基于电纺聚乳酸微纤维的组织工程小直径血管移植

摘要

采用静电纺丝法制备了直径1.1 mm的聚l -丙交酯微纤维管状血管移植物。x射线衍射和扫描电镜数据表明，该样品处理 在圆柱形心轴上的固定状态下为1小时，具有致密的纤维结构;它们的结晶度约为44％。这些样品的强度和变形稳定性高于天然血管的稳定性;因此，可以在组织工程中使用它们作为生物可吸收的血管移植物。将植入到大鼠腹主动脉中的实验表明，所获得的血管移植物不会引起大鼠的病理反应;在四周内，移植物的内侧变得完全覆盖着内皮细胞，并且成纤维细胞在整个墙壁上延长。暴露12周后，普拉拉纤维的吸收开始，并在64周内完成该过程。被胶原和成纤维细胞替代过吸收的合成纤维。那时，形成血管;其内部和Neoadventitia靠近结构和组成的天然血管的那些。

1.介绍

在现代血管外科中，小直径血管移植的发展问题仍然存在。直径小于5mm的人造假体通畅率低，首先与吻合部位内膜增生和假体内侧内皮层缺失有关[1- - - - - -4]．自体静脉材料使用的问题在于数量有限，植入后自体静脉壁病变的可能性大[5，6]．至于儿童血管手术，由于非吸收性人工合成假体不能与儿童机体一起生长发育，因此有必要重复血管重建手术[7]．任何用传统方法制造小直径血管移植物的尝试都是不成功的，因为移植物内部在短时间内会产生血栓[8因为这些移植物的血流率低。目前，有几种人工血管开发技术，其中一些正在进行临床试验。主要方法有:通过组织工程逐层获取组织工程血管移植物(TEVG) [9- - - - - -14];用肉芽组织制造人造血管[15- - - - - -18];使用脱细胞移植[19- - - - - -21];基于管状生物吸收聚合物移植物获得人工血管[22- - - - - -27]．

利用现代组织工程方法获得的人工血管，利用生物相容性和生物可吸收聚合物制成的移植物，可以解决植入早期血栓形成的问题。这种人工血管应模仿天然血管的结构和功能，并对受体生物的神经体液作用敏感。该方法是在生物反应器中在生物可吸收的移植物上培养细胞，模拟生物和机械因素提供细胞的增殖和分化。预计该TEVG植入受体生物后，聚合物结构的生物降解将伴随着新的血管壁的形成[28]．另一种开发人工血管的方法包括将聚合物移植物植入活体，周围组织的细胞迁移到移植物上并填充形成TEVG。因此，功能组织形成并与此过程平行;聚合物接枝的再吸收是在活性生物介质作用下发生的。当吸收完成时，应在移植物处形成新的血管。新型人工血管应符合以下要求:(1)生物相容性和抗感染;(2)密封和抗血栓形成(因此，人工血管内表面应覆盖内皮细胞);(3)具有能够进行外科操作的机械特性，并能承受长时间的水动力负荷;(4)具有血管活性的生理特性(包括对神经或化学刺激产生痉挛或扩张反应的能力)。此外，必须有可能生产出足够数量的各种特征的血管移植物，以解决任何临床问题[29]．最近，有一些出版物描述了试图忽略移植物细胞培养阶段的尝试在体外因此，为了简化这项技术并将其近似用于临床试验[30.]．

静电纺丝是制备聚合物血管移植物的一种有前途的方法。该方法可以获得基于纳米和微纤维的材料，具有高孔隙率和比表面积(后者的特征是移植体积内细胞迁移和增殖所必需的)，同时保持与血液的紧密性[31- - - - - -33]．静电纺丝获得的血管移植物具有必要的力学特性。它们能够迅速融入活的有机体，它们的内表面覆盖着内皮细胞，这大大降低了血栓形成的风险[34，35]．

