酚 - 硫酸法确定的。[22个]. 简言之，600 μ提取的升与100混合 μ升的5％苯酚溶液。Then, 3 ml of concentrated sulfuric acid was added and left for 10 minutes. Following this step, the solution was shaken well and left for 30 minutes. The TPS content was measured using UV-spectrophotometry at 490 nm wavelength compared with a standard curve obtained from the glucose standard.

2.3.5条。异槲皮素的测定

异槲皮苷进行定量分析是根据修改的方法进行通过密封[如所描述的23个]在岛津HPLC/DAD上，采用250 mm（Kinetex）柱，以0.7 ml/min的流速梯度注入1%乙酸（溶剂a）：乙腈（溶剂B）的流动相，在353 nm波长下检测（表1个）。

2.4。细胞培养

2.4.1。细胞系和培养

在人乳腺癌细胞系（MCF-7），人肝细胞癌（肝癌），和人宫颈癌细胞系（HeLa）中由我们从ATCC购买的机构。对于每种细胞类型的接种培养基如下：MCF-7培养在DMEM含有10％胎牛血清1％抗生素/抗真菌和1％L-Glutamax的;HepG2细胞培养在含有RPMI-1640培养基，用10％胎牛血清1％抗生素/抗真菌和1％L-Glutamax的;和HeLa培养在DMEM用含有1％抗生素/抗真菌10％胎牛血清。将细胞在37℃，5％CO培养_2个。媒体文化，每3天更换一次。

2.4.2条。细胞毒性试验

将萃取物溶解在含1％DMSO中，澄清的溶液的完全培养基。癌细胞的细胞毒性试验使用由在96孔板中接种细胞，并温育24小时PrestoBlue化验测试方法。The tests are performed at 24 and 48 hours and measured with a microplate reader at excitation/emission 560/590 nm. Each OSE fraction was compared to the crude okra seed extract. The most effective OSE part in the cytotoxicity assay was then further compared to standard isoquercitrin equivalent to isoquercitrin found in the 1,000 μ当前秋葵种子提取物。

2.4.3。细胞划痕试验

在12孔培养板上以完全培养基单层培养的细胞，用黄色移液管尖端手工刮除，然后用PBS清洗。然后在37℃下，将单层培养基与不同浓度的秋葵籽提取物完全培养基孵育24、48和72小时。用倒置显微镜（日本东京奥林巴斯）捕捉划痕的大小，分别在划痕后0小时和24小时拍摄单分子膜。每个治疗组的实验一式三份。

2.4.4。细胞侵袭试验

Boyden小室迁移试验来研究细胞侵袭。8.0 μm PET过滤器24孔细胞培养插入物（Falcon，USA）涂上基质凝胶（Corning）并在25℃下孵育1 h，在过滤器表面形成一薄层。整个培养基被添加到培养箱的下部。在那之后，在上膛的井里种上2 × 10^4个细胞/孔，以不同的浓度范围为100至500的溶液中加入秋葵种子提取物 μ克/ ml，在低（1％）FBS的培养基中。48小时后，非侵入性的细胞在使用棉签上室进行擦拭;下部和上部腔室用PBS（pH 7.4）中，然后固定在PBS中的3％戊二醛并用在PBS中的0.5％结晶紫染色洗涤三次。Later, the cells were lysed by using 10% acetic acid, and the quantity of cells was analyzed by using a microplate reader at a wavelength of 590 nm.

2.4.5。细胞凋亡

细胞在6孔培养板中以1×10的接种密度培养^6个细胞/在5%的一氧化碳中37°C下培养24小时_2个之前用提取物处理。细胞在6孔培养板中以1×10的接种密度培养^6个细胞/孔。After the cells were treated with different doses of the okra seed extract for 48 h, the cells were trypsinized and a single cell suspension was prepared. Then, the cells were stained using Annexin V and 7ADD (Guava Nexin Reagent, Merck Millipore), which were then analyzed by flow cytometry (Guava, Merck Millipore).

2.4.6。抗血管生成

Cancer cells were seeded on 12-well plates and incubated for 24 h at 37°C in 5% CO_2个。之后，旧的培养基洗涤，并在不同的浓度范围为25至1,000加秋葵种子提取物 μg/ml，培养24和48小时。收集上清液离心后，用夹心ELISA法（VEGF-ELISA试剂盒，Abcam）检测血管内皮生长因子（VEGF）的含量。根据公司协议，将获得的上清液放入96孔板试剂盒中，并使用波长为450 nm的微板阅读器分析VEGF。

2.5。制备和表征在聚合物胶束加载黄秋葵籽提取物

2.5.1条。载糖胶束的制备

OSE加载胶束是由薄膜水合方法制备。In brief, 50 mg of okra seed extract and poloxamer 407 were dissolved in ethanol in a round bottom flask. Each formulation used different concentrations of poloxamer 407, ranging between 50 and 1,000 mg of poloxamer 407. Then, the solvent was made to evaporate to a solid film in a solvent evaporator at 50°C. After that, the dried film was dehydrated with 10 ml deionized water and was sonicated for 15 minutes. The solution was filtrated by using a 0.45 μm注射器过滤器。

2.5.2。OSE-载药胶束的表征

粒度和包封率进行了研究。直径，多分散性指数（PDI），和胶束的zeta电位使用Malvern纳米ZS（Malvern公司，伍斯特郡，UK）的动态光散射测定。截留效力通过破坏胶束在乙腈（默克）来评价。The okra seed extract was quantified by UV-visible spectrophotometry at 353 nm.

