Physicobiochemical特点和Chondrogenic分化的骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)可降解多孔海绵牛软骨支架

文摘

组织工程一直认为克服的局限性软骨病变的治疗。现在的研究重点在脚手架使用间充质干细胞。可降解多孔海绵牛软骨支架有望有physicobiochemical表征促进hBM-MSCs chondrogenic分化。从牛软骨支架是印在5毫米直径海绵,分为nondecellularized (SBCS)和脱细胞(DSBCS)。物理特性(孔隙直径和互连)是用扫描电子显微镜(SEM)来完成。生物降解性评估使用磷酸缓冲盐15、30、60分钟,6、24、48、72小时,和1、2周。肿胀比率数在5、10、15、30、60、360分钟。生化特性得到为II型胶原酶联免疫吸附试验,aggrecan,转化生长因子-β(TGF -β)。数据统计比较。hBM-MSCs被播种在两个支架。组织学检查使用hematoxylin-eosin在播种后第二周和第四周。没有显著性差异(p = 0.473;p = 0.142),平均孔隙度90.07±4.64%和88.93±4.18%,孔隙直径111.83±14.23μm和105.29±11.14μm SBCS和DSBCS团体之间的评估。从两组支架孔互连。DSBCS组更快的生物降解性。SBCS组消耗更好。SBCS组包含II型胶原蛋白,aggrecan TGF -β平均值为380.78±18.63 ng / ml, 30.71±4.50 ng / ml,和130.12±7.73 ng / ml,分别在DSBCS包含II型胶原蛋白,aggrecan, TGF -β平均值为64.83±13.54 ng / ml, 8.41±2.38 ng / ml,分别和16.39±4.49 ng / ml。结果在统计学上不同(p < 0.001)。软骨细胞在支架2日和4日周内被发现。Physicobiochemical可生物降解的特征海绵牛软骨支架促进chondrogenic hBM-MSCs分化。

1。介绍

关节软骨是一种特殊的结缔组织,衬砌动关节的关节保护软骨下骨,提供一个光滑、油性表面和促进负载较低的传播关节摩擦系数(1,2]。

创伤和关节软骨退化过程可能破坏,导致关节疼痛,降低生活质量,提高长期并发症的可能性,如骨关节炎(3,4]。关节软骨的内在疗愈能力还很有限,由于较低的多孔性,无血管的和aneural属性(5,6]。骨软骨损伤往往导致二次纤维软骨组织炎症反应。纤维软骨组织生物力学性能比透明软骨组织,从而导致早期关节软骨的恶化和破碎7]。

管理对关节软骨损伤对整形外科医生仍然是一个挑战。目前治疗选项非常多样,从非手术治疗包括药物,如非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),皮质类固醇注射,或viscosupplementation,其次是生活方式的修改,减肥,支撑和理疗。外科治疗选择包括关节镜灌洗和清创术,骨髓攻丝技术,磨损关节成形术,软骨下钻孔、微裂缝,骨软骨喂/自体技术、自体的细胞技术,传统的自体软骨细胞移植(ACI) matrix-induced ACI(》),和生长因子注射会治疗。没有证据的质量的改善关节软骨的结构通过非手术治疗。软骨下钻孔会导致热坏死,另一方面,微裂缝技术提供良好的结果,虽然只有有限的病人年龄超过40年。自体软骨细胞移植的缺点多次手术,更广泛的手术伤口,施主能级发病率,和骨膜瓣并发症如电池泄漏、外围肥厚、钙化问题导致的临床条件”抓“膝盖8]。

所有上述治疗选项通常产生纤维软骨组织,无法产生足够的透明软骨组织。纤维软骨组织容易受到伤害当收到正常的膝盖压缩负载(8]。当前的治疗策略之一是组织工程方法修复和再生软骨生物力学特性、生物合成和结构类似原来的关节软骨。组织工程三由三部分组成:细胞信号和支架。

