合成和表征Nanohydroxyapatite-Gelatin复合与链霉素对公开可注射骨替代品

文摘

最有效的治疗脊柱结核是通过消除肺结核细菌和替换与移植骨感染骨诱导治疗过程。本研究旨在合成和表征nanohydroxyapatite-gelatin-based注射骨替代(IBS)与链霉素。IBS是合成了混合nanohydroxyapatite和20 w / v %明胶的比例40:6 0,45:55,五五开,比例为55:45,比例,65:35 70:30,25比和链霉素,除了为抗生素的代理。羟丙甲纤维素的混合物添加悬浮剂。红外光谱测试表明,有化学反应发生在混合物,明胶和链霉素。注入能力测试的结果表明,最高注入能力的IBS样本98.64%之间设置时间30分钟和4小时后注射在HA支架,代表了孔隙脚手架骨腔和外套。细胞毒性试验结果表明,肠易激综合症样本无毒对BHK-21成纤维细胞和人类肝细胞细胞由于细胞生存能力超过50%显著差异(p值< 0.05)。的酸度对IBS是稳定和敏感金黄色葡萄球菌显著差异(p值< 0.05)。链霉素释放试验表明,链霉素可以释放IBS-injected骨支架4小时后公布的2.5%。所有提到的结果表明,肠易激综合症是合适的候选人在脊柱结核病的情况下使用。

1。介绍

肺结核是一种传染病,在世界上有很高的死亡率。世界上有超过一百万人死于这种疾病(1]。2016年,世界卫生组织报告说,这种疾病达到一个数量的1040万例,其中34%发生在东南亚。其中一个是印度尼西亚(1,2]。其中5 - 10%发生在骨骼和关节,尤其是在脊柱(3]。治疗这种情况下通常是通过使用公开药物通过静脉和肌肉(4]。最有效的治疗可以执行通过消除肺结核细菌直接和替换与移植骨感染骨或填料诱导治疗过程和脊柱稳定性(3,4]。脊柱手术需要实现这个方法。而不是只使用植骨来填补缺陷,药物也嵌入或插入,以改善其功能(5,6]。

羟基磷灰石是一种材料,可以作为植骨(7]。这种材料生物相容性和生物活性属性有利于恢复骨缺陷由于骨结核病。这种材料的一个缺点是脆性。因此,它被广泛地与其他材料相结合形成复合,尤其是聚合物,获得所需的属性。其中一个是明胶。这种材料已经在全球范围内用于医学领域,尤其是对药物胶囊。这种材料也是生物相容性、生物可降解和无毒。这种材料广泛用作填料由于其易于设置(7,8]。

有几种情况下需要骨的骨缺损填充来填补不规则缺陷的一个解决方案是使用骨填充的形式粘贴或悬挂。这是通常被称为可注射骨替代(IBS)。这种方法可能达到的尖锐缺陷缺陷和设置在该网站之一。通过使用悬浮剂和羟丙基甲基纤维素(HPMC),肠易激综合症可能合成所提到的维斯et al。(2007)和沈et al。(2014)在他们的研究9- - - - - -11]。添加抗生素这样的链霉素可能帮助脊柱结核病例的治疗过程12]。

本研究主要集中在基于hydroxyapatite-gelatin IBS的合成和表征的链霉素对脊柱结核。这是执行的特征红外光谱测试观察样品的官能团,注入能力测试知道的能力从注射器样品挤压,在羟基磷灰石支架和设置时间测试样本的观察能力上设置适当的衬底。生物特征在这个研究包括细胞毒性测试通过使用MTT测定,酸性测试在SBF溶液,知道它的稳定性和抗菌测试通过金黄色葡萄球菌。链霉素版本测试是用于获得释放的链霉素首先确定链霉素的标准曲线显示链霉素浓度之间的相关性和吸收。

2。材料和方法

Nanohydroxyapatite用于本研究获得奔波Tenaga Nuklir阵线(巴坦)雅加达,印度尼西亚,源于鱼鳞。明胶是来自牛的皮肤从150年购买布鲁姆Rousselot(广东,中国)。注射用硫酸链霉素(粉)是来自印尼PT。明治。羟丙甲纤维素(HPMC)从西格玛奥德里奇H7509获得。