本工作的目的是开发一种基于聚l -丙交酯(PLLA)微纤维的小直径血管移植物的方法，研究其结构、强度和变形性能，在活的有机体内研究获得的移植物生物组织形成，分析生物吸收机制。

2.材料和方法

2．1．材料

研究对象是由聚乳酸制备的基于微纤维的管状移植物Purasorb PL-10(Corbion Purac,荷兰)。氯仿(Sigma-Aldrich，美国)作为溶剂。所有材料均为purissimus级。

2．2．静电纺丝加工纳米纤维的研究

用实验室规模的Nanon-01A仪器(日本)从氯仿中的PLLA溶液中静电纺丝制备了微纤维。PLLA溶液，浓度为15瓦特。%在电场中泵送通过模具( kV);电极间距离为0.15 m;纤维沉积在圆柱形电极上。圆柱形电极(直径1.1 mm)转速为1500转/分。内径1.1 mm，壁厚320的管状样品μ.m生产。

２．３．力学性能研究

在单轴拉伸模式下，以10mm /min的速率，用英国Instron 5943装置研究了接枝的力学性能。基于直径为1.1 mm、直径为850的PLLA，测定管状试样的杨氏模量、拉伸强度和拉伸变形μ.壁厚分别为370、320和250μ.M以及大鼠原生主动脉的样本。所有测试样品的测试段长度均为20 mm。

２.４.接触角测量

在DSA 30仪器(KRUSS，德国)的帮助下，测量了PLLA薄膜表面和PLLA微纤维管状样品内部的润湿角。

2.5。样品结构调查

采用扫描电子显微镜Supra 55 VP (Carl Zeiss, Germany)研究了PLLA微纤维管状样品的结构。样品表面以前是用铂溅射的。通过显微照片分析，测量管状试样的壁厚、纤维直径和孔隙尺寸(纤维间空间)。

平均孔径和纤维直径是通过管状样品的SEM显微图像分析(Scandium，©OLYMPUS Soft Imaging Solutions)确定的。为此，我们捕获了垂直于孔隙方向的几个区域的SEM图像。在同一样品的不同位置至少分析了20个孔隙。

采用x射线衍射(WAXD, Bruker D8 DISCOVER, Germany)研究了接枝的精细结构。

用DSC 204 F1 Phoenix仪器(德国NETZSCH)在氩气气氛下，用差示扫描量热法(DSC)测定了PLLA的玻璃化转变温度、熔点和结晶温度。

2.6。植入技术

单基因系雌性大鼠(体重350 g)吸入麻醉(1.5%异氟醚，诱导麻醉，3%异氟醚)。y形剖腹手术后，动员肾下主动脉，结扎腰动脉，夹取右肾动脉。肾下主动脉置换为内径1.1 mm，长度5 mm的结晶PLLA移植物。使用手术显微镜、特殊工具和非创伤针(Prolene 9-0)。大鼠腹主动脉平均直径为1.0 mm。未使用抗凝剂。对42只雌性白化Wistar大鼠进行手术干预。动物们可以免费获得水和标准饮食，其中包括PC-120-1全饲料。分别于术后1、4、12、24、48、56、64周进行评估。这些结论是通过对6只动物的实验得出的。

身体下半部分的缺血时间，后肢，右肾和右肾约为50分钟。在所有试验中，通过吻合术的出血并不重要。经典技术立即评估了通畅，手术后30分钟评估[36]．逐层缝合腹壁。这些动物被关在一个单独的笼子里，可以自由获得食物和水。术后观察动物后肢皮肤的颜色、温度及活动度。

根据卫生部第1179号命令(10.10.1983)对所有动物进行了适当治疗;卫生部第267号命令(2003年6月19日);《使用实验动物规则》;《欧洲公约》的原则(斯特拉斯堡，1986年);《世界医学协会关于人道对待动物的赫尔辛基宣言》(1996年)。