2.5.3。OSE-载药胶束的抗癌活性

最佳剂量（用于胶束形成）载糖胶束使用第节中所述的前值分析方法测试癌细胞毒性2.4.2. 在细胞培养基中稀释到与秋葵种子提取物500 相当的浓度后，比较了载糖胶束和空白胶束的性质μ克/毫升。

2.6。统计分析

数据以平均标准差（SD）表示。用单因素方差分析确定两种方法的统计差异。当获得的概率值小于0.05时，差异被认为是显著的( ）。

3。结果与讨论

从植物化学物质试验的结果，可以推断出该秋葵籽油提取物含有黄酮苷，正面为Molisch测试，以及为所述的FeCl_三，筱田和氢氧化钠测试（表2个）。

定量分析结果与植物化学物质的筛选的结果是一致的，这意味着在秋葵种子提取物中发现的物质是作为组黄酮苷英寸总酚（TP）和总类黄酮（TF）的含量分别在秋葵种子提取物最高（表三）。

我们观察到主要成分在乙醇层中被检测到，浓度接近秋葵籽提取物，尽管更低。此外，秋葵籽提取物中总黄酮苷组分的重要组成部分TPS含量较高，为36.73%。高效液相色谱图显示，四个半极性峰与异槲皮素和其他三种早期出现的酚类化合物一致，这些酚类化合物在使用正己烷和二氯甲烷进行分离时不存在（图2个）。

3.1。细胞毒性

当在三种肿瘤细胞系上测试OSE及其不同组分的细胞毒性时，我们发现与对照组相比，正己烷（OSE Hex）和二氯甲烷（OSE-DCM）组分没有任何作用。当使用乙醇组分（OSE-EtOH）和秋葵籽提取物时，后者具有更显著的细胞毒性作用，可能是由于各种物质在防止癌症生长方面的协同作用（图三) [24个–26个]。在本研究中，的秋葵种子提取物的细胞毒性作用的发作出现在48小时而不在24小时时的可见效果（数据未显示），这表明可能是慢性毒性作用。

已注意到秋葵籽提取物的剂量依赖性效应，从100 开始μ克/毫升的剂量。的细胞毒性作用是最高的MCF-7细胞系的生长，随后的HepG2（图4个）。效果是最小的，用于指示到所述提取物抗性作为由Jarial等报道的HeLa细胞系。[27个对于两种槲皮素和芦丁[24个,25个]. 有趣的是，标准异槲皮素的效果不如秋葵籽提取物。在MCF-7细胞系中，葡萄糖浓度为250 μg/ml，含量不超过7.2 μ克/毫升的异槲皮苷的，是作为细胞毒性为28.9当量 μg/ml纯异槲皮素。当葡萄糖浓度为1000 时μ克/毫升含有28.9当量 μ克/ ml的纯异槲皮苷用，我们观察到导致43.6％MCF-7细胞生存力的OSE一个增效的细胞毒性效应相比，纯的异槲皮苷79.9％（表4个). 我们假设在HPLC chromatogram (Figure2个）单独地或与异槲皮苷协同作用是负责该OSE的观察到的增效细胞毒性效应。

3.2条。细胞迁移与细胞侵袭

秋葵种子提取物显示迁移的抑制在两个小区划痕试验三种癌症细胞系（MCF-7和HeLa）的。该OSE提取物对在HeLa细胞迁移抑制效果（图图5（a）和图5（b）;表5个)在25度已经很明显了μ克/毫升concentrations with a wound closure of 28.67 ± 4.25% compared to controls which showed a wound closure of up to 81.50 ± 7.87%. Similar results were noted in the MCF-7 cell line beginning at OSE concentrations of 100 μg/ml（数字6（甲）和6（b）;表5个）。相比粗提物纯罗布麻表明虽然较弱的效果类似。在HepG2细胞生长，并在重叠层组分;因此，跟部的分割和侧出现不太明显（图图7（a）和图7（b）;表5个)当HepG2细胞被划伤而MCF-7倾向于水平分裂成单层而不是重叠时。

Boyden小室迁移测试显示在所有3个细胞系中剂量依赖性效应和所有3个剂量的秋葵种子提取物，已经显示在所测试的最低剂量（图图8（a）和图8（b）;表6个). 在所有剂量下，MCF-7细胞的侵袭抑制率最高，其次是HepG2细胞和HeLa细胞。单用异槲皮素作为对照，对三个细胞株的作用顺序相反，产生相似的效应。我们的结果与Dai等人的研究结果一致。[28个]和Zhang等。[29个]。