描述的材料羟基磷灰石支架从组织银行综合医院Soetomo博士(印度尼西亚泗水)凝结时间试验、氯化钠、NaHCO₃、氯化钾、钾₂HPO₄.3H₂O, MgCl₂.6H₂O,盐酸,CaCl₂.2H₂啊,那₂所以₄丹(霍克₂)₃CNH₂SBF溶液和金黄色葡萄球菌抗菌测试。

使用的工具是冰箱和冷冻干燥器,10毫升注射器,viscotester VT-04F正是由于,酸度计台式OAKTON,扫描电子显微镜(SEM)范检查S50日本,和紫外可见光谱仪。

2.1。合成HA-GEL-Streptomycin注射骨替代(IBS)

可注射骨替代(IBS)被溶解合成20 w / v %明胶(凝胶)去离子水在温度40°C一小时。羟基磷灰石(HA)粉体添加到解决方案数配给的HA和凝胶(40:6 0、45:55 50:50,比例为55:45,比例,65:35,70:30和25)。10 wt %链霉素添加的混合物。同时,HPMC 4% w / v是溶解在蒸馏水在90°C,然后添加到解决方案的明胶,羟磷灰石,链霉素在40°C和搅拌6小时生产白色肠易激综合症。

2.2。样品描述

肠易激综合症的特征在这项研究由傅里叶变换红外(FTIR)测试、注入能力测试,凝结时间试验、细胞毒性试验,酸性测试和抗菌测试。红外光谱测试旨在观察之间没有交互使用的材料在本研究基于官能团。样品与溴化钾制成颗粒。波数范围内的颗粒测试4000 - 400厘米⁻¹。

注入能力测试旨在观察IBS的能力从一个注射器挤压时间范围内。测试使用的方法沈et al。(2014)利用10毫升注射器和针头的内径1.2毫米(11]。IBS注入前后的质量测量。通过使用(1),肠易激综合症的注入能力可以获得。测试重复了五次。 设置时间测试是由使用羟基磷灰石支架,冻干作为衬底。支架质量测量观察IBS的设置后发生的变化。测试是由垂直注入IBS样品支架。肠易激综合症的时候渗透开始直到表面完全干燥。

上面提到的四个最好的基于两个特征样本然后继续生物特征。细胞毒性测试是由使用MTT测定方法采用3 -溴化(4 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2.5 -diphenyl-2h-tetrazolium (MTT)。这种物质会给可行性细胞的信息,它改变了甲瓒盐由于活细胞线粒体的活性。这个测试中使用的细胞从婴儿仓鼠肾成纤维细胞(BHK-21)。甲瓒盐的光密度是衡量使用Elisa读者。细胞的生存能力将计算使用(2)。材料被认为是无毒的,如果细胞生存能力是超过50% (13- - - - - -15]。 这个测试的最佳浓度是再次测试通过使用人类肝细胞细胞进一步评价其细胞毒性。人类肝细胞细胞对有毒物质敏感,用于细胞毒性测试。人类肝细胞细胞在DMEM培养媒体和孵化37°C。然后细胞在显微镜下观察,确保细胞生长。媒介与EDTA清洗并改变胰蛋白酶分离细胞从墙上。这些细胞被孵化4分钟和离心机4分钟120 rpm分离细胞和胰蛋白酶。DMEM的解决方案是添加到混合的细胞和插入到每个。细胞在96 - microwell板的温度孵化24 37°C。DMEM解决方案是改变了一个新的200年μl DMSO小心。然后,测试样本是插入到每个三次重复。样本是培养48 h的温度37°C。48小时后,样本在每个拍摄和MTT的解决方案是添加到每个。板是孵化4 h。然后,中了200μl DMSO溶液添加到每个好。这些细胞被读者阅读用Elisa在560 nm和750 nm(波数16]。细胞的生存能力是由使用(3)。 酸性测试被用来观察IBS的稳定酸性时会见了体液。在该测试中,模拟体液(SBF)使用。SBF包含生理盐水,NaHCO₃、氯化钾、钾₂HPO₄.3H₂O, MgCl₂.6H₂O,盐酸,CaCl₂.2H₂啊,那₂所以₄丹(霍克₂)₃CNH₂。肠易激综合症的酸度测定每12小时7天。

抗菌测试被用来观察IBS的能力,抑制细菌的生长通过观察细菌的抑菌圈直径。金黄色葡萄球菌(SA)是悬浮在9毫升大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)和培养在孵化温度60°C 24小时。营养琼脂是准备作为细菌的培养基。IBS粘贴在井琼脂培养基有四个重复和抑菌圈直径孵化24小时后观察。