2.7。血管造影研究

采用Philips Allura Xper FD 20装置(荷兰)对大鼠腹主动脉假体上方区域进行开放穿刺后的血管造影研究。使用对比剂Omnipaque (300 mg/mL)。

2.8。显微镜检查

为了进行组织学检查，将假体和天然血管周围部分固定在10%中性福尔马林磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中24小时。用异丙醇或石油的特殊组织学技术将材料包埋在石蜡块中。石蜡切片厚度为5μ.M细胞切片，苏木精、伊红染色。使用Mallory和Weigert-Van Gieson方法(Mallory三色法和Weigert-Van Gieson, Bio-Optica, Italy)可视化结缔组织和弹性纤维。

为了识别内皮细胞，采用免疫组化方法，并评估PECAM-1/CD31蛋白的免疫反应性。在标准的脱蜡和复水程序后，抗原在pH 6.0的缓冲液(Diagnostic BioSystems, USA)中热涂60分钟。室温孵育30分钟。在第一阶段，使用PECAM-1/CD31 (Santa Cruz Biotechnology, USA)多克隆山羊抗体孵育切片。抗体在阻断液上以1:10 0稀释(美国诊断生物系统公司)。为了揭示抗原-抗体复合物，使用了一套超敏聚合物- hrp IHC检测系统(BioGenex, USA)的试剂。另外用Gill 's苏木精染色(Bio-Optica，意大利)。

使用徕卡DM750光学显微镜和ICC50相机(徕卡，德国)拍摄照片。组织切片用n10目镜、n4、10、40透镜在显微镜下观察。使用“Videotest”系统进行形态学分析;使用放大率×10的目镜和镜头n40。

3.结果与讨论

从SEM数据可以看出，PLLA溶液静电纺丝得到的接枝纤维为1.5 ~ 4条μ.米直径。

移植物内径1.1 mm;壁厚为320μ.m.微纤维没有择优取向，它们之间的孔隙平均大小为几十到几百微米(图)1(一)和1 (b)）.X射线结构分析数据表明微纤维具有非晶结构。

这些标本植入大鼠腹主动脉后，假体变形，吻合带缝线接触时影响壁的完整性。此外，导管内侧部分纤维在手术操作中发生变形;血管腔变小，引起术后早期血栓形成。这些假体的植入是困难和低效的。

众所周知，聚乳酸是一种可结晶的聚合物。DSC检测表明，PLLA在接近其玻璃化转变温度(53-59℃)的温度下能够在接枝体内部形成结晶相。在这方面，在体温和生物介质的作用下，聚合物有自发结晶的风险。结晶过程中，微纤维收缩，接枝直径相应减小;这些过程也会增加血栓形成的风险。

为了提高PLLA移植物的力学性能和在生物介质中的稳定性，采用游离和固定两种状态对PLLA移植物进行热处理 1小时。DSC和x射线衍射数据表明，在高于玻璃化转变点的温度下进行热处理后，聚合物发生了部分结晶;处理后的PLLA样品结晶度约为44%。

以游离状态处理的移植物为例(见图)1 (c)和1 (d))，壁厚从320增加μ.M(非晶样品)至370μ.M，内径从1.1 mm减小到0.85 mm;移植物壁结构疏松，呈纤维状。

在直径1.1 mm的圆柱形芯棒上对非晶态试样进行固定状态的热处理，使接枝壁厚降至250μ.(数据1 (e)和1 (f))而不减小内径;形成了更致密的纤维结构。

热处理后的移植物的力学特性明显优于初始非晶态样品，并超过了原生容器的相应值(见表)1）.