3.3。细胞凋亡

在本研究结果部分的早期，我们评估了秋葵籽提取物的细胞毒性效应，并报告了这种效应是剂量和时间依赖性的，MCF-7细胞系的细胞毒性效应最大，其次是HepG2，而HeLa细胞系的细胞毒性效应最小，表明对提取物的抗性。与提取物孵育对细胞凋亡检测有显著影响。桌子7个表明，细胞与25，50，100，250，500750，和1000处理 μg/mL okra seed extract for 48 h resulted in a significant increase in the percentage of apoptotic cells (early and late apoptosis) in a manner consistent with its cytotoxic effects. Thus, the MCF-7 cell line was the most responsive to induction of early and late apoptosis in a dose-dependent manner already at low doses, but slightly declined at the highest dose. Similar albeit weaker effects were noted for the HeLa and HepG2 cell lines. The results are consistent with numerous studies that found that substances in the flavonoid group may induce apoptosis of cancer cells [三十–32]。此外，不同类型的类黄酮的可以表现出在癌细胞中的大量不同的作用，如蜂胶提取黄酮类化合物可诱导乳腺癌更凋亡比在结肠癌[33]。不同类黄酮的化学结构可影响它们的抗自由基活性，并因此诱导对癌细胞的抑制作用差动作用[34]。

3.4。抗血管生成

在本研究中，我们观察到，OSE施加在上在24和48小时的所有3细胞系都以剂量依赖方式其VEGF抑制，但这种影响是仅在48小时显著按照上黄酮和异槲皮苷以前的报告（表八) [35,36]。

3.5。聚合物胶束

泊洛沙姆407是一种非离子型三嵌段共聚物。该结构由3个部分组成;侧面是由聚氧乙烯的两个亲水链和聚氧丙烯的中间疏水链制成。该结构是弯曲成U形时泊洛沙姆407形成胶束，与在胶束和朝外亲水部分面向内的疏水部分（图9个). 我们对胶束界面的工作假设是，从我们的提取物中装载的黄酮苷的羟基将与泊洛沙姆的氧原子形成氢键，导致其被捕获到胶束中，如Chat等人所述。[37]。

以泊洛沙姆407为胶束，将秋葵籽提取物负载到聚合物胶束中。泊洛沙姆407的最佳剂量为50 ： 500，因为其他比例会导致小胶束或低效胶束（表9个）。当泊洛沙姆407浓度的增加，多分散性指数（PDI）也增加，在各种形式和形状及包封功效不足引起密集胶束形成。

空白聚合物胶束没有施加任何细胞毒性作用的任何癌细胞系的。当秋葵种子提取物添加到聚合胶束，增加的水溶性和细胞毒性得到增强（图10个，表10个). 增加的水溶性可能会增加提取物对细胞的渗透速度，从而抑制它们的生长。然而，聚合物胶束传递系统的细胞毒性增加仅在HepG2细胞系中显著，而在MCF-7和HeLa细胞系中几乎没有变化（图10个，表10个）。以前的研究报告说，外排泵和第页-糖蛋白位于乳腺癌细胞的细胞膜上，有助于细胞内和细胞外物质的运输，可能使它们对化疗产生抗药性[38]。类似的报告已经发表了关于宫颈癌[39,40]。在本研究中使用的聚合胶束递送系统是一个初始原型旨在提高秋葵种子提取物中的溶解度。未来的研究是为了设计出更具体的药物靶向系统癌症细胞，如缀合至叶酸[41,42]。

4。结论

在本研究中，我们成功确认的类黄酮化合物在植物秋葵种子提取物的存在并评价提取物的在其天然形式，以及在聚合物胶束的形式递送三种癌细胞系的效果。直接递送秋葵种子提取物对乳腺癌细胞系的最高细胞毒性作用（MCF-7），其次是肝细胞癌（肝癌），并以该顺序宫颈癌（HeLa细胞）细胞系中，而其在聚合物输送胶束仅在HepG2细胞进一步提高这种效果。秋葵种子提取物的作用表现出剂量和时间依赖性的细胞增殖和迁移的抑制振振有词由于VEGF产生抑制作用，从而导致细胞凋亡和细胞死亡。对癌症细胞系所观察到的效果OSE可以从在当前的研究中，其中之一是异槲皮苷的四个类黄酮化合物干。However, in view of the latter compound’s isolated effects being inferior to those observed by the OSE, we hypothesize that either isoquercitrin requires the biological synergy of any one or all of the observed flavonoids or any of the three in isolation or all in concert are responsible. Further studies are required to elucidate the nature of the three unknown compounds. Furthermore, as we encountered significant problems in dissolving the okra seed extract and creating the polymeric micelles, further studies are needed to devise a clinically beneficial delivery and targeting system.

数据可用性

在研究结果商业化的同时，用于支持本研究结果的原始数据目前被禁止使用。本文发表12个月后，相关作者将考虑数据请求。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

作者要感谢药剂和工业药学，药学院，朱拉隆功大学，系提供必要的设施和手段研究的持续时间。

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