链霉素释放试验进行观察IBS的链霉素的释放量。最好的哈:凝胶率在这个测试观察IBS的链霉素释放量。PBS的解决方案是作为媒体的发布。肠易激综合症的解决方案在骨支架注射模拟骨内的条件。IBS-injected脚手架是沉浸在PBS溶液。1毫升PBS溶液然后和评估在紫外可见分光光度计对链霉素的浓度。在此之前,一个标准曲线是由测试在不同浓度链霉素。在这里,4浓度(2%,4%,6%,和8%)被用来确定链霉素的浓度和吸收之间的关系。

数据分析使用统计测试是单向方差分析测试α95%,其平均和标准偏差。

3所示。结果与讨论

3.1。功能组测试

8变种的IBS合成hydroxyapatite-gelatin比率40:6 0,45:55,五五开,比例为55:45,比例,65:35,70:30,25比率。红外光谱测试了几家变化如图1。

结果表明,有几个吸收峰与一些特定的官能团有关。波数的峰值3467.5厘米⁻¹与羟基的伸缩振动在这项研究中,使用的材料哈,凝胶,HPMC和链霉素。2929.47厘米的吸光度在波数⁻¹的伸缩振动C-CH吗₃从HPMC的特定的官能团7]。峰值为1648.49厘米⁻¹显示之间的成键羰基官能团起源于明胶从链霉素和胺组。此外,P-O-C和磷酸盐基团的伸缩振动从哈显示特定的官能团在波数的1041.48厘米⁻¹和601.52厘米⁻¹(17]。没有特定的官能团的变化发生在显示的样品之间没有交互在这项研究中使用的材料。只有物理之间的相互作用的材料哈,凝胶,HPMC和链霉素。

3.2。注入能力测试

注入能力测试是由使用10毫升注射器。这个测试的结果是显示在图2。IBS的八个样本有很好的能力的注入能力结果接近100%。最好的注入能力是通过与HA-gelatin比40:6 0 (w / w) = 98.64%。这个结果是适合沈et al .(2014)的研究,合成基于磷酸钙和alendronate肠易激综合症。他们的结果是96.88%的注入能力3% alendronate [11]。注入能力是最重要的属性之一的IBS的应用程序,因为它应该高注入能力插入IBS的骨头。注入能力是影响溶剂和溶质的样品,样品的粘度,注射器直径。肠易激综合症和注射器在IBS的应用发挥重要作用[18]。

3.3。凝结时间试验

设置时间的测试是由使用冻干HA支架作为人类骨骼的模型。样品的基质有相同的主要成分为天然骨,如成分(羟磷灰石)和结构。这个测试的结果是显示在图3。从这个结果的结果,较低的样品有很大的区别和更高的羟磷灰石的内容。下面的示例与55% HA和凝结时间较长,而样本有60% HA和更高的设置时间短。羟磷灰石的构成更大的混合物,凝结时间越快。基于研究泰国et al .(2010),他们提到的设置时间与磷酸钙IBS样本,硫酸钙,HPMC,柠檬酸是30分钟不到十分钟就20%的柠檬酸和40%的柠檬酸(19]。IBS的设置时间不到10分钟可以应用缺陷的小骨头,比如腕骨,而另一个可以用于更大的骨头,如锁骨骨及其周围。

后结果如图3,变化越快测试质量的变化是由于肠易激综合症的出现在HA支架。结果是图所示4。这种变化是由于支架合成的HA冻干方法产生毛孔,允许IBS通过毛孔渗透。

脚手架之前和之后的质量的变化分析了IBS的存在使用扫描电子显微镜(SEM),如图5。从扫描电镜结果,它描述了HA支架表面被IBS覆盖均匀。注射前的孔隙大小显示值的分布在780.8 - -835.4的范围μm和支架注射后IBS的225.2μm。它可能会得出结论,肠易激综合症可以均匀的毛孔脚手架和绑定羟磷灰石(2,11]。因此,肠易激综合症可以应用骨替代填补受感染的骨段和容易受到进一步引发新骨细胞的生长。

3.4。酸性测试

样品的酸度是评价的一个重要点肠易激综合症的表现。结果在图6表明样品的平均pH值HA-GEL 25的比例,70:30,65:35,比例(w / w)是7.62,7.54,7.41,和7个,分别为35。所需的IBS pH值超过6组的骨头。这个结果还是可以忍受的,身体仍然可以被容忍的,想给没有痛苦效应(7,20.]。酸度也可以确定以来IBS IBS的设置过程应设置在人体正常博士,肠易激综合症应设定在pH值约为7.4。HA的示例:凝胶65:35比是最合适的一个与小振荡加班pH值为7.4。