脚手架作为一个三维模板覆盖细胞缺陷、分布、增殖和分化。脚手架必须可生物降解,无毒,能与主机集成组织,维持生活,在体外和体内植入细胞表型。脚手架应interconnective毛孔高度多孔的支持细胞生长,营养物质运输和清除代谢废物(9,10]。预计海绵多孔结构为干细胞体外文化吸收营养和关节液在体内应用。

有机材料是首选,因为他们有更好的生物相容性和生物降解性比合成材料(11]。牛软骨支架海绵是一个副产品,没有经济价值,之前被丢弃。这种生物材料是便宜和容易获得。牛软骨支架不会损伤干细胞(12]。

没有特性研究对于物理特性,生物化学,生物降解,和海绵牛软骨支架的能力,以促进chondrogenic分化hBM-MSCs为了证明海绵牛软骨支架是一个理想的支架,它提供了生化信号,促进hBM-MSCs chondrogenic分化的能力。本研究的目的是为了证明海绵牛在软骨组织工程软骨支架可能治疗关节软骨缺损。

2。材料和方法

这项研究是一个海绵体外实验研究牛软骨支架与后续测试的设计。脚手架是分为两组,一组不去细胞过程(SBCS)和一组与去细胞过程(DSBCS)。本研究比较了物理、生化特征、生物降解性,水吸收能力,能够促进chondrogenic分化hBM-MSCs SBCS组和DSBCS组之间。物理性质包括孔隙率、孔径大小、和互连而生化特征包括II型胶原蛋白,aggrecan, TGF -β。

2.1。合成海绵牛软骨支架

海绵牛软骨支架生物材料取自牛的股骨头、股骨髁至少24个月提供注册屠宰场按照入选标准的研究。软骨和骨分离,然后它被使用0.9%氯化钠溶液或蒸馏水和后加工成粉磨。软骨被处理以粉末的形式然后用试验筛过滤帧大小为150μm - 355μm。软骨颗粒,大小为150μm - 355μ米,与蒸馏水混合或0.9%氯化钠比例软骨粉:蒸馏水或0.9%氯化钠是1:1。混合物被放入一个直径5厘米海绵模具。

模具含有软骨粉的混合物和蒸馏水被冷冻在冰箱−80°C的温度与深度冷冻技术至少24小时。后被冷冻,冷冻干燥的混合物与升华干燥技术方法使用冷冻干燥器中脱机器。干后,海绵软骨牛与三维模具转载,直径5毫米。DSBCS组脱细胞物理(冻融)和化学了十二烷基硫酸钠(SDS) 5%, 72小时。结果是图所示1。

2.2。物理特性测量使用扫描电子显微镜(SEM)

物理特性进行了分析通过扫描电子显微镜检查(检查S50)来评价孔隙直径、互联互通、形态、和样品表面的地形。

2.3。孔隙度测量

孔隙度计算使用以下公式: :脚手架的干重 :湿重的脚手架PBS液体 :在PBS支架的重量减去浮力液体

2.4。生物降解性测试

海绵牛软骨支架是沉浸在20毫升PBS (pH值7.4)的温度37°C。初始干重(W_我)测量然后浸泡15、30、60分钟,6、24、48、72小时,和1周和2周。脚手架是干滤纸,在一个房间里的温度37°C 24小时(W_f)测量。减肥是通过以下公式计算:

2.5。水吸收测试(溶胀比)

脚手架干重(W_我)是浸泡在PBS pH值7.4室温37°C。脚手架湿重(W_w)在10、15、30、60分钟和6个小时。膨胀率是由下列公式计算:

2.6。生化测试使用酶联免疫吸附试验(ELISA)读者

生化特性获得了使用酶联免疫吸附试验(ELISA) II型胶原蛋白,aggrecan, TGF -β的水平。脚手架必须首先捣碎成粉末形式。然后溶解,离心机,加工得到上层清液和后提交到ELISA读者。