用于组织工程的生物材料的一个重要特征是其对水和其他生物液体介质的润湿性。一方面，这些材料的高疏水性阻止了细胞在其表面的粘附，从而影响组织的形成。另一方面，高亲水性以及因此导致的溶胀和接枝与液体环境分子之间的强相互作用可导致血栓的形成[37]．本研究表明，PLLA薄膜在热处理1 h后的润湿接触角为80°。这个值是典型的疏水性较低的材料。而PLLA微纤维接枝体的内表面接触角为120°。这个值是高疏水性材料的特点，是由于表面凸出而达到的。它有望降低移植物血流中血栓形成的风险。但并不能阻止移植物表面细胞的进一步粘附和内皮化。在固定结晶状态下观察到最稳定的疏水性值。此外，与天然血管相比，生物可吸收血管移植物的初始力学特性增加了一些优势，因为生物可吸收过程可能不均匀，也不总是定性的。因此，有一定的安全边际是十分必要的。 The best mechanical characteristics were obtained on samples crystallized in a fixed state (Table1）.

在上述力学特性、疏水性参数、内径稳定性、壁厚均匀性数据的基础上，选择固定状态下经过热处理的长度为5mm的移植物进行体内实验(图)2）.

大鼠腹主动脉植入术后1周内，所有移植物均可通行;主动脉与移植物粘附;拆除缝线未造成吻合破坏;对周围组织无病理影响。形态学分析显示，从远端和近端吻合口开始，移植物内侧形成内皮层;中央部分覆盖着不均匀的纤维蛋白网状层。PLLA纤维间以外膜侧为主，可见成纤维细胞核;薄的胶原纤维开始出现。巨大的异物多核细胞位于移植物的外侧。这些细胞的存在是机体对异物的典型反应，因为它们积极参与了异物的破坏。 However, in this case the cell sizes do not allow them to penetrate through the pores into the interior of the graft. In four weeks, all grafts remained passable; they were covered with connective tissue on the outside and adhered to connective tissue (Figure3.）.

组织学研究显示移植物被内皮完全覆盖。在移植物的整个长度上形成内皮下层，其中包含了胶原纤维的薄网状结构。吻合区形成最厚的内膜(55μ.M)，其厚度向移植物中心方向逐渐减小(降至10μ.m)。新生内膜未见增生。整个宽度的移植物充满成纤维细胞，并用薄的胶原纤维刺穿。从外膜一侧看，胶原纤维较厚，移植物外侧被结缔组织形成的包膜包围(图)4）.

未发现有机体对移植物产生免疫反应。聚合物的生物吸收也没有观察到;保留了微纤维的结构。

6个移植物中有2个在12周内形成血栓。移植物保持了原来的形状和结构。发现生物吸收开始的迹象;纤维的横截面显示出低孔隙率。

形态学研究表明，含有胶原纤维的内皮和含胶质纤维完全覆盖移植物，形成新纤维。在移植物的厚度内，位于PLLA纤维，成纤维细胞和新形成的胶原纤维之间。可以从外膜侧看到许多异物的巨大多核细胞。

植入24周后，所有移植物均可通过，微纤维上可见大量交叉裂缝，部分纤维碎裂(图)5(一个)）.微纤维的横截面显示出明显的孔隙度(图)5 (b))，表明有活性的生物吸收。

24周后进行的移植物的组织学分析(与术后早期的数据相似)显示内皮和内皮下完全形成，由松散的胶原纤维组成。在一个移植物中，内皮层下可见完全形成的多血管。移植物完全被成纤维细胞占据，胶原纤维穿透。在移植物的整个体积上，有许多直径在1.750到7.320之间的圆形空洞μ.在PLLA微纤维间观察到充满弱亲氧内容物。这些空洞位置混乱，没有被胶囊包围;它们破坏了新形成的血管壁的结构，降低了它的机械性能。也许空洞的出现与聚合物纤维的再吸收有关[38]．在这方面，为了排除血管壁破坏的风险和出现危及生命的出血，必须进一步可靠地加强血管壁。在移植物的外部，发现含有巨大的异物多核细胞的结缔组织囊。