3.5。细胞毒性测试

细胞毒性测试是由使用婴儿仓鼠肾成纤维细胞(BHK-21)。MTT酶会改变与紫罗兰颜色,如果甲瓒盐对活细胞的线粒体。通过测量这个紫颜色的强度,我们可以获得细胞的可行性。从这个测试结果描述,IBS样本无毒,因为细胞生存能力是50%以上图所示7。除此之外,这个结果还显示超过100%的比例(7,13- - - - - -15]。这个结果意味着样本可以促进细胞的增殖。它表明,肠易激综合症可能是成骨细胞细胞生长的地方(7,14]。这个结果是显著不同的假定值= 0.01857 (p值< 0.05)。

执行的其他细胞毒性测试也强调样本对人类细胞的影响。人类肝细胞细胞被用于这个测试。样品的最佳浓度基于其他表征的结果与哈:这是示例使用凝胶65:35的比例。这个测试的结果表明,细胞的可行性,样本93.69%的链霉素100毫克/毫升等于10%。这一结果表明,样本是无毒的,即使这是测试通过使用人类肝细胞细胞(16]。人类肝细胞细胞在这个测试是成功的强调使用BHK-21成纤维细胞的细胞毒性测试。这个示例使用的进一步研究人类成骨细胞细胞需要观察成骨细胞细胞的行为时,肠易激综合症。

3.6。抗菌测试

抗菌测试结果如图8。测试样本与肠易激综合症的一部分发布纸应用于骨支架。在图8 (b)周围,抑制带样品和白点是细菌菌落。周围有抑菌圈直径的样本进一步毫米从初始直径9毫米。基于Balouiri et al。(2016),细菌耐药性的水平从材料可以评估通过比较明确的区或抑菌圈直径与初始样本直径(21]。基于这一结果,所有的样本显示,他们敏感金黄色葡萄球菌细菌抑菌圈超过20毫米的显著差异,p值= 0.00423 (p值< 0.05)。存在链霉素在混合物中的抗菌活性的主要原因。脊柱结核引起的结核分枝杆菌。这些细菌革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌,因为他们都没有这两种类型的特点。链霉素可以杀死这些细菌蛋白质合成的抑制核糖体的分枝杆菌(22]。这个过程也发生了金黄色葡萄球菌。

3.7。链霉素发布测试

链霉素释放试验进行观察链霉素释放的量应用于骨支架的IBS加班。链霉素在几个浓度的第一次测试是通过使用紫外可见分光光度计确定链霉素和吸收之间的关系。结果是图所示9。

链霉素的吸光度是特定的波长270 nm表示每个浓度的峰值。这些山峰被送往决定的吸光度标准曲线和链霉素的浓度和吸光度之间的关系。这两个参数的相关性描述在一个线性曲线与方程(4)x与y吸光度和浓度(23]。链霉素标准曲线出现在图中10。 因此,浓度方程获得和显示(5) 标准曲线是用来确定发布的浓度链霉素IBS-injected骨支架。结果是图所示11。发布概要文件的链霉素非常线性,在4小时,链霉素释放的数量几乎是2.5%23]。初始浓度为10%。细胞毒性试验的结果表明,10%的浓度仍然能给高细胞生存能力(14]。脊柱结核的情况下,结核分枝杆菌可能被链霉素。通过这个测试的结果,链霉素周边可以释放所需的浓度。

4所示。结论

基于hydroxyapatite-gelatin-streptomycin IBS合成。红外光谱测试结果显示,有一个键链霉素和明胶。注入能力测试表明,所有的样品高注入能力注入能力最高的98.64%,从凝结时间测试,样品羟磷灰石的内容有一个较高的速度设定时间(一个小时,少)时注射羟磷灰石脚手架。细胞毒性试验表明,样本是无毒的细胞生存能力超过50% BHK-21成纤维细胞和人类肝细胞细胞。所有样品的酸度稳定在7.5。抗菌试验表明,所有的样品都敏感金黄色葡萄球菌与抑菌圈超过20毫米。4小时后公布了链霉素为2.5%。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢意大利Airlangga资助的研究(研究批准号1925 / UN3.1.8 LT / 2018)。

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