2.7。组织学检查

人类骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)处理的五通道。CD105, CD45 CD73, CD90标记免疫组织化学分析证实细胞特点。细胞的数量被播种到每一个支架是1.55×10⁶。

Hematoxylin-eosin染色。与光学显微镜检查一个观察者在培养支架hBM-MSCs 2和4周内进行。SBCS内的软骨细胞组和DSBCS组已被记录和计算。

3所示。结果

3.1。牛海绵软骨支架的物理特性

横断面考试通过扫描电子显微镜(SEM)表明,多孔SBCS组的形状和大小更均匀DSBCS组相比,可以看到从图2。

图3显示SBCS组的细胞成分的存在,而在DSBCS组缺席。

孔互连如图4观察在两个支架组。SBCS组孔隙大小直径是34.8μ米至372.5μm和DSBCS组为14.7μ米至332.7μm。SBCS组的平均孔径为111.83±14.23μm和DSBCS组为105.29±11.14μm。差异无统计学意义(p = 0.142),如表所示2。

表1根据直径显示孔隙大小分布;大部分的毛孔在两组直径50之间μm - 150μm。孔隙度90.07±4.64%被发现在DSBCS SBCS集团和88.93±4.18%组,但两组没有显著统计学差异(p = 0.473),如表所示2。

3.2。海绵牛软骨支架的生物降解性

生物降解性质量是减少在PBS溶液pH值(7.4)在37°C计算室温15日,30日,60分钟,6、24、48、72小时,1周和2周在两个支架组。

SBCS生物降解率和DSBCS团体最初6个小时相对不变,但在第一个24小时,DSBCS组退化速度,如图5。一般线性模型试验显示两组之间的差异具有统计学意义(p < 0.001)。

3.3。水吸收能力(溶胀比)

牛海绵软骨支架有良好的水吸收和保留。数据6和7显示,外表,吸水,保留SBCS DSBCS组。脚手架可以形成不同形状的模具,满足临床应用的要求。

溶胀比测量完成在5、10、15、30、60分钟和6个小时。在前15分钟,吸水SBCS组594.66±5.08%高于DSBCS组387.50±2.35%。SBCS集团能够吸收水分超过DSBCS组。溶胀比评估的结果见图6小时段8。一般线性模型试验显示两组之间的差异具有统计学意义(p < 0.001)。

3.4。生化试验结果的海绵牛软骨支架

II型胶原水平获得SBCS组分别为380.78±18.63 ng / ml和DSBCS组分别为64.83±13.54 ng / ml。II型胶原蛋白的平均水平更高的渣打银行集团相比DSBCS组。两组之间的差异具有统计学意义(p < 0.001)。aggrecan水平获得SBCS组为30.71±4.50 ng / ml DSBCS组相比,8.41±2.38 ng / ml。SBCS aggrecan的平均水平更高的组,两组之间的差异具有统计学意义(p < 0.001)。

转化生长因子-β渣打银行集团的水平为130.12±7.73 ng / ml和数据集控制块组为16.39±4.49 ng / ml。TGF -的平均水平β高SBCS组相比DSBCS组,差异具有统计学意义(p < 0.001)。表3显示生化特性导致两组。

3.5。组织学检查

Hematoxylin-eosin染色后在周2和4进行播种hBM-MSCs体外。软骨细胞被发现在海绵软骨中可以看到牛的脚手架和数字9和10。

表4表明,软骨细胞计数在星期2和4是高DSBCS集团SBCS组相比,但两组没有显著差异(p = 0.469, p = 0.215)。

4所示。讨论

组织工程的发展,与支架作为必要的元素之一,扮演着一个重要的和有前途的关节软骨再生的作用。理想在软骨组织工程支架包括高孔隙率和孔互连(13]。我们发现SBCS组和DSBCS组的平均孔隙度为90.07±4.64%和88.93±4.18%,分别。两组之间没有统计学差异(p = 0.473)。高孔隙度,通常在80 - 90%之间,足以帮助体外细胞粘附。孔隙度提高循环的营养和氧气,帮助细胞增殖(14,15]。