48周后，6个移植体中有一个无法通过，并且有一个血栓贯穿整个假体。在可通过的移植物中，微纤维强烈破碎并部分被吸收。

形态学研究显示，内皮下层广泛，由密集的胶原纤维和单个弹性纤维组成。在内皮下层，钙盐沉积。Neomedia由随机排列的厚胶原纤维束组成。可见PLLA纤维碎块，中间以成纤维细胞为主。在整个移植物体积上观察到圆形空洞，含弱亲氧内容物;他们的面积从6.590美元不等μ.米²到11.500μ.米²．外膜由疏松的纤维结缔组织组成，其中包含血管和巨大的异物多核细胞。

56周后，本组所有移植物均可通行;在一个样本中，整个移植物的内膜均匀增生;它的直径减少了50%。在2例移植物中观察到不明显的动脉瘤。

根据血管造影的结果，移植物是可通过的，并进行脉搏波没有困难;假肢的界限几乎无法分辨;没有狭窄或扩张的迹象(图6）.

发现聚乳酸纤维的再吸收仍在继续;可见微纤维碎片的纵向尺寸从1到10不等μ.(数据7(一)和7 (b)）.

研究样本的组织学切片与之前获得的相似。在整个移植物中可见由胶原和弹性纤维组成的内皮和内皮下膜。然而，不同部位的内膜厚度并不相同。Neomedia由无序的胶原纤维束、成纤维细胞和PLLA纤维碎片组成。微纤维间新形成的空洞面积为3.360μ.米²到7.040μ.米²．异物中的血管和巨型多核细胞在沿着移植物的整个表面组成的外壳组织组成。

64周后，所有的移植物都保持了可通过性，并且完全由新形成的组织组成，壁宽从100到160不等μ.(数据7 (c)和7 (d)）.所有新形成的血管显示不同程度的动脉瘤(图)8）.动脉瘤的存在产生血栓形成，血栓栓塞和动脉瘤破裂的风险。这些并发症可能会威胁到患者的生命，需要紧急治疗[38，39]．

新生内膜由内皮层和内皮下层组成，内皮下层包括胶原和弹性纤维。nemedia主要由成纤维细胞组成。胶原纤维形成紊乱的束。未发现PLLA纤维碎片。新形成的新介质中孔洞面积从2.690开始μ.米²到21.700μ.米²（数字7 (e)和7 (f)）.新外膜由疏松的纤维结缔组织和血管组成。新外膜可见巨大的异物多核细胞。

4.结论

利用静电纺丝技术对PLLA微纤维血管移植物进行了研究，结果表明:部分结晶微纤维血管移植物具有较好的力学性能;该结构是对初始管状试样在固定状态下进行热处理后得到的。

移植到大鼠腹主动脉的移植物未引起大鼠的病理反应;4周后，内膜完全覆盖，成纤维细胞占据整个壁。这些事实表明，移植体与大鼠机体的融合良好。术后早期内皮层的存在促进了移植物抗血栓形成的高稳定性。

种植后12周观察微纤维生物吸收的初步迹象;生物吸收持续到第56周，没有引起明显的病理反应。吸收纤维被胶原纤维和成纤维细胞所取代。值得注意的是，聚合物移植物的再吸收速率不超过其内部细胞和组织的生长速率。

植入后64周内血管形成;这些血管的内膜和外膜几乎与天然血管相似。需要注意的是，新介质由无序的胶原纤维束、成纤维细胞和亲氧腔组成。这个部分完成的结构的形成导致血管的机械特性和动脉瘤的外观的减少;同时，移植物的总通透性非常高(93%)。

从所得的结果可以得出结论，静电纺丝产生的PLLA移植物在临床应用上是有前途的，尽管一些加强新形成血管壁的方法还有待开发。

伦理批准

有关实验室动物护理和使用的所有机构和国家准则都得到了适当机构委员会的遵守和批准。本文作者没有进行人体研究。

利益冲突

作者声明，在本手稿中讨论的材料与任何组织都没有利益冲突。

致谢

作者非常感谢俄罗斯科学基金会的财政支持(批准号:no。14-33-00003)。

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