SBCS组和DSBCS组的平均直径分别为111.83±14.23μm和105.29±11.14μm,分别。SBCS集团的孔径大,但没有统计学意义(p = 0.142)。细胞的功能和新的组织再生都依赖于多孔尺寸。多孔的大小必须在一系列促进细胞渗透和迁移细胞孵化期间,营养扩散和清除代谢物质和提供一个三维的环境能够诱导细胞耦合和分化16]。孔互连是证明在两个支架组。相互联系的孔隙的多孔胶原蛋白支架促进的平稳分布的细胞在支架。因此,细胞可以顺利传播和均匀分布不仅在较大的多孔区域还在小孔隙地区(17]。

歌et al .,在他们的研究报告,大孔隙直径在100 - 300之间μ米有一个环境有利于细胞的粘附和增殖18]。孔的直径100 - 150μm脚手架设计适用于关节软骨工程(19]。在这项研究中,SBCS和DSBCS组平均直径相似的多孔是105 - 111μ米,这个范围包括在多孔的标准直径的软骨支架根据Janik等。如果多孔的大小直径太小,多孔阻塞的风险由于更高的细胞可以导致代谢物质的循环被抑制,影响细胞的生存能力(20.]。

两组海绵牛软骨支架具有良好的吸水和机械特性在组织工程20.]。结果表明,软骨细胞被发现在梗塞部位SBCS和DSBCS组。海绵牛软骨支架支持细胞粘附,运输营养物质和残留代谢、增殖和chondrogenic分化的干细胞。

孔互连的证据、高孔隙度、水吸收性能,理想的直径分布在两个支架组的海绵牛软骨支架成为一个有前途的选择。强烈支持的能力,促进hBM-MSCs成软骨细胞的分化,这一研究发现软骨细胞在组织学检查hematoxylin-eosin在第二和第四个星期。

多孔SBCS直径和DSBCS组从34.8到-372.5不等μm和14.7 - -332.7μm,分别。这些尺寸属于可接受的特征孔径来促进良好的细胞粘附和吸水。因此,我们可降解多孔海绵软骨牛脚手架将优化细胞播种和填充。

II型collagen-based支架能够再现天然胶原蛋白形成最佳条件下细胞外基质(21]。Collagen-based支架形式相同的新软骨结构显示能力正常软骨结构。Collagen-based支架具有低免疫原性、多孔结构、良好的生物相容性和生物降解性,但机械阻力最小的缺点。缺乏胶原蛋白支架可以通过结合预期的天然或合成聚合物支架(22]。

Aggrecan有能力结合透明质酸和软骨细胞,稳定Aggrecan固定在细胞外基质形成交联网络的债券。Aggrecan pericellular矩阵的一个组成部分,是维持体内平衡矩阵(23]。一些试图增加天然支架的强度,如胶原蛋白,通过添加aggrecan生产过程中(24]。结果表明,SBCS组有较高含量的比DSBCS aggrecan组。aggrecan和2型胶原的含量高,特别是在SBCS集团,是一个很好的结合的增加支架的机械强度。预计海绵牛软骨支架研究是能够承受正常关节负荷,尤其是膝盖,这样可以最大化作为支架。

Aggrecan有体外chondrogenic属性(25]。因此,海绵牛软骨支架可以触发干细胞分化。它是由我们的研究结果支持hematoxylin-eosin显示在第二个和第四个周后软骨细胞在支架hBM-MSCs播种。

转化生长因子-β水平高得多的比DSBCS SBCS组的组。的平均数量的差异TGF -β具有统计学意义(p < 0.001)。这些数据表明,去细胞过程可以减少TGF -β的水平。TGF -β被广泛应用在间充质干细胞诱导软骨形成,增加细胞外基质生产,引发二型胶原蛋白的表达和aggrecan。10 ng / ml的水平是最常用的诱导软骨形成(26]。接触TGF -β第一周是非常重要的触发软骨形成的间充质干细胞(27]。水平的TGF -β平均130.12±7.73 ng / ml SBCS组预计hBM-MSCs诱导软骨形成的支架没有添加外部生长因子。水平的TGF -β16.39±4.49 ng / ml DSBCS组也能够促进软骨细胞的分化,可以看到通过hematoxylin-eosin染色2和4周。SBCS和DSBCS组包含统计不同级别的TGF -β但双方都能促进hBM-MSCs chondrogenic分化。

我们的海绵牛软骨支架包含细胞外基质组成部分由II型胶原蛋白和aggrecan,和生长因子TGF -β。SBCS组包含更高水平的aggrecan II型胶原蛋白,TGF -β比DSBCS组,表明海绵牛软骨支架可以称为基于ECM(细胞外基质)的支架。尽管作为唤醒功能框架,海绵牛软骨支架可以提供必要的生长因子作为细胞增殖和分化的生化信号不增加外部生长因子。

吸收水分的能力从海绵牛软骨支架被胀大比测量。吸水率,定义为支架的能力来维持水和水渗透,已成为生物医学的一个重要要求支架(28]。这已经被证明是一个重要的因素对体液的吸收和传输氧气,营养物质和代谢产物在封装支架,这样是很有用的。支架吸收水的能力会影响细胞增殖和结构形态在组织再生(29日]。Collagen-based多孔支架显示含水量明显高于合成生物聚合物。水吸收的胶原蛋白支架是10倍原来的重量,可能由于其亲水性自然和支架的多孔结构30.]。

本研究记录肿胀率两组。SBCS组吸收水高于DSBCS组(594.66±5.08%和387.50±2.35%)前15分钟。高吸水在第一分钟,30分钟后开始稳定。这个结果表明SBCS和DSBCS团体都有亲水的特性,对水非常有吸引力。这种亲水自然增加了优势促进营养物质进入支架,从而提供一个更好的机会软骨细胞的生长。

生物降解率应符合组织再生的速度。一个好的脚手架可以生存作为殖民的脚手架,增殖和细胞分化,但必须完全退化的再生过程结束后(31日]。支架生物降解取决于内部内容、亲水特性,吸收水分的能力。我们建议脚手架开始降低时,组织开始再生,最好是当脚手架退化,即使支架质量降低,多孔质量必须维护好。

DSBCS组有更高的平均降解率为16.04±0.13%,而SBCS组在两周内为12.56±0.41%。这个结果反映了生物可降解支架的性质。SBCS组较慢的降解可能因为它包含细胞外基质水平比DSBCS组。

在一项由萨瑟兰et al .,骨髓间充质干细胞培养成脱细胞软骨支架表达chondrogenic标记(32]。然而,在软骨支架没有去细胞,蛋白多糖等保留aggrecan是有益的因为它的导电性能(33]。去细胞是为了减少脚手架的干细胞的感染风险。物理和化学去细胞过程,减少了生化内容但不破坏结构,抑制或减少支架内干细胞分化(34]。这项研究表明,hBM-MSCs分化成软骨细胞在组织学检查证明第二和第四星期SBCS和DSBCS组。

我们意识到我们研究的缺点是使用简单的孔隙度测量方法。我们希望进一步研究将利用一个更细致的方法在孔隙度测量。

5。结论

基于研究结果,可以得出结论,这两个海绵牛软骨支架,与去细胞(DSBCS)或不去细胞(SBCS),完成必要的需求的物理、生化、生物降解性,是一种理想的生物可降解多孔海绵吸水特征牛软骨支架。这些特征诱导和促进细胞增殖和分化的人类骨髓间充质干细胞体外(hBM-MSCs)。然而,仍然需要进一步的研究以便多孔海绵生物降解牛软骨支架准备可以应用临床。对于未来的工作,我们将进行体内实验研究在此基础上研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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